Dr. Stephen Alderman, Dr. David Leaf, y Erin Macri se agradece la ayuda con la microscopía. Esta investigación fue financiada por una subvención de la Iniciativa de Investigación de Cultivos de Especialidad NIFA, Premio Beca SCRI-PRES USDA N º 2.009 hasta 02.484. Briana Kinash, Kevin Kinloch, Megan Leonhard Joseph McCollum, Maria McSharry y Nicole Sallee siempre excelente asistencia técnica y debates reflexivos.

<ol>
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El procedimiento descrito en este documento representa una técnica de primer paso para el aislamiento de microorganismos degradadores potenciales BDM del suelo, y se utilizó con éxito para aislar los hongos de BDM enterrados en el suelo durante siete meses. Los hongos crecieron cuando se inoculó sobre el material de BDM fresco del mismo tipo, lo que indica que los hongos aislados eran de hecho colonizadores, y que las películas no fueron inhibitorios para el crecimiento de hongos. Aislamiento de los hongos que degr...

La degradación ha sido históricamente considerada un atributo deseable de polímeros plásticos, debido desglose reduce su vida útil y durabilidad del producto. Recientemente, la conciencia de los problemas ambientales presentados por los residuos de plástico en el entorno natural 1,2,3 ha hecho plásticos biodegradables una alternativa atractiva a los materiales plásticos convencionales. Degradación (definida como los cambios estructurales, la fragmentación y la reducción en el peso molecular, la integridad, y la fuerza de 4,5) se produce a través de una serie de eventos, incluyendo tanto los procesos abióticos (estrés térmico, la foto-oxidación, la hidrólisis, la erosión y el estrés mecánico), y la degradación biológica 6. Si bien los procesos abióticos pueden cambiar el tamaño de los fragmentos y las características de los plásticos, se requieren los microorganismos para su último mineralización al agua y dióxido de carbono (en condiciones aeróbicas) y / o metano (en condiciones anaerobias). Un nicho importante paraplásticos biodegradables existe en la agricultura, donde se utilizan coberturas de plástico para evitar el crecimiento de malezas, para retener la humedad del suelo y para aumentar la temperatura del suelo 7,8. Cientos de miles de acres en los Estados Unidos solamente están cubiertas con mulch de plástico 9, incluyendo coberturas compuestas de plástico biodegradable. Después de una temporada de crecimiento de los cultivos, las opciones para disponer de coberturas biodegradables (BDM) incluyen la eliminación en un vertedero, la incineración para recuperar energía 10, la degradación a través de compostaje, o degradación en el suelo después de la siembra 11. De éstos, el destino menos mano de obra intensiva está arando BDM en el suelo, pero sin la degradación eficiente y la mineralización durante meses no cultivadas (generalmente en el invierno), fragmentos de plástico podrían permanecer y interferir con los equipos agrícolas durante la labranza y la siembra de primavera, y persistir en el medio ambiente en el que impactan significativamente la fauna, la flora y microbiota 1,2,3,10. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Aunque muchos productos plásticos, incluyendo películas agrícolas, llevan la etiqueta de &quot;biodegradable&quot; o &quot;compostables&quot;, en la práctica, la degradación y la mineralización pueden ser demasiado ineficiente y / o demasiado incompleta para la descomposición en el suelo a ser un alternativa viable para la eliminación de estos productos. Por ejemplo, polietilenos oxo-biodegradables lograrse sólo 12,4% de mineralización después de un año de la intemperie ya los tres meses posteriores en un 58 ° C de compost, y menos de la mitad de esa cantidad de mineralización tuvieron lugar cuando la temperatura de la composta era 25 ° C 12. En el invierno, la temperatura del suelo en la mayoría de lugares serían más bajos que cualquiera de estas temperaturas, presumiblemente como resultado aún menor actividad microbiana y, en