Bu çalışma Yenilikçi Alanlar Bilimsel Araştırma için Hibe-in-Aid tarafından desteklenmiştir &quot;Mezoskopik Neurocircuitry&quot; (No 22.115.002) ve Eğitim, Kültür, Spor, Bilim Bakanlığı &quot;Kapsamlı Beyin Bilim Ağı&quot; (No 221S0003), ve Teknoloji, Japonya AN ve Grant-in-Aid Bilim Teşvik Japonya Derneği Genç Bilginler için (B) (No 21.700.344) (JSPS) HK ile

1. Larva Hazırlık <ol><li> Standart uçmak yiyecek içeren plastik şişeleri UAS-ChR2 veya OK6-Gal4, UAS-NpHR2, OK6-Gal4 hatları uçmak koruyun. </li><li> Yayılmasını maya uygun konsantrasyonlarda (ChR2 için 1 mM, bir elma suyu agar plaka üzerinde NpHR2 (kısaca &quot;NpHR&quot;) için 10 mM (ATR) all-trans retinal içeren yapıştırın. </li><li> Flakonlarından 2. veya 3. evre larvaları almak ve ATR içeren plaka üzerine koydu. </li><li> 25 arka bunların uygun bir zaman dönemi boyunca karanlıkta ° C (NpHR için CHR2 2 gün için 1 gün önce). </li></ol> 2. Mikroskop Kurulum <ol><li> C-montaj eki (büyütme 0.35x) ile geleneksel bir konfokal mikroskop (bizim durumumuzda, FV1000, Olympus) bir CCD kamera (XCD-V60, Sony) takın. </li><li> Objektif lens lazer tarama sırasında kapanır CCD kamera, için ışık yolu boyunca bir çekim varsa, dikkatlice çıkarın. Bu adım, MICROS bağlı olarakGerekirse kurulum baş, teknik destek için mikroskop üreticisine başvurun. </li></ol> 3. Teşrih <ol><li> Vücuttan kalan gıda çıkarmak için su ile ATR beslemeli larva durulayın. </li><li> Bir sylgard kaplı çanak, dorsal yüzü yukarı (dorsal yüzü, dorsal orta hat her iki tarafında bir uzunlamasına çalışan iki trakeal tüp vardır) üzerinde larva koymak. Sylgard kalınlığı yaklaşık 5mm. </li><li> Forseps (# 5 Inox, Dumont tarafından FST, İsviçre) ile trakeal tüpler arasındaki kuyruk içine bir böcek pin (Austerlitz Böcek işaretçilerine, Φ0.10mm, paslanmaz) takın. Işaretçilerine, 10mm uzunluğunda, bükülmüş ya da objektif lens yüzeyine isabet ve hasar görmesini önlemek için (~ 2 mm uzun) kadar kısa olduğu kesilmelidir. Daha sonra ağız kanca, ön sonunda siyah pençe benzeri bir yapı yakın larva başkanı içine ikinci böcek pin koydu. </li><li> Ca2 + içermeyen normal tuzlu su (140 mM NaCl, 2 mM KCI, 6 mM MgCl2, HEPES-NaOH, 5 mM, eklemeLarva nemli tutmak için sakaroz 36 mM (pH7.1)). </li><li> Mikro makas (MB-50-7, Napox, Japonya) ile kuyruk yakın küçük bir kesi yapmak. </li><li> Kesi itibaren, baş doğru dorsal orta hat boyunca uzunlamasına bir kesim yapmak. Ventral sinir kablosu (VNC) ve akson zarar vermemeye dikkat edin. </li><li> Yanal başında küçük bir kesi yapmak. </li><li> Disseke bodywall her köşesinde 4 işaretçilerine yerleştirin. Gövde duvarı, gövde duvarının bir segment paterninin kadar uzanan, ancak peristaltik hareketi engellemek için çok fazla olmalıdır. </li><li> Beyin ve VNC hariç iç organları çıkarın ve + içermeyen normal tuzlu su Ca 2 örnek yıkayın. </li><li> Vücut duvarı üzerinde böcek işaretçilerine yerini ve yönünü değiştirerek iki taraflı simetrik olarak ventral sinir kablosu yönünü ayarlayın. Ventral sinir kablosunun konumunu düzeltmek için, sylgard aşağı kanca beyin ve ağız arasındaki doku ile bir iğne takın. </li> &lt;li&gt; 2 mM tampon yerine Ca2 + Ringer çözeltisi (130 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, HEPES-NaOH, 5 mM, Sükroz 36 mM (pH7.3)). </li></ol> 4. Lazer Aydınlatma ile Görüntüleme <ol><li> Konfokal mikroskop bir 4x kuru objektif lens (UPlanSApo 4x, NA 0.16, Olympus, Japonya) takın ve sahnede larva hazırlık ayarlayın. </li><li> Konfokal mikroskop ile ventral sinir kablosu bulmak için kırmızı bir lazer (633nm) ile disseke hazırlık iletim görüntü elde. Bu tarama için, sırasıyla, ChR2 veya NpHR istenmeyen uyarılması neden bir 488nm veya 559nm lazer, kullanmak için değil emin olun. </li><li> Iletim görüntü faiz (ROI) bölgesinde tanımlayın. Zoomed modu ROI ayrıntılı belirlenmesi için yararlı olabilir. </li><li> 488nm veya 559nm ışıkla aydınlatmak için mikroskop filtre seti değiştirin. </li><li> Vücut duvarı görselleştirmek için bir halojen lamba ile hazırlık aydınlatın. ThE hazırlanması konfokal mikroskop bağlı bir CCD kamera ile izlenebilir. </li><li> Vücut duvarı hareketini kaydedin ve hareket izlerken üzerinde lazer ışını geçiş ve kapalı. </li></ol>

