Damos las gracias al Dr. Emir Islamovic por la asistencia de laboratorio e invernadero. También agradecemos a la Dra. Sherry Flint-Garcia por proporcionar las líneas de introgresión de maíz x teosinte.

1. Crecimiento de material vegetal
<ol><li>Seleccione las líneas de la planta para la inoculación y la investigación. Para este trabajo se utilizaron dos líneas de maíz, cinco líneas de teosinte y cuarenta líneas de maíz x teosinte con resistencia no caracterizada a U. maydis (Tabla 1).</li>
	<li>Planta semillas para experimentos experimentales (inyecciónde U. maydis) y de control (inyección de agua) de inyección de agujas. Haga esto para cada línea de planta.</li>
	<li>Plantar cuatro semillas (réplicas) para cada línea de planta en pequeños pisos empujando las semillas alrededor de 1/2 pulgada en el suelo con el dedo y cubriendo con el suelo ligeramente (Figuras 1A y 1B). No empaque el suelo sobre la semilla. Plantar la semilla más profundamente o empacar el suelo sobre la semilla puede causar problemas con la aparición de plántulas.</li>
	<li>Riegar las semillas en el suelo. Asegúrese de que el suelo esté empapado y las semillas permanezcan debajo del suelo después del riego.</li>
	<li>Después del riego, coloque las plantas en una cámara de crecimiento con ambientes diurnos y nocturnos de 28/20 °C de temperatura y 14/10 horas de fotoperiodo, respectivamente y aproximadamente 500 μmol/m2 seg   de radiaciones fotosintéticamente activas en la parte superior del dosel. Mantener la humedad relativa durante el día y la noche en aproximadamente el 70% y el 90%, respectivamente.</li>
	<li>Mantenga todas las plantas en la misma cámara de crecimiento para mantener un entorno de crecimiento que sea congruente en todo el experimento.</li>
	<li>Después de 10 días, retire las plantas de la cámara de crecimiento e inoculte las plantas con el cultivo de suspensión celular U. maydis utilizando un método de inoculación por inyección de agujas. Nota: Las plantas de maíz se pueden inocular 7 días después de la siembra8-10. Sin embargo, las plantas de teosinte son demasiado pequeñas después de 7 días. Por lo tanto, inocular tanto las plantas de maíz como las de teosinte 10 días después de la siembra para mantener la consistencia dentro del experimento (ver paso 2.12).</li>
</ol>2. Inoculación por inyección de agujas
<ol><li>Haga todo el trabajo en una campana de flujo laminar. Retire las existencias de Glicerol de U. maydis del almacenamiento del congelador. Use un asa estéril y cepas de glicerol de raya de las cepas de tipo salvaje U. maydis 1/2 (tipo de apareamiento a1b1) y 2/9 (tipo de apareamiento a2b2, cerca de isogénico a 1/2) en placas de agar dextrosa de papa (PDA). Mantenga las cepas por separado.</li>
	<li>Coloque las placas de PDA rayadas con U. maydis en una incubadora de 30 °C durante dos días. Si utiliza un patógeno biotrófico diferente, utilice la cepa adecuada, medios y condiciones de crecimiento. Supervise el crecimiento del patógeno durante el período de dos días para asegurarse de que la cepa U. maydis está creciendo bien.</li>
	<li>Retire las placas de PDA de la incubadora después de dos días. Las placas deben tener un buen crecimiento de patógenos y contener colonias individuales (Figura 2A). Es importante obtener colonias individuales. Si las solas colonias no están presentes restreak las placas en una concentración más baja.</li>
	<li>Haga todo el trabajo en una campana de flujo laminar. Utilice un palillo de dientes estéril para seleccionar una sola colonia para cada cepa de las placas de PDA. Coloque el palillo de dientes que contiene una sola colonia en un caldo de dextrosa de patata (PDB) de 3 ml. Se aconseja tener 2-3 culturas.</li>
	<li>Coloque los cultivos de PDB de 3 ml en una incubadora/coctelera de 30 °C durante dos días a 200 rpm. Monitorear el crecimiento de la cultura durante el período de dos días para asegurar el crecimiento de la cultura. La cultura debe aparecer muy nublada.</li>
	<li>Retire los cultivos líquidos de la incubadora/agitadora y mida la concentración a600 OD para asegurarse de que las células se cultivaron a un OD de 1,0 (~ 1 x 107 células / ml)17.</li>
	<li>Llevar los cultivos en suspensión celular de U. maydis a una concentración final de 1 x 106 células/ml, utilizando agua en un volumen de cultivo final de 30 ml. Esta concentración resulta consistentemente en una buena infección de las plantas con el cultivo de suspensión celular de patógenos. 17. 
