Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica en áreas innovadoras &quot;Mesoscopic neurocircuitry&quot; (N º 22115002) y &quot;Red de Ciencia del Cerebro Integral&quot; (No. 221S0003) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia, y Tecnología de Japón para la AN y subvención-en-Ayudas a Jóvenes Científicos (B) (N º 21700344), de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP) de Hong Kong

1. Preparación larvas <ol><li> Mantener volar líneas de OK6-Gal4, UAS-ChR2 o OK6-Gal4, UAS-NpHR2 en frascos de plástico que contienen los alimentos marcha estándar. </li><li> Levadura Spread pasta que contiene todo-trans retinal (ATR) en concentraciones adecuadas (1 mM de ChR2, 10 mM de NpHR2 (&quot;NpHR&quot; para abreviar) en una placa de agar jugo de manzana. </li><li> Recoge 2 ª o 3 ª instar larvas de los viales y los puso en el plato ATR que contiene. </li><li> Criarlos a 25 ° C en la oscuridad durante un período adecuado de tiempo (1 día para ChR2, 2 días para NpHR.) </li></ol> 2. Configuración Microscopio <ol><li> Conecte una cámara CCD (XCD-V60, Sony) a un microscopio confocal convencional (en nuestro caso, FV1000, Olympus) con un accesorio de montaje C (ampliación 0.35x). </li><li> Si hay una obturación a lo largo de la trayectoria de la luz de la lente del objetivo a la cámara CCD, que se cierra durante el escaneo láser, quitar con cuidado. Como este paso depende de los microsfrente de configuración, póngase en contacto con el fabricante del microscopio para el apoyo técnico, si es necesario. </li></ol> 3. Disección <ol><li> Enjuague las larvas ATR-alimentados con agua para eliminar restos de alimentos del cuerpo. </li><li> Ponga la larva en un plato recubierto Sylgard, lado dorsal hacia arriba (el lado dorsal tiene dos tubos traqueales que ejecutan longitudinalmente, uno a cada lado de la línea media dorsal). El espesor de la Sylgard es de aproximadamente 5 mm. </li><li> Inserte un pasador de insectos (patas de insectos Austerlitz, Φ0.10mm, acero) en la cola entre los tubos traqueales con forceps (# 5 Inox, FST por Dumont, Suiza). Los pasadores, unos 10 mm de largo, se deben doblar o cortar para ser lo suficientemente corto (~ 2 mm de largo) para evitar golpear y dañar la superficie de la lente del objetivo. A continuación, poner el segundo pasador de insectos en la cabeza de la larva cerca del gancho de la boca, negro garra-como la estructura en el extremo anterior. </li><li> Añadir Ca 2 + solución salina libre normal (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl2 6 mM, HEPES-NaOH 5 mM,Sacarosa 36 mM (pH 7,1)) para mantener la larva húmedo. </li><li> Haga una pequeña incisión cerca de la cola con unas tijeras micro (MB-50-7, Napox, Japón). </li><li> A partir de la incisión, hacer un corte longitudinal a lo largo de la línea media dorsal hacia la cabeza. Tenga cuidado de no dañar el cordón nervioso ventral (VNC) y axones. </li><li> Haga una pequeña incisión en la cabeza lateralmente. </li><li> Coloque 4 clavijas en cada esquina de la bodywall diseccionado. La pared del cuerpo se debe estirar lo suficiente para visualizar un patrón segmentario de la pared del cuerpo, pero no tanto como para impedir movimiento peristáltico. </li><li> Eliminar los órganos internos, excepto para el cerebro y el VNC y enjuagar la muestra con solución salina normal Ca 2 +-libre. </li><li> Ajuste la orientación del cordón nervioso ventral al ser bilateralmente simétrico mediante el cambio de la posición y orientación de los pins de insectos en la pared del cuerpo. Para fijar la posición del cordón nervioso ventral, insertar un pasador a través del tejido entre el cerebro y la boca hacia abajo para enganchar el Sylgard. </li> &lt;li&gt; Reemplazar el buffer con 2 mM Ca 2 + solución de Ringer (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, MgCl 2 2 mM, CaCl2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, sacarosa 36 mM (pH 7,3)). </li></ol> 4. De imágenes con láser de iluminación <ol><li> Adjuntar una lente objetivo seco 4x (UPlanSApo 4x, NA 0.16, Olympus, Japón) en el microscopio confocal y establecer la preparación larva en el escenario. </li><li> Obtener una imagen de transmisión de la preparación disecada con un láser rojo (633 nm) para localizar el cordón nervioso ventral mediante microscopio confocal. Para este análisis, asegúrese de no utilizar un láser de 488nm o 559nm, que induce la estimulación no deseada de ChR2 o NpHR, respectivamente. </li><li> Definir la región de interés (ROI) en la imagen de transmisión. Modo zoom podría ser útil para la determinación detallada de la ROI. </li><li> Cambiar el conjunto de filtros del microscopio para iluminar con la luz 488nm o 559nm. </li><li> Ilumine la preparación con una lámpara halógena para visualizar la pared del cuerpo. Thpreparación de correo puede ser controlado con una cámara CCD adjunta al microscopio confocal. </li><li> Registre el movimiento de la pared del cuerpo y conmutar el haz de láser dentro y fuera mientras se monitoriza el movimiento. </li></ol>

