Podemos aislar y ensamblar probióticos que pueden promover la salud del coral y al mismo tiempo mitigar el impacto de la contaminación y que pueden contribuir a la persistencia de un arrecife en el mundo cambiante. El enfoque de aislamiento y cribado descrito se puede utilizar para seleccionar microorganismos que presentan actividades metabólicas clave, como la degradación de contaminantes u otras características beneficiosas para organismos marinos como los corales. Este método se puede aplicar para aislar microorganismos capaces de degradar cualquier contaminante.
Y además, otras fuentes de material se pueden utilizar en las otras muestras ambientales como plantas, suelo, agua, cualquier cosa. Estudia la literatura y trata de enfocarte en cepas que pueden ser buenas candidatas para tu propósito. Si es posible, dirija los métodos de aislamiento para esas cepas y evite patógenos conocidos.
Y si usted está tratando de utilizar un consorcio de bacterias, también es muy importante investigar primero si los miembros del consorcio tienen actividad antagónica entre sí. Debido a que los corales están en creciente riesgo de extinción, esta metodología está empezando a iniciarse en todo el mundo y hay una necesidad de difundir y estandarizar el método. Como algunos investigadores de coral no tienen experiencia con la microbiología convencional, es por eso que han estado pidiendo con frecuencia consejos sobre cómo proceder con este enfoque.
Para empezar, desde cada sitio de muestreo específico, utilice botellas estériles con tapas de tornillo para recoger 500 mililitros de agua en triplicado. Si el procesamiento de muestras se está realizando más tarde, mantenga las botellas a cuatro grados centígrados. Utilice un par estéril de alicates y fórceps para cortar fragmentos de coral del mismo sitio de muestreo de las muestras de agua.
Enjuague el fragmento de coral de muestra con 20 mililitros de solución salina estéril al 3% o agua de mar artificial para deshacerse de las bacterias de vida libre que se unen libremente del agua de mar. Usando fórceps, coloque cada fragmento de coral en un recipiente estéril con una tapa de tornillo que contenga solución salina estéril. Usando fórceps y alicates estériles, pesa cinco gramos de fragmentos de coral en platos estériles de Petri en una báscula de pesaje.
Transfiera los cinco gramos de muestra de coral a un mortero estéril y macerarlo usando un pestillo estéril. Utilizando una espátula estéril, transfiera la muestra macerada a un matraz de cultivo estéril que contenga 25 mililitros de solución estéril de cloruro de sodio al 3% y de 10 a 15 perlas de vidrio de 2,5 milímetros. Utilice una solución salina estéril de 20 mililitros para lavar el mortero en el tubo y recuperar la cantidad máxima de macerado.
Para separar microorganismos de diferentes compartimentos de coral, mantenga los matraces bajo agitación constante a 150 g durante 16 horas a la temperatura del agua del sitio de muestreo. Para seleccionar bacterias, primero realice diluciones en serie de hasta 10 a la nueve negativa en solución salina estéril para muestras de coral y hasta 10 a las seis negativas para muestras de agua. Diluciones de pipetas hacia arriba y hacia abajo cinco veces antes de descartar la punta.
Luego vórtice cada uno. Vórtice las muestras durante cinco segundos cada vez antes de realizar la siguiente dilución en serie. Pipetear 100 microlitros de cada dilución en platos Petri que contienen 3%cloruro de sodio caldo de calor medio y úndolos.
Incubar las placas durante uno a tres días a la temperatura objetivo, por ejemplo 26 grados centígrados. Revise los platos una vez al día. Seleccionar y aislar las colonias que presentan distintas morfologías de crecimiento en nuevas placas utilizando la técnica de placa de raya.
Repita este paso tantas veces como sea necesario para tener colonias puras creciendo en las placas. Almacene los aislados a cuatro grados centígrados o en glicerol como se describe en el manuscrito. Para realizar la prueba de la capacidad de degradación EE2, elija una sola colonia de las placas frescas e inocular en dos mililitros de medio LB estéril en un tubo.
