מחקר זה נתמך על ידי מרכז אדמונד ולילי ספרא למדעי המוח (SB מלגה), התכנית המורשית ביו רפואית מדע השותפות של הקרן הלאומית למדע (מענק מס &#39;378/11, ל&quot;מ) וקרן גרמנית למדע מחקר ופיתוח (GIF) (גרנט 1093-32.2/2010 מס, לHS).

1. הכנת lentivirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי HEK-293FT למפגש 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של מדיום סלולארי שינוי transfection לסרום ללא DMEM בתוספת גלוטמין 1 מ&quot;מ ו -50 פניצילין, סטרפטומיצין מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף transfect התאים עם וקטור pLKO.1-Puro ועם פלסמידים קידוד לR8.2 הדלתא וVSV-G moieties ומירנה של עניין, באמצעות 10 μl של polyethylenimine 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל כנשא 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף lentiviruses ארוז ב24 שעות ו -48 שעות לאחר transfection, לסנן דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכז את lentiviruses באמצעות ultracentrifugation ב70,000 XG, במשך שעה 2 ו -15 מעלות צלזיוס, aliquot ולאחסן ב -70 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל נגיף מידה על ידי הדבקה של תאי HEK-293T עם הכנות וירוס דילול סדרתי (1 עד 10 -6 מ&quot;ל של וקטור לכל טוב). כתוצאה כייל (מינימום של ~ 1 × 10 9 חלקיקים זיהומיות למ&quot;ל מומלץ) מוערך על ביטוי של gene של עניין, באמצעות בחירת puromycin וכימותים על ידי GFP להביע וירוסים באמצעות ספירת תאי ניאון. </li></ol> לפרוטוקול מפורט יותר של הכנת lentivirus לראות 10. 2. הכנת בעלי חיים לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבוש מנתחים צריך לכלול חלוק ניתוחים, כפפות סטריליות, כובע ומסכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את בעל החיים, ואז להרדים אותו עם ה-IP-הזרקה של תערובת קטמין, עם הנפח הפרופורציונלי למשקל החיה כמפורט עבור כל תרופה. לתערובת קטמין / Xylazine, טווח מינון של קטמין מ&quot;ג / ק&quot;ג 80-200 ו7-20 Xylazine מ&quot;ג / ק&quot;ג משמש בדרך כלל לעכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שהחיה היא בהרדמה מלאה, ואז לבדוק לחוסר רפלקס נסיגה באיבר האחורי של החיה על ידי הארכת האיבר ולאחר מכן לחיצה עליו עם האצבע שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את החיה מתחת לעור עם Rimadyl, כמפורט בקופסה, להקלה על כאב. טווח מינון אופייני לRymadil הוא 5-10 מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף קבועה וללחלח את העיניים עם משחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את האזור שבין שתי האוזניים עם מכונת חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את העור עם בטאדין. </li></ol> 3. חשיפה של הגולגולת והקידוחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה בתוך stereotact על ידי התאמת המוטות לתוך הסדקים רק הקדמיים לאוזניים של בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזמל כדי לעשות חתך קדמי, אחורי של כ -1.5 ס&quot;מ בין האוזניים ולשמור אותו לפתוח עם מהדק ניתוח (serfines). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את פני השטח של הגולגולת עם מקלון צמר גפן עד לצומת שבין תפר העטרה ותפרי sagittal, כלומר גבחת וצומת בין תפרי העטרה וlambdoid, כלומר למבדה, גלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את הקצה של המזרק, שנערך על ידי stereotact, עד לנקודת שגבחת, בכל שלושת הצירים. רשום את הקואורדינטות. נקודה זו תיחשב כPO אפסint בכל שלושת הצירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את המזרק בציר האנכי, כך שתנועה מישוריים לא לשרוט את הגולגולת ולהזיז את ראש המזרק למיקום הנכון. זריקות CA1 בהיפוקמפוס דורשות הבא מרכז יחסית לגבחת