<ol>
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No hay conflictos de interés declarado.

Perturbación temporal y local de la actividad neuronal es una técnica muy valiosa para el análisis de la dinámica de la red de circuitos neuronales. En este protocolo, se presenta un método para manipular la actividad neuronal mediante la optogenética utilizando un láser. Alta direccionalidad del láser permite la estimulación optogenética más localizada que la estimulación de campo amplio uso de mercurio o la lámpara de xenón. Aunque iluminaciones láser ya se han aplicado a la optogenética en los estudios anteriores, las configuraciones especiales tales como fibra de vidrio, micromanipulador, y la fuente de láser, se requieren en la mayoría de estudios anteriores. En este protocolo, se utiliza un microscopio confocal convencional para la iluminación local. Dado que el sistema de microscopio confocal es ampliamente utilizado, este método se abrirá la oportunidad de aplicar la optogenética de mayor resolución en muchos laboratorios. El protocolo tiene dos puntos críticos: la disección de larvas y la potencia del láser. En primer lugar, si el cerebro, el cordón nervioso ventral o un nervio motor está dañado duridisección ng, las larvas presentan menos o ninguno movimiento peristáltico espontánea. Por lo tanto, la precisión es esencial, especialmente cuando se hace una incisión en el lado dorsal con tijeras de primavera y la eliminación de los órganos internos con fórceps. Detalles acerca de la disección se ha informado anteriormente 21. En segundo lugar, si la estimulación es suficiente para ser logrado, una potencia de láser de alrededor de 0,1 ~ 1 mW / mm 2 para ChR2 o 1 se requiere ~ 10 mW / mm 2 para NpHR. Se evaluó la potencia del láser como la potencia total de la luz por debajo de una lente de objetivo dividido por una superficie estimada de iluminación. Se midió la potencia total de la luz usando un medidor de potencia (mobiken, Sanwa MI Technos, Japón). Se estimó la superficie de iluminación que circular la constante del cuadrado de la longitud de onda del láser, que más o menos da área iluminada en límite de difracción. Poder eficaz de la iluminación en la muestra se puede ajustar no sólo por la potencia de la salida del láser, sino también por el cambio de la velocidad de exploración y entumecidoer de repeticiones. Se examinaron láser con 20-100 microsegundos / pixel de 63 veces. Además, el nivel de expresión de la optogenética proteína y la cantidad de ATR también son críticas para la eficiencia de la estimulación. En consecuencia, si las larvas no mostró respuesta optogenética, los siguientes puntos deben ser revisados ​​y corregidos: 1) la potencia del láser (mediante la optimización de sistema de microscopio), 2) el nivel de expresión de la proteína optogenética (marcando genotipo y temperatura de cría), y 3) la cantidad de ATR (mediante el ajuste de la concentración de ATR y período de alimentación). NpHR requiere mayor concentración de ATR que ChR2 hace por razones desconocidas 13. ChR2 funciona bien en larvas criadas en alimentos que contienen menor ATR (por ejemplo, 0,1 mm) que se describe aquí (1 mM). Como la alimentación de las larvas a 1 mM ATR es suficiente para hacer ChR2 foto-reactivo, se recomienda esta concentración para el primer juicio en ChR2 experimentos. La concentración de ATR posteriormente se puede titular por debajo de 1 mM. En cuanto a la duración de la exposición de ATR, le recomendamosla duración se describe aquí para el control de optogenético robusta. A menudo fallamos en observar la