</li>
</ol>Nota: Se deben ensayar diversas concentraciones de suspensión celular cuando se utilizan diferentes cepas de patógenos para determinar el título celular apropiado necesario para la inoculación18,19. La concentración final dada para el cultivo de suspensión celular se puede utilizar como punto de partida para el tittering. La concentración adecuada del cultivo en suspensión celular del patógeno debe verificarse visualizando los fenotipos vegetales con buena infección (Figuras 3A-E).
<ol start="8"><li>Mezcle volúmenes iguales de las dos cepas de U. maydis antes de la inoculación. Si utiliza una cepa patógena, proceda al paso 2.9. Prepare cultivos frescos de suspensión celular de U. maydis para cada experimento de inoculación y deseche los cultivos de suspensión celular después de dos días.</li>
	<li>Para la inoculación experimental de inyección con aguja, llene una jeringa de 3 ml con el cultivo de suspensión celular U. maydis dibujando el cultivo de suspensión celular en la jeringa.</li>
	<li>Para la inoculación de inyección de aguja de control, llene una jeringa de 3 ml con agua17. Utilice el mismo procedimiento para la inoculación experimental de inyección con aguja.</li>
	<li>Coloque una aguja hipodérmica de 0,457 mm x 1,3 cm al final de cada jeringa de 3 ml. El tamaño de aguja seleccionado entregará el cultivo de suspensión celular entre las hojas de la planta con un daño mínimo al tejido de la planta.</li>
	<li>Retirar las plantas experimentales y control de la cámara de crecimiento 10 días después de la siembra en preparación para inoculaciones por inyección de agujas (Figura 2B) (ver paso 1.7).</li>
	<li>Inserte cuidadosamente la aguja hipodérmica que contiene el cultivo de suspensión celular U. maydis en el tallo de una planta experimental en un ángulo de 90° justo por encima de la línea del suelo. Inserte la aguja hasta que esté en el centro del tallo. No empuje la aguja a través del tallo (Figura 2C).</li>
	<li>Inyectar la planta experimental con unos 100 μl del cultivo en suspensión celular U. maydis 18,19. Esto variará ligeramente dependiendo de la altura de la plántula. El cultivo de suspensión celular empujará a través del tallo y se moverá en el torbellino de la planta. El cultivo en suspensión celular será visible en el torbellino de la planta. Continúe inyectando 100 μl del cultivo en suspensión celular en cada planta individual hasta que la jeringa de 3 ml esté vacía.</li>
	<li>Después de la inyección, retire cuidadosamente la aguja del tallo de la planta. Retire la aguja de la jeringa de 3 ml ahora vacía y llénese con agua. Vuelva a colocar la aguja en la jeringa y empuje el agua a través de la aguja para extraer cualquier tejido vegetal que pueda quedar atrapado en la punta de la aguja.</li>
	<li>Repita los pasos 2.9-2.15 para cada planta experimental. Siga el mismo protocolo para las plantas de control inyectando agua.</li>
	<li>Coloque las plantas experimentales y de control inoculadas de nuevo en la cámara de crecimiento. Riegar las plantas diariamente humedecer el suelo no el tejido vegetal.</li>
	<li>Revise las plantas diariamente para detectar el desarrollo de patógenos y reacciones de resistencia de las plantas.</li>
</ol>3. Detección de reacción de resistencia
<ol><li>Puntuar y registrar las reacciones de resistencia para cada planta 7, 10, 14 y 21 días después de la inoculación (dpi) utilizando una escala de clasificación de reacción de resistencia de 1 a 5. La gravedad de la enfermedad aumenta a medida que aumentan los valores numéricos en la escala de calificación (Tabla 2). Una reacción de resistencia 1C (clorosis de hojas), 1A (producción de antocianinas de hojas) o 2 (agallas de hojas pequeñas) indica resistencia. Una reacción de resistencia de 3 (agallas del tallo), 4 (agalla basal) o 5 (muerte de la planta) indica susceptibilidad (Figuras 3A-E y Tabla 2)18,19.</li>
	<li>Puntuar tanto las plantas experimentales como las de control y registrar las calificaciones de reacción de resistencia.</li>
	<li>Comparar las reacciones de resistencia de las plantas experimentales y de control. Seleccione plantas experimentales con una clasificación de reacción de resistencia de 1C, 1A o 2. Estas plantas se consideran resistentes a U. maydis18,19.</li>
	<li>Repita todo el experimento para verificar los fenotipos de la planta.</li>
</ol>