במ&quot;מ: -2 בציר הקדמי / אחורי, ± 1.8 בציר הרוחב / המדיאלי ו-1.5 בציר הגב / הגחון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את הקצה של המזרק עד שהוא נוגע בגולגולת ולסמן את המקום עם טוש. הוצא את המזרק בחזרה כדי להימנע מהדקירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חור רדוד, רק בעצמות הגולגולת באמצעות הקודח בסדר. החזק את הקודח יציב כדי שלא ימשיך לקדוח לתוך הרקמות הרכות שמתחת. ניתן למנוע זאת על ידי יד אחת מייצבת עם השני ועל ידי קידוח בפולסים קצרים. </li></ol> 4. הזרקה של Lentivirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגת 0.5 מ&quot;ל של פתרון lentivirus המרוכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המזרק מעל לחור ומוריד אותה לאט במאונך עד שזה פליליתצ &#39;ס את פני השטח של הגולגולת. להמשיך ולהפחית את המזרק לתוך המוח באיטיות רבה. בשלב זה, עלול לגרום לדימום שאינו מצביע בהכרח על חדירה נכשלה. אם דימום מתרחש לנגב אותו עם מקלון צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המשאבה הדיגיטלית ל0.02 מ&quot;ל / דקה (0.5 μl הייתי להיות מוזרק ב25 דקות) ולהתחיל עירוי. עירוי איטי מאפשר הפצה יעילה של הווירוס לתוך הרקמות ומונע חזרה לזרום. בחלק מסוגי המזרק לשקול החדרת המזרק לעומק נוסף של 0.5 מ&quot;מ לפני שנסוג לקואורדינטות ויציקה מקוריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העירוי הושלם להמתין במשך 5 דקות נוספות כדי לאפשר את החומר להתפשט לתוך המוח במקום לסגת בחזרה לתוך התעלה שהוקמה על ידי המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את המזרק באיטיות רבה ולצפות לזורם בחזרה. אם זרימה לאחור הוא ציין בשלב זה, כל חלק של החומר המוזרק היה כנראה הולכים לאיבוד. </li></ol> 5. איטום פצע ושחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה חותםדואר פצע עם histoacryl. הקפד למנוע דליפה של histoacryl לתוך עיניו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק intraperitoneally בעלי החיים (IP) עם מי מלח 1 מ&quot;ל מחומם מראש, כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה בכלוב התאוששות שממוקמת על משטח לוהט. צפו בבעלי החיים בזמן שהוא מתאושש לשעה נוספת. </li></ol> במקרה של ירידה במשקל, inappetance, צריכה להתבצע חולשה / חוסר היכולת להשיג מזון או מים, מדינה גוססת או זיהום, המתת חסד של בעלי החיים. שיטות מקובלות להמתת חסד של מכרסמים הן כדורי שינה, הרדמה נשימתית, CO 2, CO, או אשלגן כלורי בשיתוף עם הרדמה כללית. לאחר 4 עד 6 שבועות, להעריך את זכרון הניווט של החיה מוערך במבוך המים של מוריס. Lentivirus בדרך כלל להדביק את רוב התאים בתוך מעגל ההזרקה. 6. הערכת התנהגות במבוך המים של מוריס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכשיר את בעלי החיים בMמבוך המים orris. לאימונים מדויק ופרוטוקול בדיקה לראות 11. אחרי כל ניסוי, לייבש את החיה עם מגבת יבשה, להחליף אותו בכלוב שלו ולרענן את המים במכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את בעלי החיים במבוך המים של מוריס במשך 3 ימים רצופים, 4 ניסויים בכל יום. בכל יום להכניס את בעל חיים לתוך המבוך בכל אחד 4 הכיוונים של המבוך (צפון, דרום, מזרח ומערב) בשינוי סדר, למשל יום אחד: ממזרח למערב, צפון לדרום, יום שני: ממערב לדרום -צפון מזרח. נגב את החיות אחרי כל משפט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך בדיקת ניסויים לעקוב אחר בעלי החיים עם מערכת מעקב כגון מערכת מעקב Noldus. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי משפט מבחן ה -12, הכנס את בעל החיים לתוך המכל המים ללא פלטפורמה לדקה אחת. זה יהיה להשתמש בו כדי לנתח את אסטרטגית חיפוש בעלי החיים הוא לוקחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים כפי שהוצע ב12. </li></ol>

