Este estudio ha sido financiado por el Centro de Edmond Safra y Lily para las Ciencias del Cerebro (SB comunión), The Heritage Biomédica Programa de Asociación de Ciencia legado de la Israel Science Foundation (Grant N º 378/11, a HS) y la Fundación Alemana para la Ciencia de Israel Investigación y Desarrollo (GIF) (Grant No. 1093-32.2/2010, a HS).

1. Preparación Lentivirus <ol><li> Se cultivan las células HEK-293FT a 90% de confluencia. </li><li> En el día de la transfección medio celular cambio de DMEM libre de suero suplementado con 1 mM de glutamina y 50 mg / ml de penicilina-estreptomicina. </li><li> Co-transfectar las células con un vector pLKO.1-Puro y con plásmidos que codifican para la delta R8.2 y VSV-G restos y los genes miARN de interés, utilizando 10 l de 1 mg / ml de polietilenimina como un portador 9. </li><li> Recoger lentivirus envasados ​​a las 24 horas y 48 horas después de la transfección, filtrar con filtro de 0,45 micras. </li><li> Concentrar los lentivirus utilizando ultracentrifugación en 70.000 xg, durante 2 horas y 15 ° C, alícuota y almacenar a -70 ° C. </li><li> Medida título del virus mediante la infección de células HEK-293T con preparaciones de virus diluidas en serie (1 a 10 -6 ml de vector por pocillo). El título resultante (se recomienda un mínimo de ~ 1 × 10 9 partículas infecciosas por ml) se evalúa para la expresión de la GEne de interés, utilizando puromycin selección y cuantificación de las buenas prácticas agrarias expresión de los virus a través de recuento de células fluorescentes. </li></ol> Para el protocolo más detallado de preparación lentivirus ver 10. 2. Preparación de los animales para la cirugía <ol><li> Cirujanos atuendo debe incluir bata quirúrgica, guantes estériles, gorro y mascarilla. </li><li> Pesar el animal, a continuación, anestesiar con una IP-inyección de una mezcla de ketamina, con el volumen proporcional al peso de los animales como se especifica para cada fármaco. Para una mezcla de ketamina / xilazina, un intervalo de dosis de 80-200 mg / kg de ketamina y 7-20 mg / kg de xilazina se utiliza por lo general para los ratones. </li><li> Espere hasta que el animal esté totalmente anestesiado, a continuación, comprobar si la falta de reflejo de retirada de la pata trasera del animal mediante la ampliación de la extremidad y pulsando con el dedo. </li><li> Inyectar el animal por vía subcutánea con Rimadyl, tal como se especifica en la caja, para aliviar el dolor. Rango de dosis típica para Rymadil es 5-10 mg. </li><li> Colocar el animal sobre una almohadilla térmica para mantener una temperatura corporal constante y humedecer los ojos con el ungüento. </li><li> Afeitar el área entre los dos oídos con una máquina de recorte. </li><li> Desinfecte la piel con betadine. </li></ol> 3. La exposición de la calavera y perforación <ol><li> Colocar el animal en el interior del stereotact mediante el ajuste de las varillas en las grietas justo por delante de las orejas del animal. </li><li> Utilice un bisturí para realizar una incisión anterior-posterior de unos 1,5 cm entre las orejas y mantenerla abierta con pinzas de cirugía (serfines). </li><li> Limpie la superficie del cráneo con un bastoncillo de algodón hasta la intersección de la sutura coronal y las suturas sagital, es decir, el bregma y la intersección entre las suturas coronal y lambdoid, es decir, lambda, son visibles. </li><li> Dirija la punta de la jeringa, que se celebró por la stereotact, hasta el punto de bregma, en los tres ejes. Anote las coordenadas. Este punto podría ser considerado como el po ceroint en los tres ejes. </li><li> Levantar la jeringa en el eje vertical, de manera que un movimiento planar no rayar el cráneo y mover el cabezal de la jeringa a la ubicación correcta. Inyecciones CA1 del hipocampo requieren las siguientes coordenadas en relación con el bregma en mm: -2 en el eje anterior / posterior, ± 1.8 en el eje lateral / medial y -1,5 en el eje dorsal / ventral. </li><li> Baje la punta de la jeringa hasta que toque el cráneo y marcar el lugar con un marcador. Retire la jeringa hacia atrás para evitar puñaladas. </li><li> Perforar un agujero poco profundo, sólo en el hueso del cráneo con una multa perforador. Sostenga el perforador constante para que no se siga perforar en la parte de abajo de tejidos blandos. Usted puede evitar esto se estabiliza por un lado con el otro y por la perforación en pulsos cortos. </li></ol> 4. La inyección de la Lentivirus <ol><li> Retirar 0,5 ml de la solución concentrada de lentivirus. </li><li> Coloque la jeringa encima del agujero y baje lentamente en forma vertical hasta que ReaChes la superficie del cráneo. Continuar para bajar la jeringa en el cerebro muy lentamente. En este paso algo de sangrado puede ocurrir que no indica necesariamente una penetración fallado. Si se produce una hemorragia fregar con una esponja de algodón. </li><li> Establecer la bomba digital para 0,02 ml / min (0,5 l se inyecta en 25 min) y comenzar la infusión. Infusión lenta permite la propagación efectiva del virus en el tejido y evita el flujo de retorno. En algunos tipos de jeringas en cuenta la inserción de la jeringa para una mayor profundidad de 0,5 mm antes de retirarse a las coordenadas y la infusión de originales. </li><li> Una vez finalizada la infusión esperar otros 5 minutos para permitir que el material que se extienda en el cerebro en lugar de retirarse de nuevo en el canal formado por la jeringa. </li><li> Retire la jeringa muy lentamente y observar los flujos de espalda. Si se observa un flujo hacia atrás en este paso, una fracción del material inyectado fue probablemente perdió. </li></ol> 5. Cierre de heridas y la recuperación <ol><li> Seal ªe enrollado con histoacryl. Asegúrese de evitar fugas del histoacryl en los ojos. </li><li> Inyectar la vía intraperitoneal animales (IP) con 1 ml de solución salina precalentada, para evitar la deshidratación. </li><li> Colocar el animal en una jaula de recuperación que se coloca sobre una almohadilla caliente. Ver el animal mientras se recupera durante una hora adicional. </li></ol> En caso de pérdida de peso, inapetencia, se debe realizar debilidad / incapacidad para obtener alimentos o agua, estado moribundo o infección, la eutanasia del animal. Los métodos aceptables para la eutanasia de roedores son los barbitúricos, anestésicos inhalados, CO 2, CO, o cloruro de potasio en combinación con la anestesia general. Después de 4 a 6 semanas, evaluar la memoria de navegación del animal se evalúa en el laberinto de agua de Morris. Los lentivirus se suele infectar a la mayoría de las células dentro de la esfera de la inyección. 6. Evaluación del Comportamiento en el laberinto de agua de Morris <ol><li> Capacitar a los animales en el Mlirio laberinto de agua. Para el entrenamiento exacto y el protocolo de pruebas de ver 11. Después de cada ensayo, el animal secar con una toalla seca, reemplazarlo en su jaula y refrescar el agua en el tanque. </li><li> Prueba de los animales en el laberinto de agua de Morris durante 3 días consecutivos, 4 ensayos cada día. Cada día insertar el animal en el laberinto en cada una de las 4 direcciones del laberinto (norte, sur, este y oeste) en un orden cambiante, por ejemplo, el primer día: este-oeste-norte-sur, de dos días: al oeste y el sur -noreste. Limpie los animales después de cada ensayo. </li><li> Durante la prueba de los ensayos realizar el seguimiento del animal con un sistema de seguimiento, tales como el sistema de seguimiento Noldus. </li><li> Después de la prueba de ensayo 12 ª, insertar el animal en el tanque de agua sin la plataforma durante un minuto. Esto se usaría para analizar la estrategia de buscar el animal está tomando. </li><li> Analizar los datos como se sugiere en 12. </li></ol>