<ol>
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Genet. 6, 274-283 (1991).</li><li>Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+in+the+bW/bE+regulatory+cascade+in+Ustilago+maydis.">Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis.</a> Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).</li><li>Christensen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corn+smut+caused+by+Ustilago+maydis.+Monograph+number+2.">Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2.</a> , (1963).</li><li>Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+tumors+caused+by+Ustilago+maydis+require+organ-specific+genes+in+host+and+pathogen.">Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen.</a> Sci.. 328, 89-92 (2010).</li><li>Kamper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+maize+plants+expressing+the+Totivirus+antifungal+protein,+KP4,+are+highly+resistant+to+corn+smut.">Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut.</a> Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).</li><li>Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+regulatory+subunit+of+a+cAMP-Dependent+protein+kinase+is+required+for+gall+formation+in+maize.">The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize.</a> , (1997).</li><li>Gold, S. E., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+two+chitin+syn-+thase+genes+in+the+phytopathogenic+fungus+Ustilago+maydis.">Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis.</a> Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).</li><li>Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ustilago+maydis+as+a+Pathogen.">Ustilago maydis as a Pathogen.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).</li><li>Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., K&#228;mper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystems.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems.</a> J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).</li><li>Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indole-3-acetic+acid+(IAA)+biosynthesis+in+the+smut+fungus+Ustilago+maydis+and+its+relevance+for+increased+IAA+levels+in+infected+tissue+and+host+tumor+formation.">Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation.</a> Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).</li><li>Mart&#237;nez-Espinoza, A., Garc&#237;a-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilaginales+as+Plant+Pests+and+Model+Systems.">The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems.</a> Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).</li><li>Banuett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Ustilago+maydis,+a+fungal+pathogen+that+induces+tumors+in+maize.">Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize.</a> Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).</li><li>Keen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+plant+pathology:+a+retrospective+view+on+understanding+host-parasite+interactions.">A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, el método de inoculación por inyección de aguja utilizado para entregar una cepa de U. maydis en el tallo de 700 plantas de maíz y teosinte tuvo éxito. Además, se utilizó una escala de clasificación de resistencia a enfermedades revisada para examinar las plantas y detectar el desarrollo de patógenos. Como resultado del uso de ambos métodos, se identificaron líneas de plantas que son resistentes a U. maydis entre 700 plantas de maíz y teosinte que ahora se pueden combinar y ...