<ol>
	<li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis.">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li><li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway.">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li><li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions.">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors:+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice.">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li><li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system.">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li><li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A/B+in+Alzheimer's+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice.">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety:+the+case+of+amygdalar+miR-34.">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li><li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target.">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure &amp; Function. , 10-1007 (2012).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+&amp;+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles.">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs &amp; transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+Water+Maze+Experiment.">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).</li><li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).</li><li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery.">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הזרקת Stereotactic של lentivirus היא שיטה מהירה יחסית להערכה בvivo עבור שניהם למעלה או למטה רגולציה של גנים וmiRNAs שונים. החלופה העיקרית היא עכבר מהונדס גנטי אשר הוא טכניקה רב הרבה יותר מפרכת ושעה לאחר מכן זריקת lentivirus ישירה. בנוסף, הרגולציה למעלה, בהזרקת lentivirus, מתרחשת בזמן מסוי?...

התפקיד של miRNAs מסוימת בתפקוד מערכת עצבים באחרונה לערער על ידי הזרקת lentiviral במספר מחקרים. MiRNAs כבר מצא להיות חיוני לשמירה ועיצוב מחדש מבנה סינפסה 1, 2 synaptogenesis ושיפוץ סינפסה ותחזוקה 3. מחקרים אלה ממליצים כי miRNAs עוסקות, דרך השפעות הרגולטוריות ריבוד בשניהם בעיצוב למעלה ובשמירה על התפוקה העיקרית של מערכת העצבים, תפקוד הקוגניטיבי. הזרקה של חלקיקי Stereotactic lentivirus לאזורים ספציפיים במוח המכרסם מאפשרת מחפשת שינויים במורפולוגיה סינפסה ופעילות עצבית, ושימש להקמת המשמעות התפקודית של תמלילי ביטוי יתר 4,5. זיהום ישיר של תאי עצב באזורי המוח מוגדרים היטב עם lentiviruses מירנה-להביע עשויה להיות מעורב במחקרים של הזדקנות, הפרעות במוח וניוון מוחיים, מחקרים של מירנהים בתחום של רגולציה התנהגותית 6-8 נמצא במצב הרבה פחות מתקדם, והזרקת stereotactic של מירנה-להביע חלקיקי lentivirus ואחרי בדיקות התנהגותיות עשוי להיות שימושי למטרות האמורות. שיטה הרבה יותר מייגע לגרימה מעל או מתחת, ביטוי כרוך בהנדסה גנטית עכברים בנוקאאוט דפיקה באו. מערכות גנטיות נוספות יכולות לאפשר לבקרה מותנית ובזמן על ביטוי (למשל Cre-קס, מערכות ט), אך אלה כמעט לא להציע סגוליות המרחבי של הליך ההזרקה וכמעט תמיד יש כמות מסוימת של דליפות. כמו כן, את הנהלים ההנדסיים אינם דורשים ניתוח, וניתן להשתמש בכל מעבדות עם שחזור טוב יחסית, עם זאת, שהם איטיים יותר ודורשים הרבה יותר כוח אדם ובמשאבים כספיים. בנוסף, השליטה הזמנית של מעל או מתחת הביטוי בעכברים שהוזרקו הוא הרבה יותר מדויק בהשוואה לעכברים מהונדסים גנטי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rodent weigh scale</td>
			<td>Burtons (UK)</td>
			<td>115-455</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24">heating pad</td>
			<td>FIRstTechnology</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">trimming machine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">stereotact</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Scalpel and blades</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>INS500348</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Harland syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">driller</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">digital pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>704507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Water tank and platform</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">ketamine </td>
			<td>Vetoquinol(Lure France)</td>
			<td>3055503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">domitor</td>
			<td>Orion pharma</td>
			<td>107140-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rimadyl</td>
			<td>Pfizer animal health</td>
			<td>24751</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="138" rowspan="2">moisture ointment - Synthomycine 5%</td>
			<td rowspan="2">Rekah Pharmaceutical</td>
			<td rowspan="2">195</td>
			<td rowspan="2"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>112101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome

מיקרו RNA (miRNAs) הם מולקולות רגולטוריות קטנות חד גדילי RNA כ -22 נוקלאוטידים ארוכים שעשוי כל יעד תעתיקי mRNA רבים ומסלול כולו עמום ביטוי גנים על ידי הרס ו / או תרגום עיכוב של יעדים אלה ישכנעו. כמה miRNAs לשחק תפקיד מפתח בשמירה על מבנה ותפקוד עצביים ובתפקודי מוח ברמה גבוהה יותר, והם חיפשו שיטות לרמותיהם מניפולציה בשביל לחקור את הפונקציות האלה. כאן, אנו מציגים שיטה ישירה בvivo לבחינת ההשלכות הקוגניטיביות של miRNAs נאכפה עודפת בעכברים על ידי הזרקה של חלקיקי נגיף stereotactic מירנה קידוד. באופן ספציפי, בפרוטוקול הנוכחי כרוך בהזרקה לאזור CA1 בהיפוקמפוס, התורמת לגיבוש יונקים זיכרון, למידה, ותגובות לחץ, ומציע הזריקה נוחה. את הקואורדינטות נמדדות לפי גבחת העכבר וזלוף הווירוס נמצא בשליטה דיגיטלית ושמר איטיים מאוד.לאחר הזרקה, פצע הניתוח הוא חתום ואת בעלי החיים להתאושש. Lentiviruses קידוד משתיקי קול של מטרות mRNA המתאימות לשמש כדי לסבך את מירנה / יעד האינטראקציה הספציפית אחראית לאפקט הנצפה, עם עכברים נאיביים, עכברים שהוזרקו עם מי מלח ועכברים שהוזרקו עם וקטורי lentivirus &quot;ריקים&quot; כקבוצת ביקורת. חודש אחד לאחר ההזרקה, החיות נבחנות במבוך המים של מוריס (MWM) להערכת למידת הניווט שלהם ויכולות זיכרון. MWM הוא המכל עגול מלאים במים צבעוניים עם פלטפורמה קטנה שקועה 1 ס&quot;מ מתחת לפני המים. רמזים חזותיים יציבים סביב הטנק לאפשר ניווט המרחבי (קול והשדה המגנטי של כדור הארץ עשוי גם לסייע לבעלי החיים בניווט). ניטור מצלמת וידאו מאפשר מדידת מסלול השחייה ואת הזמן כדי למצוא ויסתכם בפלטפורמה. העכבר ראשון שלמד את ההרכבה הפלטפורמה הנסתרת מציעה מפלט מהחייה הכפויה, אלא לאחר מכן הוא נבדק על שימוש בבריחה וF זהinally, הפלטפורמה מוסרת ובדיקות בדיקה לבחון אם העכבר זוכר את מיקומו הקודם. בדיקות חוזרות ונשנות על פני כמה ימים רצופים להדגיש ביצועים משופרים של עכברים נבדקו בlatencies קצר יותר כדי למצוא ולהתקין את הפלטפורמה, ומסלולים כיותר ישירים כדי להגיע לפלטפורמה או מיקומו. כישלון להראות שיפור כזה מייצג לקוי למידה וזיכרון ו / או חרדה, אשר לאחר מכן ניתן לבחון באופן ספציפי (לדוגמה: במבוך בתוספת המוגבה). גישה זו מאפשרת אימות של miRNAs ספציפית ותמלילי היעד בהקוגניטיבית ו / או תהליכים הקשורים ללחץ למד.

הזרקה של 0.5 lentivirus μl לאזור CA1 בהיפוקמפוס העכבר, עם קצב הזרימה מצויינים בסעיף הפרוטוקול מניבה תחום נגוע של כ 1 מ&quot;מ בציר מקורי, הזנב, ועל 0.5 מ&quot;מ וברוחב המדיאלי-הקדמי צירים אחוריים-(איור 3). <img alt="איור 1" src...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome at JoVE.com

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

יש מיקרו RNA תפקידים משמעותיים במבנה המוח ותפקודו. כאן אנו מתארים שיטה לאכיפת מירנה היפוקמפוס יתר ביטוי באמצעות הזרקת stereotactic של lentivirus מירנה מביע מהונדס. גישה זו יכולה לשמש כדרך מהירה יחסית על מנת להעריך את<em&gt; In vivo</em&gt; השפעות של miRNAs ביטוי יתר של אזורים ספציפיים במוח.