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	<li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis.">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li><li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway.">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li><li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions.">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors:+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice.">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li><li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system.">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li><li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A/B+in+Alzheimer's+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice.">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety:+the+case+of+amygdalar+miR-34.">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li><li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target.">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure &amp; Function. , 10-1007 (2012).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+&amp;+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles.">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs &amp; transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+Water+Maze+Experiment.">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).</li><li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).</li><li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery.">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Inyección estereotáctica de un lentivirus es relativamente un método rápido para la evaluación in vivo, tanto para la altura o baja regulación de genes diferentes y miRNAs. La principal alternativa es un ratón genéticamente modificado que es una técnica consume mucho más laborioso y a continuación, inyección directa lentivirus. Además, la regulación hacia arriba, en la inyección de lentivirus, se produce en un momento específico en el ratón adulto y no incluye la posibilidad de permeab...

El papel de los miRNAs específicos en el funcionamiento del sistema nervioso ha sido recientemente cuestionado por inyección lentiviral en varios estudios. MiRNAs se han encontrado para ser crucial para el mantenimiento y la re-formación de la estructura sinapsis 1, 2 sinaptogénesis y la remodelación de sinapsis y mantenimiento 3. Estos estudios sugieren fuertemente que los miRNAs están comprometidos, a través de efectos reguladores múltiples niveles, tanto en la conformación y en el mantenimiento de la salida principal del sistema nervioso, la función cognitiva. Inyección estereotáctica de las partículas de lentivirus en regiones específicas en el cerebro de roedores permite la búsqueda de alteraciones en la morfología de la sinapsis y la actividad neuronal, y se utilizó para establecer el significado funcional de las transcripciones sobreexpresados ​​4,5. La infección directa de las neuronas en áreas del cerebro bien definidos con miARN-expresión de los lentivirus pueden estar implicados en estudios de envejecimiento, trastornos cerebrales y la neurodegeneración; Estudios de miRNAs en el ámbito de la regulación del comportamiento 6-8 están en un estado mucho menos avanzada, y la inyección estereotáctica de los genes miARN-expresando partículas de lentivirus seguido por pruebas de comportamiento puede ser útil para tales fines. Un método mucho más laborioso para inducir la sobre o sub-expresión implica ingeniería genética knock-in o ratones knockout. Sistemas genéticos pueden permitir para un control condicional y temporal en la expresión (por ejemplo, Cre-Lox, los sistemas Tet), pero éstos apenas ofrecer la especificidad espacial del procedimiento de inyección y casi siempre hay una cierta cantidad de falta de estanqueidad. Además, los procedimientos de ingeniería no requieren cirugía y se pueden utilizar a través de laboratorios con relativamente buena reproducibilidad, sin embargo, son más lentos y requieren mucha más mano de obra y de recursos financieros. Además, el control temporal de la sobre o sub-expresión en ratones inyectados es mucho más preciso en comparación con ratones modificados genéticamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rodent weigh scale</td>
			<td>Burtons (UK)</td>
			<td>115-455</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24">heating pad</td>
			<td>FIRstTechnology</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">trimming machine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">stereotact</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Scalpel and blades</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>INS500348</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Harland syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">driller</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">digital pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>704507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Water tank and platform</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">ketamine </td>
			<td>Vetoquinol(Lure France)</td>
			<td>3055503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">domitor</td>
			<td>Orion pharma</td>
			<td>107140-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rimadyl</td>
			<td>Pfizer animal health</td>
			<td>24751</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="138" rowspan="2">moisture ointment - Synthomycine 5%</td>
			<td rowspan="2">Rekah Pharmaceutical</td>
			<td rowspan="2">195</td>
			<td rowspan="2"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>112101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome

Los microARN (miRNA) son pequeñas moléculas de ARN de cadena simple reguladoras unos 22 nucleótidos de longitud que pueden cada destino numerosas transcripciones de ARNm y dim toda una expresión de los genes de la vía de la destrucción de inducir y / o inhibición de la traducción de estos objetivos. Varios miRNAs juegan un papel clave en el mantenimiento de la estructura y la función neuronal y en las funciones cerebrales de alto nivel, y se buscan métodos para manipular los niveles para explorar estas funciones. A continuación, presentamos un método directo en vivo para el examen de las consecuencias cognitivas de miRNAs forzadas exceso en ratones mediante la inyección estereotáxica de partículas virales miRNA-codificación. Específicamente, el protocolo actual consiste en la inyección en la región CA1 del hipocampo, lo que contribuye a la consolidación de mamífero memoria, el aprendizaje, y las respuestas al estrés, y ofrece un lugar de la inyección conveniente. Las coordenadas se miden de acuerdo con el bregma ratón y virus de la perfusión se controla y se mantiene muy lento digitalmente.Después de la inyección, la herida de la cirugía se cierra herméticamente y los animales recuperarse. Los lentivirus que codifican silenciadores de los objetivos de mRNA correspondientes sirven para implicar a la interacción específica de los genes miARN / target responsable del efecto observado, con los ratones no tratados, los ratones inyectados con solución salina y ratones inyectados con vectores lentivirus &quot;vacías&quot; como controles. Un mes después de la inyección, los animales se examinan en el laberinto de agua de Morris (MWM) para la evaluación de su aprendizaje navegación y capacidades de la memoria. El MWM es un tanque redondo lleno de agua coloreada con una pequeña plataforma sumergida 1 cm por debajo de la superficie del agua. Señales visuales estable alrededor del tanque para permitir la navegación espacial (sonido y el campo magnético de la tierra también puede ayudar a los animales en la navegación). Vigilancia de la cámara de vídeo permite la medición de la ruta de la natación y el tiempo para encontrar y constituir la plataforma. El ratón se enseña por primera vez que el montaje de la plataforma escondida ofrece un escape de la natación forzada, sino que se prueba para el uso de este escape y finalmente, la plataforma se retira y las pruebas de la sonda examinar si el ratón recuerda su ubicación anterior. Pruebas repetidas durante varios días consecutivos destacan un mejor rendimiento de los ratones examinados en latencias más cortas para encontrar y montar la plataforma, y ​​las rutas que más directas para llegar a la plataforma o la ubicación. Si no se presenta dicha mejora representa problemas de aprendizaje y de la memoria y / o ansiedad, que puede entonces ser probado específicamente (por ejemplo, en el laberinto elevado en cruz). Este enfoque permite la validación de miRNAs específicos y las transcripciones de destino en lo cognitivo estudiado y / o procesos relacionados con el estrés.

La inyección de 0,5 l lentivirus en la región CA1 en el hipocampo del ratón, con la velocidad de flujo se indica en la sección de protocolo produce una esfera infectada de alrededor de 1 mm en el eje rostral caudal, y alrededor de 0,5 mm en la dirección medial-lateral y la parte anterior -posterior ejes (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> Figura 1. Punto de bregma y aparato de ...

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Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Los microARNs tienen funciones importantes en la estructura y función del cerebro. Aquí se describe un método para hacer cumplir miRNA hipocampo sobreexpresión mediante inyección estereotáxica de un lentivirus que expresan los genes miARN ingeniería. Este enfoque puede servir como una manera relativamente rápida para evaluar la<em&gt; In vivo</em&gt; Efectos de miRNAs sobreexpresados ​​en regiones específicas del cerebro.

Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

stereotactic-injection-microrna-expressing-lentiviruses-to-mouse

Research

JoVE Journal

Behavior

22.6K vistas.  The Hebrew University of Jerusalem. Los microARNs tienen funciones importantes en la estructura y función del cerebro. Aquí se describe un método para hacer cumplir miRNA hipocampo sobreexpresión mediante inyección estereotáxica de un lentivirus que expresan los genes miARN ingeniería. Este enfoque puede servir como una manera relativamente rápida para evaluar la In vivo Efectos de miRNAs sobreexpresados ​​en regiones específicas del cerebro.