respuesta optogenetic cuando se alimentan las larvas de ATR de menor duración. En este protocolo, iluminación con láser y la adquisición de imágenes son operados por un equipo independiente. Por lo tanto, la detección clara del patrón espacio-temporal de iluminación láser por la cámara CCD es fundamental para el análisis de datos. Si el punto del láser o de la línea es tenue imagen CCD, usted debe optimizar la potencia de la lámpara halógena y el valor de la ganancia de la cámara CCD para visualizar la iluminación láser manteniendo pared del cuerpo visible. Iluminación Spatiotemporal muestra en este protocolo proporciona información sobre circuitos de motores de larvas, sin embargo, el método tiene algunas limitaciones. En cuanto al aspecto &quot;espacial&quot;, la ubicación de la iluminación se graba la imagen CCD de bajo aumento que se usa para grabar en vídeo los movimientos de la pared del cuerpo de. En consecuencia, el área de iluminación puede ser asignado a nivel de segmento, pero no a nivel celular. En cuanto a la &quot;temporal &quot;aspecto, lapso de tiempo entre el cambio en la exploración por láser microscopio confocal y la iluminación por láser depende del sistema de microscopio confocal de barrido y condiciones. Por consiguiente, se requiere algunas pruebas por prueba y error para ajustar la sincronización de iluminación. Desde el momento de la iluminación puede se determinará de imagen CCD de películas con el software adecuado como ImageJ, el factor crítico en la resolución temporal es la velocidad de fotogramas de la cámara de imagen CCD. Normalmente nos fijamos la velocidad de fotogramas de 7,5 a 15 fotogramas por segundo. Los avances en herramientas optogenetic nos dan la oportunidad de modificar este protocolo. Utilizamos 3 º estadio las larvas poseen OK6-Gal4 y UAS-ChR2 [H134R] o UAS-NpHR2. Otras herramientas optogenética en lugar de ChR2 [H134R] o NpHR2 como ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 o Arch pueden aumentar la eficiencia de la actividad de control 22. Además, el uso de otras líneas Gal4 o analizar en otras etapas de desarrollo puede dar más información acerca de la circui motorts. En este protocolo, la actividad motora se controló por imágenes de transmisión de la contracción bodywall con una cámara CCD. La actividad de las neuronas motoras con moléculas fluorescentes sensibles al calcio (por ejemplo GCaMP) también se puede controlar directamente, mientras que la manipulación de la actividad neuronal con ChR2 o NpHR. En este caso, iluminación de luz azul en un área amplia y una cámara CCD de alta sensibilidad (por ejemplo, cámara EMCCD) se utiliza en lugar de una lámpara de halógeno y la cámara CCD normales se ha descrito anteriormente en este documento. Para mejorar la resolución espacial de la estimulación durante la monitorización movimiento bodywall, utilizando una lente de objetivo adicional puede ser un método más avanzado: iluminación del cordón nervioso ventral por una lente de objetivo de gran aumento (por ejemplo, 40x) de encima de la muestra y el seguimiento bodywall por la lente de bajo aumento (por ejemplo, 4x) debajo de la muestra. Este sistema de doble lente puede permitirnos para estimular el sistema nervioso de una mayor resolución espacial. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; El protocolo que se muestra aquí se puede aplicar a otros circuitos neuronales, herramientas optogenetic proporcionadas pueden ser expresados ​​en el sistema nervioso y preparación en la que luz suficiente puede ser entregado en el tejido neural se pueden establecer.