Lentiviruses הזרקת Stereotactic של microRNA-לבטא באזור CA1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

stereotactic-injection-microrna-expressing-lentiviruses-to-mouse

Research

JoVE Journal

Behavior

22.7K Views.  The Hebrew University of Jerusalem. יש מיקרו RNA תפקידים משמעותיים במבנה המוח ותפקודו. כאן אנו מתארים שיטה לאכיפת מירנה היפוקמפוס יתר ביטוי באמצעות הזרקת stereotactic של lentivirus מירנה מביע מהונדס. גישה זו יכולה לשמש כדרך מהירה יחסית על מנת להעריך את In vivo השפעות של miRNAs ביטוי יתר של אזורים ספציפיים במ...

Video: Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of chronic CNS disorders, there is an increasing demand for murine models with high validity at the behavioral level. However, multiple pathogenic mechanisms and complex functional deficits often impose challenges to reliably measure and interpret behavior of chronically sick mice. Therefore, the assessment of peripheral pathology and a behavioral profile at several time points using a battery of tests are required. Video-tracking, behavioral spectroscopy, and remote acquisition of physiological measures are emerging technologies that allow for comprehensive, accurate, and unbiased behavioral analysis in a home-base-like setting. This report describes a refined phenotyping protocol, which includes a custom-made monitoring apparatus (Integrated Behavioral Station, INBEST) that focuses on prolonged measurements of basic functional outputs, such as spontaneous activity, food/water intake and motivated behavior in a relatively stress-free environment. Technical and conceptual improvements in INBEST design may further promote reproducibility and standardization of behavioral studies.

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station INBEST

Prolonged and comprehensive monitoring of mice in a home-cage environment provides a deeper understanding of aberrant behavior in murine models of brain diseases. This paper describes the Integrated Behavioral Station (INBEST) as the key component of contemporary behavioral analysis.

ההתנהגות phenotyping של מודלי Murine מחלות עם ההתנהגות המשולבת התחנה (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of studies show changes in balance phenotype with age in rodents, very few isolate the vestibular contribution to balance under either normal conditions or during senescence. We use two standard behavioral tests to characterize the balance performance of mice at defined age points over the lifespan: the rotarod test and the inclined balance beam test. Importantly though, a custom built rotator is also used to stimulate the vestibular system of mice (without inducing overt signs of motion sickness). These two tests have been used to show that changes in vestibular mediated-balance performance are present over the murine lifespan. Preliminary results show that both the rotarod test and the modified balance beam test can be used to identify changes in balance performance during aging as an alternative to more difficult and invasive techniques such as vestibulo-ocular (VOR) measurements.

Motor control and balance performance are known to deteriorate with age. This paper presents a number of standard noninvasive behavioral tests with the addition of a simple rotary stimulus to challenge the vestibular system and show changes in balance performance in a murine model of aging.

התנהגות הערכה של מערכת שיווי המשקל עכבר ההזדקנות

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific genes in encoding experience is one of the main objectives of molecular neuroscience. Furthermore, the functional association of defined genes with specific behaviors has implications for understanding the basis of neuropsychiatric disorders. Induction of robust transcription programs has been observed in the brains of mice following various behavioral manipulations. While some genetic elements are utilized recurrently following different behavioral manipulations and in different brain nuclei, transcriptional programs are overall unique to the inducing stimuli and the structure in which they are studied1,2.
In this publication, a protocol is described for robust and comprehensive transcriptional profiling from brain nuclei of mice in response to behavioral manipulation. The protocol is demonstrated in the context of analysis of gene expression dynamics in the nucleus accumbens following acute cocaine experience. Subsequent to a defined in vivo experience, the target neural tissue is dissected; followed by RNA purification, reverse transcription and utilization of microfluidic arrays for comprehensive qPCR analysis of multiple target genes. This protocol is geared towards comprehensive analysis (addressing 50-500 genes) of limiting quantities of starting material, such as small brain samples or even single cells.
The protocol is most advantageous for parallel analysis of multiple samples (e.g. single cells, dynamic analysis following pharmaceutical, viral or behavioral perturbations). However, the protocol could also serve for the characterization and quality assurance of samples prior to whole-genome studies by microarrays or RNAseq, as well as validation of data obtained from whole-genome studies.