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Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of chronic CNS disorders, there is an increasing demand for murine models with high validity at the behavioral level. However, multiple pathogenic mechanisms and complex functional deficits often impose challenges to reliably measure and interpret behavior of chronically sick mice. Therefore, the assessment of peripheral pathology and a behavioral profile at several time points using a battery of tests are required. Video-tracking, behavioral spectroscopy, and remote acquisition of physiological measures are emerging technologies that allow for comprehensive, accurate, and unbiased behavioral analysis in a home-base-like setting. This report describes a refined phenotyping protocol, which includes a custom-made monitoring apparatus (Integrated Behavioral Station, INBEST) that focuses on prolonged measurements of basic functional outputs, such as spontaneous activity, food/water intake and motivated behavior in a relatively stress-free environment. Technical and conceptual improvements in INBEST design may further promote reproducibility and standardization of behavioral studies.

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station INBEST

Prolonged and comprehensive monitoring of mice in a home-cage environment provides a deeper understanding of aberrant behavior in murine models of brain diseases. This paper describes the Integrated Behavioral Station (INBEST) as the key component of contemporary behavioral analysis.

Comportamiento Fenotipificación de modelos murinos de enfermedades con la Estación Integrada Comportamiento (InBest)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Investigación

Comportamiento

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of studies show changes in balance phenotype with age in rodents, very few isolate the vestibular contribution to balance under either normal conditions or during senescence. We use two standard behavioral tests to characterize the balance performance of mice at defined age points over the lifespan: the rotarod test and the inclined balance beam test. Importantly though, a custom built rotator is also used to stimulate the vestibular system of mice (without inducing overt signs of motion sickness). These two tests have been used to show that changes in vestibular mediated-balance performance are present over the murine lifespan. Preliminary results show that both the rotarod test and the modified balance beam test can be used to identify changes in balance performance during aging as an alternative to more difficult and invasive techniques such as vestibulo-ocular (VOR) measurements.

Motor control and balance performance are known to deteriorate with age. This paper presents a number of standard noninvasive behavioral tests with the addition of a simple rotary stimulus to challenge the vestibular system and show changes in balance performance in a murine model of aging.

Evaluación del Comportamiento del Envejecimiento Ratón Sistema Vestibular

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific genes in encoding experience is one of the main objectives of molecular neuroscience. Furthermore, the functional association of defined genes with specific behaviors has implications for understanding the basis of neuropsychiatric disorders. Induction of robust transcription programs has been observed in the brains of mice following various behavioral manipulations. While some genetic elements are utilized recurrently following different behavioral manipulations and in different brain nuclei, transcriptional programs are overall unique to the inducing stimuli and the structure in which they are studied1,2.
In this publication, a protocol is described for robust and comprehensive transcriptional profiling from brain nuclei of mice in response to behavioral manipulation. The protocol is demonstrated in the context of analysis of gene expression dynamics in the nucleus accumbens following acute cocaine experience. Subsequent to a defined in vivo experience, the target neural tissue is dissected; followed by RNA purification, reverse transcription and utilization of microfluidic arrays for comprehensive qPCR analysis of multiple target genes. This protocol is geared towards comprehensive analysis (addressing 50-500 genes) of limiting quantities of starting material, such as small brain samples or even single cells.
The protocol is most advantageous for parallel analysis of multiple samples (e.g. single cells, dynamic analysis following pharmaceutical, viral or behavioral perturbations). However, the protocol could also serve for the characterization and quality assurance of samples prior to whole-genome studies by microarrays or RNAseq, as well as validation of data obtained from whole-genome studies.