<ol>
	<li>Cattaert, D., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+the+central+generator+of+locomotor+rhythm+by+noncompetitive+NMDA+receptor+antagonists+in+Drosophila+larvae.">Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).</li><li>Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+and+modulation+of+locomotion+pattern+generators+in+Drosophila+larvae:+effects+of+altered+biogenic+amine+levels+by+the+tyramine+beta+hydroxlyase+mutation.">Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation.</a> J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).</li><li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion.">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+sensation+during+orientation+behavior+in+the+Drosophila+larva:+more+sense+than.">Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nat. Methods. , (2012).</li><li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input.">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li><li>Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+control+of+genetically+designated+neurons+in+functioning+circuits.">Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).</li><li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li><li>Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+neuronal+activation+by+Channelrhodopsin-2+and+TRPA1+determine+behavioral+output+in+Drosophila+larvae.">Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae.</a> J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).</li><li>Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+teaching+laboratory:+using+channelrhodopsin-2+to+study+the+neural+basis+of+behavior+and+synaptic+physiology+in+Drosophila.">Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila.</a> Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).</li><li>Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+dissection+of+neural+circuits+responsible+for+Drosophila+larval+locomotion+with+halorhodopsin.">Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin.</a> PLoS One. 6, e29019 (2011).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72, 202-230 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).</li><li>Hildebrand, E., Dencher, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+photosystems+controlling+behavioural+responses+of+Halobacterium+halobium.">Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium.</a> Nature. 257, 46-48 (1975).</li><li>Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+long-lifetime+photointermediate+of+s-rhodopsin+is+a+receptor+for+negative+phototaxis+in+Halobacterium+halobium.">Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J. Vis. Exp. (24), e1107 (2009).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Nöral aktivitenin zamansal ve yerel pertürbasyon nöral devrelerin ağ dinamiklerini analiz etmek için paha biçilmez bir tekniktir. Bu protokol, bir lazer kullanarak optogenetics ile sinirsel aktivite işlemek için bir yöntem mevcut. Lazer yüksek yön cıva veya Xenon lamba kullanarak geniş alan stimülasyonu daha lokalize optogenetic stimülasyon sağlar. Lazer aydınlatma daha önceki çalışmalarda optogenetics uygulanmış olmasına rağmen, bu tür cam elyaf, mikromanipülatör ve lazer kaynağı, gibi özel kurulumları en önceki çalışmalarda gereklidir. Bu protokol, yerel aydınlatma için geleneksel bir konfokal mikroskobu kullanın. Konfokal mikroskop sistemi yaygın olarak kullanıldığı için, bu yöntem birçok laboratuvarlarında yüksek çözünürlük optogenetics uygulama fırsatı açılacaktır. Larva diseksiyonu ve lazer güç: Protokol iki kritik nokta vardır. İlk olarak, beyin, ventral sinir kablosu veya motor sinir Duri bozuksang diseksiyonu, larva az sergilemek ya da hiç kendiliğinden peristaltik hareket olacaktır. Hassas yaylı makas ile sırt tarafında bir kesi yapmak ve forseps ile iç organların çıkarılması, özellikle de bu nedenle önemlidir. Diseksiyonu ilgili ayrıntılar daha önce 21 bildirilmiştir. İkincisi, eğer yeterli uyarım, yaklaşık 0.1 bir lazer gücü ~ ChR2 veya 1 NpHR için ~ 10 mW / mm 2 &#39;gereklidir boyunca 1 mW / mm 2&#39; ulaşılacak. Biz aydınlatma tahmini alanına bölünmesiyle objektif lens altında toplam hafif güç olarak lazer güç değerlendirilmiştir. Biz bir güç ölçer (mobiken, Sanwa MI Technos, Japonya) kullanılarak toplam ışık