Las enfermedades fúngicas de las plantas representan una de las amenazas más eminentes para la agricultura. La necesidad de desarrollar cultivos con mayor resistencia a las enfermedades está aumentando debido a las necesidades alimentarias de una creciente población mundial. Los patógenos de las plantas infectan naturalmente a las plantas de cultivo en el campo causando enfermedades que afectan negativamente el rendimiento de los cultivos6. Se ha demostrado que la identificación y utilización de plantas resistentes puede mejorar la resistencia y disminuir la pérdida de rendimiento. Se han identificado cultivares resistentes en muchas especies de plantas, incluyendo maíz, trigo, arroz y sorgo inoculando las plantas con un patógeno vegetal y seleccionando líneas resistentes7. Por lo tanto, el desarrollo y el uso de un método de inoculación eficiente permitiría que muchas plantas fueran inoculadas y examinadas para detectar resistencia. Se han utilizado varios métodos de inoculación, incluyendo la inoculación por inmersión, el pipeteo del cultivo en suspensión celular del patógeno en el torbellino de la planta y la inoculación por inyección deagujas 8-11. Con cada método, el patógeno debe introducirse de forma fiable entre las hojas de la planta donde el patógeno entra en la planta a través de la formación de appresoria para asegurar el desarrollo del patógeno y la infección de la planta12,13.
El método de inoculación por inmersión consiste en sumergir una plántula de planta en un cultivo de suspensión de células patógenas, mientras que el método de pipeteo requiere colocar el cultivo de suspensión celular de patógenos en el torbellino de la plántula de plantas. Sin embargo, hay problemas con ambos métodos. En primer lugar, ambos métodos dependen del movimiento natural del patógeno desde la superficie de la hoja hacia el tejido vegetal, que es muy variable. La mayoría de los patógenos entran naturalmente en la planta a través de aberturas estomáticas o heridas en la superficie de la hoja de la planta. Sin embargo, hay variabilidad significativa en la capacidad de los patógenos para penetrar la superficie de la hoja de la planta a través de los estomas y / o heridas en la superficie de la hoja. Por lo tanto, la penetración del patógeno no se puede controlar con cualquier método de la inoculación que puede dar por resultado datos incoherentes. En segundo lugar, cuando se revisa un gran número de plantas, sumergir las plántulas en un cultivo de suspensión de células patógenas puede llevar mucho tiempo y puede limitar el número de plantas que se pueden examinar. Por el contrario, el protocolo de inoculación por inyección de agujas aquí descrito entrega el cultivo en suspensión celular de patógenos entre las hojas de la planta facilitando la formación de appressoria14. El patógeno entonces utiliza el appressoria recientemente desarrollado para entrar en la planta eliminando el problema de la penetración del patógeno. Además, el protocolo de inoculación por inyección de agujas proporciona una gama de fenotipos para plantas de maíz y teosinto que han sido inoculadas con U. maydis y demuestran una buena infección. Los fenotipos se pueden utilizar como marcador para determinar la mejor concentración para el cultivo de la suspensión de la célula del patógeno dando por resultado fenotipos constantes de la planta dentro y entre diversos experimentos.
Después de la inoculación de la planta con un cultivo de suspensión celular de patógenos, las plantas son típicamente examinadas para detectar un fenotipo resistente o susceptible8-11,15. Mientras que las escalas de calificación de enfermedades se han utilizado ampliamente para examinar y clasificar los fenotipos de las plantas, las escalas de calificación difieren dependiendo del patógeno que se está analizando. Por lo tanto, un establecimiento de protocolo de escala de calificación de enfermedades para las interacciones de U. maydis y maíz puede ser utilizado para patógenos fúngicos similares16.
La presente serie de protocolos detalla la inoculación por inyección de agujas con un cultivo de suspensión celular U. maydis y un cribado de reacción de resistencia a enfermedades de las líneas de introgresión de maíz, teosinte y maíz x teosinte. Los protocolos actuales no se limitan a la inoculación por inyección con aguja de U. maydis en plantas de maíz, sino que se pueden utilizar para relativamente cualquier patógeno fúngico y especie de planta. Por lo tanto, incluir los detalles de ambos métodos en el mismo protocolo permitirá a los investigadores utilizar directamente los protocolos para la inoculación y el cribado o manipular los protocolos originales para adaptarse mejor al patógeno y a las especies vegetales de interés.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed for plants</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Collected from original crosses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Conviron</td>
			<td>PGR14 REACH-IN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planting flats</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>14-3385-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>10-1059-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Lab Conoco</td>
			<td>70875372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stocks were grown from original culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile loop</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S17356A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato dextrose agar (PDA) plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R454311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator set to 30 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-690-650F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile toothpicks</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Purchased from Walmart and sterilized by autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato dextrose broth (PDB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1008617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator-shaker set to 30 &#176;C</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>14-278-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4001000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U. maydis&#160;cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Grown from glycerol stock as described in the methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles</td>
			<td>Kendall Brands</td>
			<td>8881250321</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and efficient method for assessing pathogenicity of ustilago maydis on maize and teosinte lines