Locomoción Delantero peristáltica en larvas de Drosophila se produce por la propagación de la contracción muscular de posterior a segmentos anteriores. Este movimiento se realiza por la activación secuencial de las neuronas motoras en el cordón nervioso ventral a lo largo del eje del cuerpo longitudinal. Para examinar el circuito detrás de esta actividad de propagación modelado, perturbaciones locales de la actividad neuronal podría ser un enfoque informativo. A pesar de ensayo farmacológico puede controlar sustancia específica, tales como neurotransmisores, en el tejido neural, el efecto de los fármacos farmacológicos puede ser similar entre los segmentos casi todos debido a que el cordón nervioso ventral larvas es estructura repetitiva compuesto de neuromeres similares a lo largo del eje longitudinal. Alternativamente, se podría expresar optogenético o moléculas de la sonda sensibles a la temperatura en un pequeño número de segmentos. Sin embargo, tales GAL4 líneas específicas son muy difíciles de generar. Aquí presentamos un método para manipular las neuronas en pocos segmentos utilizando iluminación láser. Tomando ventaja de la iluminación espacialmente confinados en microscopía confocal, se puede perturbar la actividad de las neuronas en un área local. Combinado con el patrón de expresión de la sonda por subconjuntos de GAL4 líneas específicos de neuronas, este método de iluminación con láser mejora en gran medida la resolución espacial de la perturbación. Y debido a que este método sólo requiere de un microscopio confocal convencional, la compra de equipo de laboratorio adicional no suele ser necesario. Usando esta técnica, se examinó el papel de la actividad neuronal del motor durante la propagación de la salida del motor 13. Mediante el bloqueo de la actividad de las neuronas motoras en algunos segmentos durante el movimiento peristáltico, hemos podido comprobar si es necesaria la actividad de las propias neuronas motoras para la propagación de la señal de salida del motor. Bloqueo local y transitoria de las neuronas motoras detenido la propagación del movimiento peristáltico. Después de retirar el bloqueo, propagation apareció en el segmento en el que la ola había sido detenido. Este fenómeno sugiere que sin la activación de las neuronas motoras, la onda de propagación no puede progresar a lo largo del cordón nervioso ventral más lejos, y por lo tanto es necesario para el movimiento peristáltico de la activación de las neuronas motoras. Hemos informado anteriormente de datos detallados y debates sobre este fenómeno en Inada et al. (2011) 13. Aquí, se describe el método para perturbar la actividad neuronal interactiva mientras se monitoriza el movimiento de las larvas diseccionado. Usando varias líneas GAL4 y series de patrones espacio-temporales para la manipulación de la actividad, se puede investigar la lógica de circuitos a través de las propiedades de respuesta de perturbación del circuito del motor.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td >Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BX61WI Microscope</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>BX61WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoview FV1000 confocal system</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>FV1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCD camera</td>
 <td>Sony</td>
 <td>XCD-V60</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>all-trans retinal</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R2500-500MG</td>
 <td>200 mM stock in 95% EtOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silpot184</td>
 <td>Dow Corning Toray</td>
 <td>3255981</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

optogenetic perturbation of neural activity with laser illumination in semi-intact drosophila larvae in motion

Larvas de Drosophila locomoción es un sistema modelo espléndida en desarrollo y fisiológicos neurociencia, en virtud de la accesibilidad genética de los componentes neuronales subyacentes en los circuitos de 1-6. Aplicación de la optogenética 7,8 en el circuito neural larval nos permite manipular la actividad neuronal de manera estampadas espacial y temporalmente 9-13. Típicamente, las muestras son ampliamente iluminadas con una lámpara de mercurio o LED, por lo que la especificidad de las neuronas diana es controlado por binarios sistemas de expresión de genes tales como el sistema Gal4-UAS 14,15. En este trabajo, para mejorar la resolución espacial de &quot;resolución sub-genética&quot;, que localmente iluminados un subconjunto de neuronas en el cordón nervioso ventral utilizando láseres implementados en un microscopio confocal convencional. Mientras controla el movimiento de la pared del cuerpo de las larvas semi-intacta, que forma interactiva activada o inhibe la actividad neuronal con canalrodopsina 16,17 Or halorhodopsina 18-20, respectivamente. Por iluminación espacialmente y temporalmente restringida del tejido neural, podemos manipular la actividad de las neuronas específicas en el circuito en una fase específica de la conducta. Este método es útil para el estudio de la relación entre las actividades de un conjunto neuronal local en el cordón nervioso ventral y el patrón espacio-temporal de la salida del motor.