gücü ölçülmüştür. Biz dairesel sabit kez kabaca kırınım sınırı ışıklı alanı veren lazer dalga boyu, karesi olarak aydınlatma alanında tahmin. Örnek üzerinde etkili aydınlatma gücü tarama hızı ve uyuşmuş değiştirerek de lazer çıkış gücü ile sadece ayarlanabilir, ama olabilirtekrar er. Biz 63 kez 20-100 mikrosaniye / piksel ile lazer taraması yapmıştır. Buna ek olarak, optogenetik protein ve ATR miktarı ifade seviyesi, aynı zamanda verimlilik uyarılması için kritik öneme sahiptir. Lazer gücü (mikroskop sistemi optimize ederek), 2) optogenetics protein ekspresyon seviyesi (genotip ve yetiştirme sıcaklığı kontrol ederek), ve 3) miktarı: 1) larvaları yok optogenetic tepki gösterdi Buna göre, aşağıdaki noktaları kontrol ve düzeltilmelidir ATR (ATR konsantrasyonu ayarlama ve dönem besleyerek). NpHR 13 bilinmeyen nedenlerle ChR2 göre daha ATR yüksek konsantrasyon gerektirir. ChR2 burada açıklanan daha az ATR (örneğin 0.1 mM) (1 mM) içeren gıda yetiştirilen larva iyi çalışır. 1 mM ATR için larva besleme ChR2 fotoğraf reaktif yapmak için yeterli olduğu gibi, biz ChR2 deneylerde ilk deneme için bu konsantrasyon tavsiye. ATR konsantrasyonu, daha sonra, 1 mM aşağı titre edilebilir. ATR için maruz kalma süresi ile ilgili olarak, öneririzsüresi sağlam optogenetic kontrolü için burada açıklanan. Biz sık sık kısa süreli için ATR için larva beslerken optogenetic yanıt gözlemlemek için başarısız oldu. Bu protokol, lazer aydınlatma ve görüntü elde etme ayrı bir bilgisayar tarafından işletilmektedir. Yani, CCD kamera tarafından lazer aydınlatma uzaysal desen net algılama veri analizi için önemlidir. Lazer nokta veya çizgi CCD görüntü loş ise, halojen lamba ve vücut duvarı görünür tutarken lazer aydınlatma görselleştirmek için CCD kamera kazanç değerini gücünü optimize gerekir. Bu protokolde gösterilen Spatiotemporal aydınlatma larva motor devreleri hakkında bilgi verir, ancak yöntem bazı sınırlamalar vardır. Olarak &quot;mekansal&quot; yönü, aydınlatma yeri vücut duvarı hareketleri videoya için kullanılan düşük büyütme CCD görüntü tarafından kaydedilir. Buna göre, aydınlatma alanı hücresel düzeyde segmenti düzeyinde atanan, ancak olabilir. &quot;T itibarıylaLazer ile konfokal mikroskop ve aydınlatma ile lazer tarama geçiş arasında emporal &quot;yönü, zaman farkı konfokal mikroskop sistemi ve tarama durumuna bağlıdır. Sonuç olarak, deneme yanılma ile bazı test aydınlatma zamanlama ayarlamak için gereklidir. aydınlatma zamanlaması olabilir beri ImageJ gibi yeterli yazılım kullanarak CCD görüntü filmlerde belirlenecek, zamansal çözünürlükte kritik bir faktör CCD kamera görüntüleme çerçeve oranıdır. Biz genellikle saniyede 7.5-15 kare için kare hızını ayarlamak. Optogenetic araçları gelişmeler bize bu protokolü değiştirmek için bir şans sağlar. Biz 3 instar OK6-Gal4 sahip larva ve UAS-ChR2 [H134R] veya UAS-NpHR2 kullanılır. Yerine ChR2 Diğer optogenetic araçları [H134R] veya NpHR2 gibi ChR2 gibi [T159C/E123T], NpHR3 veya Arch faaliyet kontrolü 22 verimini artırabilir. Buna ek olarak, diğer gal4 hatlarını kullanarak ya da diğer gelişimsel aşamada analiz motor circui hakkında daha fazla bilgi verebilirts. Bu protokol, motor aktivite bir CCD kamera ile bodywall daralma iletim görüntüleri ile izlenmiştir. ChR2 veya NpHR ile sinir aktivitesi işlenirken kalsiyuma duyarlı fluoresan moleküller (örneğin GCaMP) ile motor nöron aktivitesi aynı zamanda doğrudan izlenebilir. Bu durumda, geniş bir alanı ve son derece hassas bir CCD kamera (örneğin EMCCD kamera) mavi ışık, aydınlatma, bir halojen lamba yerine kullanılabilir ve normal CCD kamera, burada daha önce tarif edilmiştir. Düşük büyütme lens ile örnek ve izleme bodywall yukarıdan bir yüksek büyütme objektif lens (örneğin 40x) ile ventral sinir kablosunun aydınlatma: ek objektif lens kullanarak izleme bodywall hareketi, daha gelişmiş bir yöntem olabilir iken stimülasyon uzaysal çözünürlüğü artırmak için (örneğin 4x) örneği aşağıda. Bu çift lens sistemi bize daha yüksek uzaysal çözünürlükte sinir sistemini uyarmak için izin verebilir. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Burada gösterilen protokol, diğer sinir devreleri uygulanabilir, Resim Optogenetic araçları sinir sisteminde ifade edilebilir ve yeterli ışık nöral dokuya teslim edilebildiği içerisinde preparasyon kurulabilir.