consecuencia, menor mineralización. Además de disminuir las tasas de degradación, el mal uso del término &quot;biodegradable&quot; ha llevado a desconfiar de estos productos por los consumidores 13,14, incluidos los de la industria agrícola. La biodegradación es la conversiónde polímeros a dióxido de carbono (y / o metano) y agua 14 por microorganismos de origen natural 4. Por lo tanto, la biodegradación se debe medir químicamente; la asociación física de microorganismos con un sustrato no implica la degradación microbiana de ese material. Como parte de un esfuerzo para examinar el uso sostenible de BDM en la agricultura, este estudio se centra en el descubrimiento de los microorganismos nativos de suelos agrícolas que colonizan y degradan BDMs disponibles comercialmente. Métodos de ensayo normalizados se han publicado para medir químicamente la descomposición de los plásticos biodegradables mediante abióticos y biológicos 15,16,17. Sin embargo, estos métodos no se refieren a la degradación de plásticos por especies microbianas individuales, o proporcionan métodos para su aislamiento. La metodología se asemeja más estrechamente en este documento métodos estándar diseñados para evaluar plásticos para la resistencia a la degradación microbiana después de la inoculación de las muestras con esporas de hongos18,19. Cuando se conocen formulaciones de plásticos y una fuente de la materia prima es disponible, el plástico en polvo puede ser suspendido en los medios de comunicación y la degradación basados ​​en agar determinados por la visualización de zonas de compensación 13. Este método se ha utilizado anteriormente para identificar microorganismos que degradan polímeros tales como poliuretano 20, poli-(butileno succinato-co-adipato) 21, y poli (ácido láctico) 22. Un método similar implica la suspensión de plástico en polvo puro en un medio líquido, donde el plástico es la única fuente de carbono 20,23. Si bien estos métodos tienen la ventaja de un sistema definido, que mal imitar en la degradación in situ de BDM. En primer lugar, el área de superficie se distribuye de manera diferente porque BDMs no se dispersan en partículas pequeñas en toda la matriz del suelo, sino más bien, venden y utilizan como películas. En segundo lugar, la composición química de BDM es diferentes de los polímeros puros. BDMs generalmente contienen aditivos tales comomateriales de relleno, plastificantes y colorantes, y estos aditivos pueden afectar el crecimiento microbiano y de ese modo, la tasa de mineralización. Por esta razón, y debido a la composición de ciertas películas comerciales en este estudio eran de propiedad, película de plástico en su forma de campo-listo se utilizó para aislar los hongos y las bacterias. Por simplicidad, los siguientes métodos se describen sólo para los hongos, con modificaciones observaron en su caso para aislamientos bacterianos. En un estudio reciente 24, tres BDMs comercialmente disponibles y una película experimental se utilizaron en los sitios agrícolas en tres diferentes regiones de los Estados Unidos durante un período de crecimiento, y posteriormente colocados en mallas (250 micras) bolsas y enterrados en un invierno en el suelo en los mismos sitios. Las aberturas de la malla de 250 micras permiten hifas del hongo penetre excluyendo raíces y la mayoría de la fauna del suelo, y reducir al mínimo la intrusión del suelo 25,26. Materiales de nylon evitan la degradación de la bolsa en el suelo. Después de la excavación, fuNGAL aislamientos fueron recuperados a partir de piezas BDM y se evaluaron para el crecimiento en medio mínimo sin una fuente de carbono, excepto el agar y unos 5 cm x 5 cm cuadrados de superficie desinfestados de nuevo, película BDM no utilizada que fue pre-desinfestados. La mayoría de los plásticos que se utilizan como películas no pueden ser esterilizados en autoclave sin pérdida de integridad, se utiliza la luz ultravioleta para matar las células microbianas que residen en los plásticos. ISO 19 846 recomienda superficie-desinfestación