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Análisis Integral de Transcripción Dinámica del cerebro muestras Siguiendo Experiencia del Comportamiento

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the test mouse is placed in a standardized apparatus and relevant behaviors are assessed in three different sessions (called session I, II, and III).
The apparatus has three compartments (see Figure 1), the left and right compartments contain an inverted cup which can house a mouse (called &#34;stimulus mouse&#34;).
In session I, the test mouse is placed in the cage and its mobility is characterized by the number of transitions made between compartments. In session II, a stimulus mouse is placed under one of the inverted cups and the sociability of the test mouse is quantified by the amounts of time it spends near the cup containing the enclosed stimulus mouse vs. the empty inverted cup. In session III, the inverted cups are removed and both mice interact freely. The sociability of the test mouse in session III is quantified by the number of social approaches it makes toward the stimulus mouse and by the number of times it avoids a social approach by the stimulus mouse.
The automated evaluation of the movie detects the nose of the test mouse, which allows the determination of all described sociability measures in session I and II (in session III, approaches are identified automatically but classified manually). To find the nose, the image of an empty cage is digitally subtracted from each frame of the movie and the resulting image is binarized to identify the mouse pixels. The mouse tail is automatically removed and the two most distant points of the remaining mouse are determined; these are close to nose and base of tail. By analyzing the motion of the mouse and using continuity arguments, the nose is identified.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52508/52508fig1.jpg" /> 
Figure 1. Assessment of Sociability During 3 sessions. Session I (top): Acclimation of test mouse to the cage. Session II (middle): Test mouse moving freely in the cage while the stimulus mouse is enclosed in an inverted cup. Session III (bottom): Both test mouse and stimulus mouse are allowed to move freely and interact with each other.

This protocol describes a method to quantify mouse sociability. Mice are videotaped as they move and interact in a special cage. Movie processing allows for the automated quantification of sociability with excellent accuracy and reliability.

Evaluación experimental de ratón sociabilidad Utilizando un enfoque de procesamiento de imágenes automatizado

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or knockdown gene expression in a relatively focused region without significant damage to the brain tissue. After recovery, the injected mouse can be tested on various behavioral tasks such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST). The OFT is designed to assess locomotion and the anxious phenotype in mice by measuring the amount of time that a mouse spends in the center of a novel open field. A more anxious mouse will spend significantly less time in the center of the novel field compared to controls. The FST assesses the anti-depressive phenotype by quantifying the amount of time that mice spend immobile when placed into a bucket of water. A mouse with an anti-depressive phenotype will spend significantly less time immobile compared to control animals. The goal of this protocol is to use the stereotactic injection of a lentivirus in conjunction with behavioral tests to assess how genetic factors modulate animal behaviors.

Stereotactic injection of lentiviruses expressing cDNAs or shRNAs can modulate gene expression in specific brain areas of mice. Here, we present a protocol to combine stereotactic injections with behavioral tasks, such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST).

Aplicando estereotáctica Técnica de Inyección para el Estudio de los efectos genéticos sobre Comportamientos animales

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

La estimulación del nervio vago como una herramienta para inducir plasticidad en vías pertinentes para el Aprendizaje Extinción

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human auditory development for these age groups. This paper describes an observer-based procedure for measuring hearing sensitivity with a two-interval, two-alternative forced-choice paradigm. Young children are trained to perform a play-based, motor response (e.g., putting a block in a bucket) whenever they hear a target signal. An experimenter observes the child&#39;s behavior and makes a judgment about whether the signal was presented during the first or second observation interval; the experimenter is blinded to the true signal interval, so this judgment is based solely on the child&#39;s behavior. These procedures were used to test 2 to 4 year-olds (n = 33) with no known hearing problems. The signal was a 1,000 Hz warble tone presented in quiet, and the signal level was adjusted to estimate a threshold corresponding to 71%-correct detection. A valid threshold was obtained for 82% of children. These results indicate that the two-interval procedure is both feasible and reliable for use with toddlers and preschoolers. The two-interval, observer-based procedure described in this paper is a powerful tool for evaluating hearing in young children because it guards against response bias on the part of the experimenter.

This paper describes a procedure for measuring hearing sensitivity in 2 to 4 year-old children. Children are trained to perform play-based responses when they hear a target signal. Thresholds are then estimated in a two-interval, two-alternative forced-choice paradigm, based on observations of the child&#39;s behaviors.