Drosophila larvaları ileri peristaltik hareket anterior segment posterior gelen kas kasılması yayılması ile oluşur. Bu hareket, uzunlamasına gövde ekseni boyunca ventral sinir kablosu olan motor nöron sıralı aktivasyonu ile gerçekleştirilir. Bu desenli yayılan etkinlik arkasındaki devre incelemek için, nöral aktivitenin yerel pertürbasyon bilgilendirici bir yaklaşım olabilir. Farmakolojik tahlil sinir dokusu gibi belirli bir nörotransmitter olarak madde, kontrol rağmen larva ventral sinir kablosunun boyuna ekseni boyunca benzer neuromeres oluşan tekrarlanan yapı olduğu için, farmakolojik ilaçların etkisi hemen hemen tüm kesimleri arasında benzer olabilir. Alternatif olarak, tek bir segment az sayıda Optogenetic veya ısıya duyarlı prob molekülleri ifade olabilir. Bununla birlikte, bu tür özel Gal4 hatları oluşturmak için çok zordur. Burada birkaç seg nöronların işlemek için bir yöntem mevcutlazer aydınlatma kullanarak ments. Konfokal mikroskopi mekansal sınırlı aydınlatma yararlanarak, bir bir yerel alan nöronların aktivitesini karıştırmayı olabilir. Nöron spesifik gal4 hatlarının alt tarafından prob ifade desen ile birlikte, bu lazer aydınlatma yöntemi büyük ölçüde pertürbasyon için uzaysal çözünürlüğü artırır. Bu yöntem, sadece geleneksel bir konfokal mikroskop gerektirdiğinden ve ek laboratuar ekipmanları satın tipik olarak gerekli değildir. Bu tekniği kullanarak, motor çıkışı 13 ve yayılma esnasında motor nöron aktivitesi rolü incelenmiştir. Peristaltik hareket sırasında birkaç segment içinde motor nöronların faaliyetlerini engelleyerek, biz motor nöronların kendilerini faaliyet motor çıkış sinyalinin yayılması için gerekli olup olmadığını test etmek için başardık. Motor nöronların yerel ve geçici abluka peristaltik hareket yayılma tutuklandı. Blokajı uzaklaştırıldıktan sonra, propagation dalga tutuklanan segment ortaya çıktı. Bu olgu, motor nöronu aktivasyonsuz propagative dalga başka ventral sinir kord boyunca ilerleme olamaz olduğunu göstermektedir ve bu nedenle motor nöronların aktivasyonu peristaltik hareket için gereklidir. Biz daha önce Inada ve arkadaşları. (2011) 13 ayrıntılı veriler ve bu fenomen hakkında tartışmalar bildirdin. Burada, biz disseke larvaların hareket izlerken interaktif sinirsel etkinlik karıştırmayı için yöntem açıklanmaktadır. Çeşitli gal4 hatları ve aktivite manipülasyon için uzaysal desen dizi kullanarak, bir motorun devre pertürbasyon yanıt özellikleri ile devre mantığı araştırabilirsiniz.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td >Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BX61WI Microscope</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>BX61WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoview FV1000 confocal system</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>FV1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCD camera</td>
 <td>Sony</td>
 <td>XCD-V60</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>all-trans retinal</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R2500-500MG</td>
 <td>200 mM stock in 95% EtOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silpot184</td>
 <td>Dow Corning Toray</td>
 <td>3255981</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