El maíz es uno de los principales cultivos de cereales en todo el mundo. Sin embargo, la susceptibilidad a patógenos biotróficos es la principal limitación para aumentar la productividad. U. maydis es un patógeno fúngico biotrófico y el agente causal del smut de maíz en el maíz. Esta enfermedad es responsable de pérdidas significativas de rendimiento de aproximadamente $ 1.000 millones anuales en los EE. UU. 1 Varios métodos, incluida larotación de cultivos, la aplicación de fungicidas y los tratamientos de semillas, se utilizan actualmente para controlar el smut de maíz2. Sin embargo, la resistencia del huésped es el único método práctico para el manejo de la muda de maíz. La identificación de plantas de cultivo como el maíz, el trigo y el arroz que son resistentes a diversos patógenos biotróficos ha disminuido significativamente las pérdidas de rendimiento anualmente3-5. Por lo tanto, el uso de un método de inoculación de patógenos que entregue de manera eficiente y reproducible el patógeno entre las hojas de la planta, facilitaría la rápida identificación de líneas de maíz que son resistentes a U. maydis. Como un primer paso hacia la identificación de las líneas de maíz que son resistentes a U. maydis,se utilizó un método de inoculación por inyección de agujas y un método de detección de reacción de resistencia para inocular líneas de introgresión de maíz, teosinte y maíz x teosinte con una cepa de U. maydis y para seleccionar plantas resistentes.
Las líneas de introgresión de maíz, teosinte y maíz x teosinte, que constan de unas 700 plantas, fueron plantadas, inoculadas con una cepa de U. maydis,y examinadas para detectar resistencia. Los métodos de inoculación y cribado identificaron con éxito tres líneas de teosinte resistentes a U. maydis. Aquí se presenta un protocolo detallado de cribado de inoculación por inyección de aguja y reacción de resistencia para las líneas de introgresión de maíz, teosinte y teosinte de maíz x teosinte. Este estudio demuestra que la inoculación por inyección de agujas es una herramienta invaluable en la agricultura que puede entregar eficientemente U. maydis entre las hojas de las plantas y ha proporcionado líneas de plantas que son resistentes a U. maydis que ahora se pueden combinar y probar en programas de mejoramiento para mejorar la resistencia a las enfermedades.

Una inoculación exitosa de inyección de agujas se puede determinar visualizando el fenotipo de las plantas inoculadas con U. maydis (experimental). La mayoría de las plantas experimentales eran susceptibles a la infección por U. maydis. Las plantas susceptibles mostraron un desarrollo de enfermedad muy grave demostrado por la formación de tallo y agalla basal con teliosporas negras(Figuras 3D y 3E, Tabla 2). Varias plantas murieron después de la i...

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A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

Se describe el uso de un método de inyección con aguja para inocular plantas de maíz y teosinto con el patógeno biotrófico Ustilago maydis. El método de inoculación por inyección de agujas facilita la entrega controlada del patógeno fúngico entre las hojas de la planta donde el patógeno entra en la planta a través de la formación de appresoria. Este método es altamente eficiente, permitiendo inoculaciones reproducibles con U. maydis.

Un método rápido y eficiente para evaluar la patogenicidad de Ustilago maydis en las líneas de maíz y teosinte

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

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Research

JoVE Journal

Environment

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

8.4K vistas.  University of Georgia. Se describe el uso de un método de inyección con aguja para inocular plantas de maíz y teosinto con el patógeno biotrófico Ustilago maydis. El método de inoculación por inyección de agujas facilita la entrega controlada del patógeno fúngico entre las hojas de la planta donde el patógeno entra en la planta a través de la formación de appresoria. Este método es altamente eficiente, permitiendo inoculaciones reproducibles con U. maydis.