En caso de que sea un caldo de glicerol, tomar 10 microlitros de caldo bacteriano de glicerol y rayar sobre placas de agar LB. Incubar a 24 a 28 grados centígrados durante la noche para tener colonias individuales creciendo. Coloque el tubo que contiene el medio LB inclinado bajo agitación constante a 150 veces g a 24 a 28 grados Celsius durante la noche.
Después del crecimiento bacteriano, peletiza las células centrifugándolas a 8.000 veces g durante ocho minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Para lavar el caldo LB restante, agregue dos mililitros de agua salina para resuspender las células.
Repita el lavado dos veces para garantizar que no haya rastros de fuente de carbono. Inocular las células lavadas y resuspendidas en el medio de cultivo mínimo Bushnell Haas que contiene EE2 como la única fuente de carbono. Evalúe el crecimiento bacteriano por densidad óptica en 600 nanómetros y nuestras unidades formadoras de colonias en medio de agar LB después de 16 a 72 horas de incubación.
Para preparar un medio mínimo que contenga una fracción soluble en aceite y agua y una fracción insoluble aceite-agua como única fuente de carbono, agregue 1-2% de petróleo crudo a 500 mililitros de agua destilada estéril en un matraz de filtro que contenga una válvula en la parte inferior. Mantenga el matraz bajo agitación constante a 24 a 28 grados Celsius a 150 veces g durante 48 horas. Después de eso, coloque el matraz sobre una superficie estable y espere de 10 a 20 minutos para permitir que la fracción soluble e insoluble se separe.
A continuación, abra el matraz del filtro inferior para transferir la fracción soluble en aceite y agua a un nuevo matraz estéril ahorrando la fracción insoluble aceite-agua. A continuación, prepare dos botellas de agar bushnell Haas medio mínimo. Autoclave.
Combinar con la fracción soluble en aceite-agua como la única fuente de carbono para hacer 500 mililitros de medio de agar. Haga lo mismo con la fracción insoluble aceite-agua y transfiera aproximadamente 25 mililitros de cada medio a platos individuales de Petri. Para aislar las bacterias degradantes del aceite, reutilice las muestras previamente diluidas y pipetee 100 microlitros de cada dilución en los platos de Petri que contienen medio de agar y úbralos.
Recuerde mantener los controles negativos para sus placas. Incubar los platos durante uno a tres días a la temperatura objetivo y repetir los procedimientos de aislamiento como anteriormente. En este protocolo, los microorganismos fueron aislados de diferentes fuentes de agua y nubbins de coral presentando características putativas de BMC y capaces de degradar diferentes clases de contaminantes.
Utilizando muestras de agua recogidas en una planta de tratamiento de aguas residuales obtenida del Centro Experimental de Saneamiento Ambiental de la Universidad Federal de Río de Janeiro, se aislaron 33 cepas bacterianas capaces de degradar EE2. Además, utilizando la técnica para seleccionar bacterias degradantes del aceite, se aislaron 20 cepas capaces de degradar tanto la fracción soluble en aceite como la fracción insoluble aceite-agua. Las características putativas de BMC se examinaron en microorganismos, entre ellos una cepa que presenta una fuerte actividad antagónica contra el patógeno coral Vibrio cholerae lyticus, se encontraron cepas capaces de degradar la urea, un buen productor de catalasa y microorganismos que presentan genes potencialmente beneficiosos.
Empleando tanto la biorremediación como la inoculación de BMC, fue posible predecir los corales a partir de los impactos de la exposición al petróleo. Un consorcio PBMC biorremediador de petróleo aislado del coral fue inoculado en nubbins de coral expuestos a 1%petróleo. Mostró una mejor capacidad fotoquímica preservada en comparación con la salud del coral sin inoculación.
No deje las muestras a temperatura ambiente durante demasiado tiempo. De lo contrario, la comunidad microbiana puede cambiar y los microbios relacionados con la enfermedad pueden sobrecrecir a otros. El petróleo crudo es tóxico.
Asegúrese de utilizar el equipo de protección personal adecuado cuando trabaje con este o cualquier otro contaminante que decida utilizar. La técnica allanada de forma innovadora en el campo de la restauración de corales y la biorremediación oceánica puede utilizarse potencialmente para minimizar los impactos económicos, ecológicos y sociales causados por el cambio global.