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

ניתוח מקיף של תמלול Dynamics מדוגמאות המוח בעקבות ניסיון התנהגות

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the test mouse is placed in a standardized apparatus and relevant behaviors are assessed in three different sessions (called session I, II, and III).
The apparatus has three compartments (see Figure 1), the left and right compartments contain an inverted cup which can house a mouse (called &#34;stimulus mouse&#34;).
In session I, the test mouse is placed in the cage and its mobility is characterized by the number of transitions made between compartments. In session II, a stimulus mouse is placed under one of the inverted cups and the sociability of the test mouse is quantified by the amounts of time it spends near the cup containing the enclosed stimulus mouse vs. the empty inverted cup. In session III, the inverted cups are removed and both mice interact freely. The sociability of the test mouse in session III is quantified by the number of social approaches it makes toward the stimulus mouse and by the number of times it avoids a social approach by the stimulus mouse.
The automated evaluation of the movie detects the nose of the test mouse, which allows the determination of all described sociability measures in session I and II (in session III, approaches are identified automatically but classified manually). To find the nose, the image of an empty cage is digitally subtracted from each frame of the movie and the resulting image is binarized to identify the mouse pixels. The mouse tail is automatically removed and the two most distant points of the remaining mouse are determined; these are close to nose and base of tail. By analyzing the motion of the mouse and using continuity arguments, the nose is identified.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52508/52508fig1.jpg" /> 
Figure 1. Assessment of Sociability During 3 sessions. Session I (top): Acclimation of test mouse to the cage. Session II (middle): Test mouse moving freely in the cage while the stimulus mouse is enclosed in an inverted cup. Session III (bottom): Both test mouse and stimulus mouse are allowed to move freely and interact with each other.

This protocol describes a method to quantify mouse sociability. Mice are videotaped as they move and interact in a special cage. Movie processing allows for the automated quantification of sociability with excellent accuracy and reliability.

ההערכה הניסויית של עכבר חברותי בגישת עיבוד תמונה אוטומטית

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or knockdown gene expression in a relatively focused region without significant damage to the brain tissue. After recovery, the injected mouse can be tested on various behavioral tasks such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST). The OFT is designed to assess locomotion and the anxious phenotype in mice by measuring the amount of time that a mouse spends in the center of a novel open field. A more anxious mouse will spend significantly less time in the center of the novel field compared to controls. The FST assesses the anti-depressive phenotype by quantifying the amount of time that mice spend immobile when placed into a bucket of water. A mouse with an anti-depressive phenotype will spend significantly less time immobile compared to control animals. The goal of this protocol is to use the stereotactic injection of a lentivirus in conjunction with behavioral tests to assess how genetic factors modulate animal behaviors.

Stereotactic injection of lentiviruses expressing cDNAs or shRNAs can modulate gene expression in specific brain areas of mice. Here, we present a protocol to combine stereotactic injections with behavioral tasks, such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST).

יישום טכניקת הזרקת stereotactic לחקר השפעות גנטיות על התנהגות בעלי החיים

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

הקוצב וגאלי ככלי כדי לגרום פלסטיות במסלולים רלוונטיים ללמידה הכחדה

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human auditory development for these age groups. This paper describes an observer-based procedure for measuring hearing sensitivity with a two-interval, two-alternative forced-choice paradigm. Young children are trained to perform a play-based, motor response (e.g., putting a block in a bucket) whenever they hear a target signal. An experimenter observes the child&#39;s behavior and makes a judgment about whether the signal was presented during the first or second observation interval; the experimenter is blinded to the true signal interval, so this judgment is based solely on the child&#39;s behavior. These procedures were used to test 2 to 4 year-olds (n = 33) with no known hearing problems. The signal was a 1,000 Hz warble tone presented in quiet, and the signal level was adjusted to estimate a threshold corresponding to 71%-correct detection. A valid threshold was obtained for 82% of children. These results indicate that the two-interval procedure is both feasible and reliable for use with toddlers and preschoolers. The two-interval, observer-based procedure described in this paper is a powerful tool for evaluating hearing in young children because it guards against response bias on the part of the experimenter.