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Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. Unfortunately, traditional benthic larval sampling methods, such as the dip-net, can be time-consuming and expensive. An alternative protocol involves collection of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Chironomidae is a species-rich family of flies (Diptera) whose immature stages typically occur in aquatic habitats. Adult chironomids emerge from the water, leaving their pupal skins, or exuviae, floating on the water&#8217;s surface. Exuviae often accumulate along banks or behind obstructions by action of the wind or water current, where they can be collected to assess chironomid diversity and richness. Chironomids can be used as important biological indicators, since some species are more tolerant to pollution than others. Therefore, the relative abundance and species composition of collected SFPE reflect changes in water quality. Here, methods associated with field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of chironomid SFPE are described in detail. Advantages of the SFPE method include minimal disturbance at a sampling area, efficient and economical sample collection and laboratory processing, ease of identification, applicability in nearly all aquatic environments, and a potentially more sensitive measure of ecosystem stress. Limitations include the inability to determine larval microhabitat use and inability to identify pupal exuviae to species if they have not been associated with adult males.

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrates are often used to monitor and assess water quality. An efficient protocol involves collections of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Here, techniques for field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of Chironomidae SFPE are described.

El uso de Chironomidae (Diptera) en superficie flotante pupal Exuviae como Protocolo Bioassessment rápida para las Masas de Agua

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Investigación

Medio ambiente

The Use of an Automated System (GreenFeed) to Monitor Enteric Methane and Carbon Dioxide Emissions from Ruminant Animals

Ruminant animals (domesticated or wild) emit methane (CH4) through enteric fermentation in their digestive tract and from decomposition of manure during storage. These processes are the major sources of greenhouse gas (GHG) emissions from animal production systems. Techniques for measuring enteric CH4 vary from direct measurements (respiration chambers, which are highly accurate, but with limited applicability) to various indirect methods (sniffers, laser technology, which are practical, but with variable accuracy). The sulfur hexafluoride (SF6)&#160;tracer gas method is commonly used to measure enteric CH4 production by animal scientists and more recently, application of an Automated Head-Chamber System (AHCS) (GreenFeed, C-Lock, Inc., Rapid City, SD), which is the focus of this experiment, has been growing. AHCS is an automated system to monitor CH4 and carbon dioxide (CO2) mass fluxes from the breath of ruminant animals. In a typical AHCS operation, small quantities of baiting feed are dispensed to individual animals to lure them to AHCS multiple times daily. As the animal visits AHCS, a fan system pulls air past the animal&#8217;s muzzle into an intake manifold, and through an air collection pipe where continuous airflow rates are measured. A sub-sample of air is pumped out of the pipe into non-dispersive infra-red sensors for continuous measurement of CH4 and CO2 concentrations. Field comparisons of AHCS to respiration chambers or SF6 have demonstrated that AHCS produces repeatable and accurate CH4 emission results, provided that animal visits to AHCS are sufficient so emission estimates are representative of the diurnal rhythm of rumen gas production. Here, we demonstrate the use of AHCS to measure CO2 and CH4 fluxes from dairy cows given a control diet or a diet supplemented with technical-grade cashew nut shell liquid.

The Use of an Automated System GreenFeed to Monitor Enteric Methane and Carbon Dioxide Emissions from Ruminant Animals

Accuracy and precision of the techniques used to measure methane emissions from ruminant animals are critically important for the success of greenhouse gas mitigation efforts. This manuscript describes the principles and operation of an automated system to monitor methane and carbon dioxide mass fluxes from the breath of ruminant animals.