optogenetic perturbation of neural activity with laser illumination in semi-intact drosophila larvae in motion

Drosophila larva hareket 1-6 devrelerde temel nöronal bileşenlerin genetik erişilebilirlik sayesinde gelişimsel ve fizyolojik nörobilim görkemli bir model sistem vardır. Larva sinir devresinde optogenetics 7,8 uygulanması bize mekansal ve zamansal desenli şekilde 9-13 nöronal aktivite değiştirmenize olanak verir. Tipik olarak, numuneler geniş bir cıva lambası ile aydınlatılmış ya da LED vardır, hedef nöronları çok özgünlüğü, Gal4 UAS sistemi 14,15 gibi ikili gen ifade sistemi ile kontrol edilir. Bu çalışmada, &quot;alt-genetik çözünürlük&quot; için uzaysal çözünürlüğü geliştirmek için, biz yerel geleneksel bir konfokal mikroskop uygulanan lazerler kullanarak ventral sinir kablosu nöronların bir alt kümesi aydınlattı. Yarı sağlam larvaların vücut duvarı hareketini takip ederken, etkileşimli aktif veya channelrhodopsin 16,17 o ile sinirsel aktivite inhibesırasıyla r halorhodopsin 18-20,. Sinir dokusunun mekansal ve zamansal olarak sınırlı aydınlatma, biz davranış belirli bir aşamasında devre belirli nöronların aktivitesini işleyebilirsiniz. Bu yöntem, ventral sinir kablosu bir lokal sinir düzeneği ve motor çıkış uzaysal desen faaliyetleri arasındaki ilişkiyi çalışmak için yararlıdır.

<html> ChR2 ile motor nöron yerel ve geçici aktivasyonu. Biz motor nöronların ChR2 dile getirdi. Her VNC bölüm projeden vücut duvarı karşılık gelen bir kesimine ortaya çıkan motor nöronların akson. Bir mavi lazer ile VNC bir ya da iki segment uyarıldığında, karşılık gelen parçaların kasların kasılma (Şekil 1) sergiledi. NpHR ile motor nöron yerel ve geçici inhibisyonu. Biz motor nöronların NpHR dile getirdi. Biz peristaltik kas kasılmaları sırasında sarı lazer ile VNC birkaç (1 ~ 2) segmentleri uyarıldığında, yayılan dalga vücut duvarının ilgili kesimleri (Şekil 2) tutuklandı. Biz lazer aydınlatma 13 kapalı zaman sonra dalga tutuklandı segmentlerden yeniden. 50513fig1.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 1 &quot;fo: içerik-width =&quot; 5.5 inç &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. ChR2 ile motor nöron Yerel aktivasyonu. Fileto hazırlık yerel aktivasyon A. Programı. Motor nöronların ChR2 ifade ventral sinir kablosu birkaç kesimlerinin mavi-ışık aydınlatma olarak, ilgili segmentlerinde kasları (ok başı) sözleşmeli vardır. Bir disseke larva B. İletim görüntüleri. Ventral sinir kablosu Yerel aydınlatma (ok başları) vücut duvarı kasları (oklar) segmental daralma neden olur. <img src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2highres.jpg"/> Şekil 2. Fileto hazırlık yerel inhibe NpHR. A. Programı ile motor nöron Yerel inhibisyonu. Sarı-lmotor nöronlar, kendiliğinden meydana gelen peristaltik hareket (üst ok başı) sırasında kasların kasılması gevşer içinde NpHR ifade ventral sinir kablosu birkaç kesimlerinin ight aydınlatma bir disseke larva (alt ok başı.) B. İletim görüntüleri . Ventral sinir kablosu (ok başları) Yerel aydınlatma kendiliğinden-sözleşmeli vücut duvarı kesimleri (oklar) rahat.