en 70% de etanol y posterior secado, pero si se utiliza este método, uno debe asegurarse de que ningún componente o aditivo de la película se ve afectada negativamente por el etanol. Desde BDMs presumiblemente se fabrican para soportar la luz del sol, UV fue elegido como un método de descontaminación. Los aislados que crecían en BDM piezas mejor que en un medio mínimo solo se seleccionaron para su posterior estudio. Agar, un polisacárido producido por las algas marinas, se utiliza para solidificar medios microbianos, ya que no es utilizada típicamente metabólicamente por agrícolamente y médicamente nomicroorganismos capaces, sin embargo, agar enzimas que hidrolizan se han aislado a partir de bacterias marinas 27 y agar que hidrolizan las bacterias también se han aislado de suelo 28. Polímeros BDM y agar tanto se espera que sean sustratos raras para enzimas secretadas por hongos del suelo, que no se han desarrollado en ambientes que contienen estos polímeros como posibles fuentes de nutrientes, pero ambos sustratos están presentes en la placa de bioensayo descrito en este documento (Paso 7). Los hongos que utilizan BDMs pero no de agar como una fuente de carbono pueden ser diferenciados de los hongos que sólo utilizan agar, comparando el crecimiento en agar-medio solidificado que contiene i) fuente de carbono sin añadido excepto agar (control negativo), ii) BDM películas (experimental) y iii) la glucosa (control positivo). El crecimiento de todas las cepas se espera que en un medio mínimo más la glucosa; hongos no derivada de la glucosa que contienen placas puede no ser capaz de crecer en el medio mínimo particular usado en el experimento. Potential BDM degradadores debe crecer en agar solidificado medio mínimo + film BDM mejor que crecen en agar solidificado medio mínimo solo. Los hongos que crecen en placas de medio mínimo de agar-son degradadores o poblaciones de ecosistemas oligotróficos, y también se espera que crezcan en el agar asociado con películas BDM en placas de bioensayo, pero no en las propias películas (a menos que casualmente también degradan polímeros BDM). Para eliminar la posibilidad de ver el crecimiento microbiano debido a la utilización de agar y no de BDM, seguimos nuestro ensayo inicial para la colonización BDM en placas de agar con un bioensayo en medio de caldo definido (Paso 9). BDM piezas representaban la fuente de carbono sólo se conoce en los tubos de ensayo biológico. Después de la selección inicial, y después de la reactivación de las existencias de glicerol de las cepas aisladas, algunos formaron micelios escasa pero visible en medio definido líquido que no contiene fuente de carbono conocido. Estos resultados sugieren que algunos de los aislados fueron adquiridos oligotrophs - organismos que crecen por barrido de cantidades muy pequeñas de carbono, nitrógeno y otros nutrientes disueltos ya sea en el ambiente acuoso o que existe como volátiles en el aire 29,30,31. La identificación de especies a través de análisis de ADN ribosómico 18S apoya este punto de vista, ya que muchos de los aislados emparejados géneros fúngicos se informó anteriormente para exponer oligotrofía 32. Poblaciones de ecosistemas oligotróficos, que son comúnmente saprofitos, requieren una amplia gama de capacidades metabólicas para la utilización del sustrato en una gama de entornos de 30. Por lo tanto, no es sorprendente que los mismos hongos que aislamos de la BDM (presumiblemente requieren capacidades enzimáticas inusuales) demostraron capacidades oligotróficos, y fueron capaces de crecer en trazas de contaminantes, tales como aceites de la piel de las huellas dactilares, el polvo o volátiles traza en el aire. Debido al aislamiento de poblaciones de ecosistemas oligotróficos, llegamos a la conclusión de que el crecimiento en una superficie BDM por sí solo no podría ser utilizado para inferir BDM avería. Los métodos descritos en este documento reflejan nuestros esfuerzos para screen colonizadores BDM nativas de suelos agrícolas bona fide desglose BDM.