El uso de un sistema automatizado (Magnetovisor Verde) para supervisar entérica de metano y dióxido de carbono Las emisiones de los rumiantes

Ruminant animals (domesticated or wild) emit methane (CH4) through enteric fermentation in their digestive tract and from decomposition of manure during ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ecological interactions. Arthropods are usually tracked in nature by tagging them with a unique mark and then re-collecting them over time and space to determine their dispersal capabilities. In addition to actual physical tags, such as colored dust or paint, various types of proteins have proven very effective for marking arthropods for ecological research. Proteins can be administered internally and/or externally. The proteins can then be detected on recaptured arthropods with a protein-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Here we describe protocols for externally and internally tagging arthropods with protein. Two simple experimental examples are demonstrated: (1) an internal protein mark introduced to an insect by providing a protein-enriched diet and (2) an external protein mark topically applied to an insect using a medical nebulizer. We then relate a step-by-step guide of the sandwich and indirect ELISA methods used to detect protein marks on the insects. In this demonstration, various aspects of the acquisition and detection of protein markers on arthropods for mark-release-recapture, mark-capture, and self-mark-capture types of research are discussed, along with the various ways that the immunomarking procedure has been adapted to suit a wide variety of research objectives.

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Administrar y Detección de Marcas de proteínas de Artrópodos de Dispersión de Investigación

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

Reliable Method for Assessing Seed Germination, Dormancy, and Mortality under Field Conditions

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester fabric and glue can be folded and glued to construct a strip of compartments that house seeds and identifying information, while allowing contact with soil leachate, water, microorganisms, and ambient temperature. Strips may be constructed with a wide range of compartment numbers and sizes and allow the researcher to house a variety of genotypes within a single species, different species, or seeds that have experienced different treatments. As opposed to individual seed packets, strips are more easily retrieved as a unit. While replicate packets can be included within a strip, different strips can act as blocks or can be retrieved at different times for observation of seed behavior over time. We used a high temperature glue gun to delineate compartments and sealed the strips once the seed and tags identifying block and removal times were inserted. The seed strips were then buried in the field at the desired depth, with the location marked for later removal. Burrowing animal predators were effectively excluded by use of a covering of metal mesh hardware cloth on the soil surface. After the selected time interval for burial, strips were dug up and seeds were assessed for germination, dormancy and mortality. While clearly dead seeds can often be distinguished from ungerminated living ones by eye, dormant seeds were conclusively identified using a standard Tetrazolium chloride colorimetric test for seed viability.

Here we present a protocol for assessing seed survivorship, germination and dormancy under field conditions using buried, labeled seed strips and tetrazolium chloride (TZ) viability testing.

Método fiable para evaluar la germinación de semillas, dormancia y mortalidad en condiciones de campo

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which promotes growth of large weaponry and body size. Populations of the same species display each phenotype depending on environmental conditions. Although antler and body size of male white-tailed deer (Odocoileus virginianus) varies by physiographic region in Mississippi, USA and is strongly correlated with regional variation in nutritional quality, the effects of population-level genetics from native stocks and previous re-stocking efforts cannot be disregarded. This protocol describes how we designed a controlled study, where other factors that influence phenotype, such as age and nutrition, are controlled. We brought wild-caught pregnant females and six-month-old fawns from three distinct physiographic regions in Mississippi, USA to the Mississippi State University Rusty Dawkins Memorial Deer Unit. Deer from the same region were bred to produce a second generation of offspring, allowing us to assess generational responses and maternal effects. All deer ate the same high-quality (20% crude protein deer pellet) diet ad libitum. We uniquely marked each neonate and recorded body mass, hind foot, and total body length. Each subsequent fall, we sedated individuals via remote injection and sampled the same morphometrics plus antlers of adults. We found that all morphometrics increased in size from first to second generation, with full compensation of antler size (regional variation no longer present) and partial compensation of body mass (some evidence of regional variation) evident in the second generation. Second generation males that originated from our poorest quality soil region displayed about a 40% increase in antler size and about a 25% increase in body mass when compared to their wild harvested counterparts. Our results suggest phenotypic variation of wild male white-tailed deer in Mississippi are more related to differences in nutritional quality than population-level genetics.

Phenotypic differences among cervid populations may be related to population-level genetics or nutrition; discerning which is difficult in the wild. This protocol describes how we designed a controlled study where nutritional variation was eliminated. We found that phenotypic variation of male white-tailed deer was more limited by nutrition than genetics.