Evaluación del Comportamiento de la audición en 2 a 4 años de edad, los niños: un procedimiento en dos intervalos, a base de Observador El uso de respuestas condicionadas en base a juegos

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human ...

A Behavioral Test Battery for the Repeated Assessment of Motor Skills, Mood, and Cognition in Mice

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and dysfunctions in mood and cognition are common and often shared symptoms in neurodegenerative diseases. Shown here is a behavioral test battery for motor, mood, and cognition, which can be repeatedly tested in a longitudinal study. This battery assesses the overall behavioral phenotype in mice by examining each domain of behavior with at least two independent well-accepted tests (i.e., open-field test and rotarod test for motor function, social interaction test, elevated plus maze test, and forced swim test for emotional function, and Morris water maze test and novel object recognition test for cognitive function). Therefore, this sensitive and comprehensive test battery is a powerful tool for the study of behavioral alternation in neurodegeneration.

A comprehensive behavioral test battery of motor skills, mood&#8212;including social interaction, depression, and anxiety&#8212;and cognition is designed for the repeated assessment of neurodegeneration-related behavioral changes in mice.

Una batería de pruebas de comportamiento para la evaluación repetida de la motricidad, humor y cognición en ratones

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and ...

Utilizing a Reconfigurable Maze System to Enhance the Reproducibility of Spatial Navigation Tests in Rodents

Several maze shapes are used to test spatial navigation performance and behavioral phenotypes. Traditionally, each experiment requires a unique maze shape, thus requiring several separate mazes in different configurations. The maze geometry cannot be reconfigured in a single environment to accommodate scalability and reproducibility. The reconfigurable maze is a unique approach to address the limitations, allowing quick and flexible configurations of maze pathways in a repeatable manner. It consists of interlocking pathways and includes feeders, treadmills, movable walls, and shut-off sensors. The current protocol describes how the reconfigurable maze can replicate existing mazes, including the T-shaped, plus-shaped, W-shaped, and figure-eight mazes. Initially, the T-shaped maze was constructed inside a single experimental room, followed by modifications. The rapid and scalable protocol outlined herein demonstrates the flexibility of the reconfigurable maze, achieved through the addition of components and behavioral training phases in a stepwise manner. The reconfigurable maze systematically and precisely assesses the performance of multiple aspects of spatial navigation behavior.

The present protocol describes a reconfigurable maze, a unique system for testing spatial navigation and behavioral phenotypes in rodents. The adaptability of this maze system enables the execution of various experiments in a single physical environment. The ease of structural rearrangement generates reliable and reproducible experimental results.

Utilización de un sistema de laberinto reconfigurable para mejorar la reproducibilidad de las pruebas de navegación espacial en roedores

Several maze shapes are used to test spatial navigation performance and behavioral phenotypes. Traditionally, each experiment requires a unique maze ...

Validación de un modelo murino del síndrome de Angelman mediante pruebas conductuales

Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of AS. We use the rotarod learning paradigm, detailed gait analysis, and nest building test to detect and characterize animal motor impairments. We test animal emotionality in the open field and elevated plus maze tests, as well as the affect in the tail suspension test. When AS mice are tested in the open field test, the results should be interpreted with care, since motor dysfunctions influence mouse behavior in the maze and alter activity scores.
The reproducibility and effectiveness of the presented behavioral tests has already been validated in several independent Uba3a mouse lines with different knockout variants, establishing this set of tests as an excellent validation tool in AS research. Models with the relevant construct and face validity will warrant further investigations to elucidate the pathophysiology of the disease and grant the development of causal treatments.

Author Spotlight: Una batería de pruebas conductuales altamente reproducibles para validar un modelo murino de síndrome de Angelman 

This manuscript presents a set of highly reproducible behavioral tests to validate an Angelman syndrome mouse model.

Caracterización conductual de un modelo de ratón con síndrome de Angelman

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of ...