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<tbody>
 <tr>
 <td>Reagent Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potato Dextrose Agar</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>8X05491</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Agar</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP 1423-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Chloramphenicol</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>200-287-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Glutaraldehyde</td>
 <td>Electon Microscopy Sciences</td>
 <td>16216-10</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Molecular sieve</td>
 <td>Fisher </td>
 <td>M-8892</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Ethanol</td>
 <td>Pharmco-Aaper</td>
 <td>E200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Contrex</td>
 <td>Decon Labs, Inc.</td>
 <td>5204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Parafilm M</td>
 <td>Pechiney Plastic Packaging</td>
 <td>S37440</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Mineral salts for buffers and media</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>Various</td>
 <td>Various vendors sell these reagents</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of native soil microorganisms with potential for breaking down biodegradable plastic mulch films used in agriculture

Los hongos nativos en los suelos agrícolas que colonizaron películas mantillo biodegradables disponibles comercialmente (BDM), se aislaron y evaluaron de potencial de degradar plásticos. Típicamente, cuando se conocen formulaciones de plásticos y una fuente de la materia prima está disponible, de plástico en polvo puede ser suspendido en los medios de comunicación y la degradación basados ​​en agar determinados por la visualización de las zonas de compensación. Sin embargo, este enfoque mal imita en la degradación in situ de BDM. En primer lugar, BDM no se dispersan en forma de partículas pequeñas en toda la matriz del suelo. En segundo lugar, BDM no se venden comercialmente como polímeros puros, sino más bien como las películas que contienen aditivos (por ejemplo, cargas, plastificantes y colorantes) que pueden afectar el crecimiento microbiano. Los procedimientos descritos en este documento se utilizan para los aislamientos obtenidos de películas mantillo de enterramiento. Aislados fúngicos obtenidos de BDMs excavadas fueron probados individualmente para el crecimiento en pedazos de nuevos BDMs, desinfestadas establecidos sobre medio definido que no contiene fuente de carbono ealvo agar. Los aislados que crecían en BDMs fueron probados en medio líquido donde BDMs eran la única fuente de carbono adicional. Después de aproximadamente diez semanas colonización fúngica y la degradación de BDM se evaluaron por microscopía electrónica de barrido. Los aislados fueron identificados a través de análisis de secuencias de genes de ARN ribosomal. Este informe describe métodos para el aislamiento de hongos, pero las bacterias también se aisló usando estos métodos por los medios de sustitución apropiadas para las bacterias. Nuestra metodología puede ser muy útil para los estudios de investigación de desglose de las películas de plástico intactas o productos para los que las materias primas de plástico o bien son desconocidos o no están disponibles. Sin embargo, nuestro enfoque no proporciona un método cuantitativo para comparar las tasas de degradación de BDM.

En un estudio reciente 24, cuatro repeticiones cada uno de tres BDMs disponibles comercialmente etiquetados como &quot;biodegradable&quot;, además de un cine experimental y un control convencional de plástico, fueron colocados sobre el suelo como abono orgánico para la producción de tomate en la primavera de 2010 en Mount Vernon, WA, Knoxville, TN, y Lubbock, TX. En el otoño de 2010, las plazas de cine BDM fueron cortadas de cada resistido mulch en cuatro parcelas de reproducción, y el suelo nativo fue ...

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Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture

Las películas de plástico con la etiqueta &quot;biodegradable&quot; están disponibles comercialmente para uso agrícola como coberturas. Labranza representa un método de tratamiento atractiva, pero la degradación en condiciones de campo es poco conocida. El propósito de este estudio fue desarrollar métodos para el aislamiento de hongos del suelo nativo y las bacterias que colonizan las películas de mantillo de plástico después del entierro de campo.

El aislamiento de los microorganismos del suelo nativo con potencial para romper biodegradables Mantillo películas de plástico utilizados en la agricultura

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to ...

isolation-native-soil-microorganisms-with-potential-for-breaking-down

Research

JoVE Journal

Biology

30.4K vistas.  Western Washington University. Las películas de plástico con la etiqueta "biodegradable" están disponibles comercialmente para uso agrícola como coberturas. Labranza representa un método de tratamiento atractiva, pero la degradación en condiciones de campo es poco conocida. El propósito de este estudio fue desarrollar métodos para el aislamiento de hongos del suelo nativo y las bacterias que colonizan las películas de mantillo de plástico después del entierro de campo.

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Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plástico inclusión y corte de Xenopus laevis embriones

Investigación

Biología

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

El aislamiento de protoplastos a partir de tejidos de 14 días de edad de las plántulas Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) plasmid. A. rhizogenes can cause hairy root formation on plant tissues and form composite plants after transformation. On these composite plants, some of the regenerated roots are transgenic, carrying the wild type T-DNA and the engineered binary vector; while the shoots are still non-transgenic, serving to provide energy and growth support. These hairy root composite plants will not produce transgenic seeds, but there are a number of important features that make these composite plants very useful in plant research. First, with a broad host range,A. rhizogenes can transform many plant species, especially dicots, allowing genetic engineering in a variety of species. Second, A. rhizogenes infect tissues and explants directly; no tissue cultures prior to transformation is necessary to obtain composite plants, making them ideal for transforming recalcitrant plant species. Moreover, transgenic root tissues can be generated in a matter of weeks. For Medicago truncatula, we can obtain transgenic roots in as short as three weeks, faster than normal floral dip Arabidopsis transformation. Overall, the hairy root composite plant technology is a versatile and useful tool to study gene functions and root related-phenotypes. Here we demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species M. truncatula.