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion at JoVE.com

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Yarı sağlam motor çıkış değişiklikleri (kas kasılması) izlerken Burada motoneuronal faaliyet optogenetic manipülasyon için bir protokol açıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Geleneksel bir konfokal mikroskop içinde lazerler kullanarak larva. Bu teknik, motorun devrelerin dinamiklerini aydınlatmak için birkaç neuromeres nöral aktivitenin yerel pertürbasyon elde etmek için araştırmacılar sağlar.

Yarı sağlam Lazer Aydınlatma ile Sinir Faaliyet optogenetic Pertürbasyon<em&gt; Drosophila</emMotion&gt; Larva

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

optogenetic-perturbation-neural-activity-with-laser-illumination-semi

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

11.5K Görüntüleme.  The University of Tokyo. Yarı sağlam motor çıkış değişiklikleri (kas kasılması) izlerken Burada motoneuronal faaliyet optogenetic manipülasyon için bir protokol açıklar Drosophila Geleneksel bir konfokal mikroskop içinde lazerler kullanarak larva. Bu teknik, motorun devrelerin dinamiklerini aydınlatmak için birkaç neuromeres nöral aktivitenin yerel pertürbasyon elde etmek için araştırmacılar sağlar.

Video: Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in rodents have shown a direct link between testosterone and aggressive behavior1 and folk wisdom adapts these findings to humans, suggesting that testosterone induces antisocial, egoistic or even aggressive behavior2. However, many researchers doubt a direct testosterone-aggression link in humans, arguing instead that testosterone is primarily involved in status-related behavior3,4. As a high status can also be achieved by aggressive and antisocial means it can be difficult to distinguish between anti-social and status seeking behavior.
We therefore set up an experimental environment, in which status can only be achieved by prosocial means. In a double-blind and placebo-controlled experiment, we administered a single sublingual dose of 0.5 mg of testosterone (with a hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin carrier) to 121 women and investigated their social interaction behavior in an economic bargaining paradigm. Real monetary incentives are at stake in this paradigm; every player A receives a certain amount of money and has to make an offer to another player B on how to share the money. If B accepts, she gets what was offered and player A keeps the rest. If B refuses the offer, nobody gets anything. A status seeking player A is expected to avoid being rejected by behaving in a prosocial way, i.e. by making higher offers.
The results show that if expectations about the hormone are controlled for, testosterone administration leads to a significant increase in fair bargaining offers compared to placebo. The role of expectations is reflected in the fact that subjects who report that they believe to have received testosterone make lower offers than those who say they believe that they were treated with a placebo. These findings suggest that the experimental economics approach is sensitive for detecting neurobiological effects as subtle as those achieved by administration of hormones. Moreover, the findings point towards the importance of both psychosocial as well as neuroendocrine factors in determining the influence of testosterone on human social behavior.

The procedure described in this protocol shows that testosterone administration and folk beliefs about testosterone may be associated with directly opposed social behaviors.

Davranış Endokrinoloji ve Deneysel İktisat birleştiren: Testosteron ve Sosyal Karar Verme

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Nörobilim

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

C in vivo Lazer Axotomy elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

In iştahlı İlişkilendirilebilir Olfaktör Öğrenme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Yılında Escape Davranış Optogenetic Uyarım<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

Bir Penetran Mikro-elektrot Array ile bir Kırımsız Hipokampal Hazırlık Sinir Faaliyet Yayılım

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Uyanık Farelerde Nöroaktif Maddelerin Microiontophoretic Uygulaması ile birlikte Nöronal Faaliyet dışı Kaydı

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Soğuk nosisepsiyon için Roman Tahlili<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.