This paper describes a procedure for measuring hearing sensitivity in 2 to 4 year-old children. Children are trained to perform play-based responses when they hear a target signal. Thresholds are then estimated in a two-interval, two-alternative forced-choice paradigm, based on observations of the child&#39;s behaviors.

ערכה התנהגותית של שמיעה ב 2 עד 4 ילדים בת: נוהל דו מרווח, אובזרוור מבוסס שימוש תגובות Play מבוסס אלפו

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human ...

A Behavioral Test Battery for the Repeated Assessment of Motor Skills, Mood, and Cognition in Mice

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and dysfunctions in mood and cognition are common and often shared symptoms in neurodegenerative diseases. Shown here is a behavioral test battery for motor, mood, and cognition, which can be repeatedly tested in a longitudinal study. This battery assesses the overall behavioral phenotype in mice by examining each domain of behavior with at least two independent well-accepted tests (i.e., open-field test and rotarod test for motor function, social interaction test, elevated plus maze test, and forced swim test for emotional function, and Morris water maze test and novel object recognition test for cognitive function). Therefore, this sensitive and comprehensive test battery is a powerful tool for the study of behavioral alternation in neurodegeneration.

A comprehensive behavioral test battery of motor skills, mood&#8212;including social interaction, depression, and anxiety&#8212;and cognition is designed for the repeated assessment of neurodegeneration-related behavioral changes in mice.

סוללה בדיקה התנהגותית להערכה חוזרת ונשנית של מיומנויות מוטוריות, מצב רוח, קוגניציה בעכברים

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and ...

Utilizing a Reconfigurable Maze System to Enhance the Reproducibility of Spatial Navigation Tests in Rodents

Several maze shapes are used to test spatial navigation performance and behavioral phenotypes. Traditionally, each experiment requires a unique maze shape, thus requiring several separate mazes in different configurations. The maze geometry cannot be reconfigured in a single environment to accommodate scalability and reproducibility. The reconfigurable maze is a unique approach to address the limitations, allowing quick and flexible configurations of maze pathways in a repeatable manner. It consists of interlocking pathways and includes feeders, treadmills, movable walls, and shut-off sensors. The current protocol describes how the reconfigurable maze can replicate existing mazes, including the T-shaped, plus-shaped, W-shaped, and figure-eight mazes. Initially, the T-shaped maze was constructed inside a single experimental room, followed by modifications. The rapid and scalable protocol outlined herein demonstrates the flexibility of the reconfigurable maze, achieved through the addition of components and behavioral training phases in a stepwise manner. The reconfigurable maze systematically and precisely assesses the performance of multiple aspects of spatial navigation behavior.

The present protocol describes a reconfigurable maze, a unique system for testing spatial navigation and behavioral phenotypes in rodents. The adaptability of this maze system enables the execution of various experiments in a single physical environment. The ease of structural rearrangement generates reliable and reproducible experimental results.

שימוש במערכת מבוך הניתנת להגדרה מחדש כדי לשפר את יכולת השחזור של בדיקות ניווט מרחביות במכרסמים

Several maze shapes are used to test spatial navigation performance and behavioral phenotypes. Traditionally, each experiment requires a unique maze ...

אימות מודל מורין של תסמונת אנג'למן באמצעות מבחנים התנהגותיים

Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of AS. We use the rotarod learning paradigm, detailed gait analysis, and nest building test to detect and characterize animal motor impairments. We test animal emotionality in the open field and elevated plus maze tests, as well as the affect in the tail suspension test. When AS mice are tested in the open field test, the results should be interpreted with care, since motor dysfunctions influence mouse behavior in the maze and alter activity scores.
The reproducibility and effectiveness of the presented behavioral tests has already been validated in several independent Uba3a mouse lines with different knockout variants, establishing this set of tests as an excellent validation tool in AS research. Models with the relevant construct and face validity will warrant further investigations to elucidate the pathophysiology of the disease and grant the development of causal treatments.

Author Spotlight: סוללה של מבחנים התנהגותיים הניתנים לשחזור גבוה כדי לאמת מודל מורין של תסמונת אנג'למן 

This manuscript presents a set of highly reproducible behavioral tests to validate an Angelman syndrome mouse model.

אפיון התנהגותי של מודל עכבר תסמונת אנג'למן

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of ...