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

We demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species Medicago truncatula.

Generación de plantas compuestas en Medicago truncatula Utilizado para los ensayos nodulación

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy to use and widely utilized by laboratories analyzing the adipogenic potential of mesenchymal cells. However, they are not specific to changes in gene transcription. We have developed a gene-specific differentiation assay to analyze when a mesenchymal cell has switched its fate to an adipogenic lineage. Immuno-labelling against fatty acid binding protein-4 (FABP4), a lineage-specific marker of adipogenic differentiation, enabled visualization and quantification of differentiated cells. The ability to quantify adipogenic differentiation potential of mesenchymal cells in a 96 well microplate format has promising implications for a number of applications. Hundreds of clinical trials involve the use of adult mesenchymal stromal cells and it is currently difficult to correlate therapeutic outcomes within and especially between such clinical trials. This simple high-throughput FABP4 assay provides a quantitative assay for assessing the differentiation potential of patient-derived cells and is a robust tool for comparing different isolation and expansion methods. This is particularly important given the increasing recognition of the heterogeneity of the cells being administered to patients in mesenchymal cell products. The assay also has potential utility in high throughput drug screening, particularly in obesity and pre-diabetes research.

Traditional methods of assessing adipogenic differentiation are cheap and easy to use, but are not specific to changes in gene expression. We have developed an assay to quantify mesenchymal cell differentiation into mature adipocytes using a lineage specific marker. This assay has diverse applications across basic research and clinical medicine.

Visualización y cuantificación del potencial de la diferenciación de células mesenquimales Adipogenic con un marcador específico de linaje

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Técnicas de microescala Phenotyping de maíz haces vasculares basados en tomografía de rayos x Microcomputed

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Repeatable Stair-step Assay to Access the Allelopathic Potential of Weedy Rice (Oryza sativa ssp.)

Weed competition contributes significantly to yield losses in cropping systems worldwide. The evolution of resistance in many weed species to continuously applied herbicides has presented the need for additional management methods. Allelopathy is a physiological process that some plant species possess that provide the plant with an advantage over its neighbors. Allelopathic crop varieties would be equipped with the ability to suppress the growth of surrounding competitors, thus reducing potential yield loss due to weed interference. This paper focuses on the construction and operation of a stair-step assay used for the screening of the allelopathic potential of a donor species (Oryza sativa) against a receiver weed species (Echinochloa crus-galli) in a greenhouse setting. The structure described in this paper serves as a stand for the plant samples and incorporates a timed watering system for the accumulation and distribution of allelochemicals. Allelochemicals produced by the plant roots are allowed to flow downward through a series of four pots separately into a collection tank and recycled back to the top plant through electric pumps. This method of screening provides an avenue for the allelochemicals from the donor plant to reach receiver plants without any resource competition, thus allowing quantitative measurement of the allelopathic potential of the selected donor plant. The allelopathic potential is measurable through the height reduction of the receiver plants. Preliminary screening data for the effectiveness of this method demonstrated height reduction in the receiver species, barnyardgrass (E. crus-galli), and thus the presence of allelopathic residues from the donor plant, weedy rice (Oryza sativa).

Repeatable Stair-step Assay to Access the Allelopathic Potential of Weedy Rice Oryza sativa ssp.

Allelopathy has shown promise as a useful supplemental weed control strategy in cropping systems. To determine the allelopathic potential of a desired plant specimen, a stair-step screening method is provided.

Ensayo repetible de escalera para acceder al potencial alelopático del arroz weedy (Oryza sativa ssp.)

Weed competition contributes significantly to yield losses in cropping systems worldwide. The evolution of resistance in many weed species to continuously ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Secuenciación de ARN-Secuenciación de ARN-Captura láser para Análisis de Expresión Genética Espacial y Temporal Específica de Tejidos en Plantas

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Aislamiento de hepatocitos primarios de rata con control de perfusión multiparamétrico

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Aplicación del movimiento pasivo de la cabeza para generar aceleraciones definidas en las cabezas de roedores

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...