<html> Activación local y transitoria de las neuronas motoras con ChR2. Expresamos ChR2 en las neuronas motoras. Los axones de las neuronas motoras que salen de cada proyecto segmento VNC a un segmento correspondiente de la pared del cuerpo. Cuando estimulamos uno o dos segmentos de la VNC con un láser azul, los músculos en los segmentos correspondientes exhibieron contracciones (Figura 1). La inhibición local y transitoria de las neuronas motoras con NpHR. Expresamos NpHR en las neuronas motoras. Cuando estimulamos unos (1 ~ 2) segmentos de la VNC con un láser de color amarillo durante las contracciones musculares peristálticos, la onda de propagación fue detenido en los segmentos correspondientes de la pared del cuerpo (Figura 2). Luego la ola reinicia desde los segmentos detenidos cuando cambiamos la iluminación del láser 13. 50513fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;fo: content-width =&quot; 5.5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Activación local de las neuronas motoras con ChR2. A. Esquema de la activación local de la preparación de filetes. Mediante la iluminación de luz azul de algunos segmentos del cordón nervioso ventral ChR2 expresan en las neuronas motoras, los músculos de los segmentos correspondientes son contratados (cabeza de flecha). B. Las imágenes de transmisión de una larva diseccionado. Iluminación local del cordón nervioso ventral (cabezas de flecha) induce la contracción segmentaria de músculos de la pared del cuerpo (flechas). <img src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2highres.jpg"/> Figura 2. La inhibición local de las neuronas motoras con NpHR. A. Esquema de la inhibición local de la preparación de filetes. Por amarillo-liluminación ight de algunos segmentos del cordón nervioso ventral NpHR expresan en las neuronas motoras, los músculos durante la contracción espontánea-producido movimiento peristáltico (punta de flecha en la parte superior) están relajados (punta de flecha en la parte inferior.) B. Transmisión de imágenes de una larva diseccionado . Iluminación Local del cordón nervioso ventral (puntas de flecha) relajó los segmentos de pared del cuerpo espontáneamente contratados (flechas).

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Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Aquí se describe un protocolo para la manipulación optogenética de la actividad motoneuronal mientras monitoriza los cambios en la salida del motor (contracción muscular) en semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas de uso de láser dentro de un microscopio confocal convencional. Esta técnica permite a los investigadores para lograr perturbación local de la actividad neuronal en algunas neuromeres para dilucidar la dinámica de circuitos de motor.

Optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

optogenetic-perturbation-neural-activity-with-laser-illumination-semi

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

11.5K vistas.  The University of Tokyo. Aquí se describe un protocolo para la manipulación optogenética de la actividad motoneuronal mientras monitoriza los cambios en la salida del motor (contracción muscular) en semi-intacta Drosophila Larvas de uso de láser dentro de un microscopio confocal convencional. Esta técnica permite a los investigadores para lograr perturbación local de la actividad neuronal en algunas neuromeres para dilucidar la dinámica de circuitos de motor.

Video: Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

En vivo láser axotomía en C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Investigación

Neurociencias

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Métodos locales y globales de evaluación de nocicepción térmica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualización de los propioceptores<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas y pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Apetitivo aprendizaje asociativo olfativa en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt;) Circuitos olfativas

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

Actividad neural propagación en una preparación del hipocampo Desplegado con un penetrante Micro-electrodo de matriz

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Ensayo novedoso para la nocicepción en frío<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.