Protocolo para la evaluación de los efectos relativos de medio ambiente y la genética en el asta y el crecimiento del cuerpo para una larga vida cérvidos

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic pathway of dimethylarsinic acid (DMAV) thiolation, have been recently found in the environment as well as human organs. DMMTAV and DMDTAV can be quantified to determine the ecological effects of dimethylated thioarsenicals and their stability in environmental media. The synthesis method for these compounds is unstandardized, making replicating previous studies challenging. Furthermore, there is a lack of information about storage techniques, including storage of compounds without species transformation. Moreover, because only limited information about synthesis methods is available, there may be experimental difficulties in synthesizing standard chemicals and performing quantitative analysis. The protocol presented herein provides a practically modified synthesis method for the dimethylated thioarsenicals, DMMTAV and DMDTAV, and will help in the quantification of species separation analysis using high performance liquid chromatography in conjunction with inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS). The experimental steps of this procedure were modified by focusing on the preparation of chemical reagents, filtration methods, and storage.

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

This article presents modified experimental protocols for dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV) synthesis, inducing dimethylarsinic acid (DMAV) thiolation through mixing of DMAV, Na2S, and H2SO4. The modified protocol provides an experimental guideline, thereby overcoming limitations of the synthesis steps that could have caused experimental failures in quantitative analysis.

Preparación de DMMTAV y DMDTAV usando DMAV para usos ambientales: síntesis, purificación y confirmación

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

The Hawaii Protocol for Scientific Monitoring of Coffee Berry Borer: a Model for Coffee Agroecosystems Worldwide

Coffee berry borer (CBB) is the most devastating insect pest for coffee crops worldwide. We developed a scientific monitoring protocol that is aimed at capturing and quantifying the dynamics and impact of this invasive insect pest as well as the development of its host plant across a heterogeneous landscape. The cornerstone of this comprehensive monitoring system is timely georeferenced data collection on CBB movement, coffee berry infestation, mortality by the fungus Beauveria bassiana, and coffee plant phenology via a mobile electronic data recording application. This electronic data collection system allows field records to be georeferenced through built-in global positioning systems, and is backed by a network of weather stations and records of farm management practices. Comprehensive monitoring of CBB and host plant dynamics is an essential part of an area-wide project in Hawaii to aggregate landscape-level data for research to improve management practices. Coffee agroecosystems in other parts of the world that experience highly variable environmental and socioeconomic factors will also benefit from implementing this protocol, in that it will drive the development of customized integrated pest management (IPM) to manage CBB populations.

Comprehensive monitoring of coffee berry borer and host plant dynamics is essential for aggregating landscape-level data to improve management of this invasive pest. Here, we present a protocol for scientific monitoring of coffee berry borer movement, infestation, mortality, coffee plant phenology, weather, and farm management via a mobile electronic data recording application.

El protocolo de Hawaii para el seguimiento científico de la broca del café: un modelo para los agroecosistemas de café en todo el mundo

Coffee berry borer (CBB) is the most devastating insect pest for coffee crops worldwide. We developed a scientific monitoring protocol that is aimed at ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

Sistema hidropónico de un Flexible bajo costo para evaluar las respuestas de la planta a moléculas pequeñas en condiciones estériles

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole grain composition and processing characteristics vary among maize hybrids and can impact the quality of the final processed product. Therefore, in order to produce healthier processed food products from maize, it is necessary to know how to optimize processing parameters for particular sets of germplasm to account for these differences in grain composition and processing characteristics. This includes a better understanding of how current processing techniques impact the nutritional quality of the final processed food product. Here, we describe a microscale protocol that both simulates the processing pipeline to produce cornflakes from large flaking grits and allows for the processing of multiple grain samples simultaneously. The flaking grits, the intermediate processed products, or final processed product, as well as the corn grain itself, can be analyzed for nutritional content as part of a high-throughput analytical pipeline. This procedure was developed specifically for incorporation into a maize breeding research program, and it can be modified for other grain crops. We provide an example of the analysis of insoluble-bound ferulic acid and p-coumaric acid content in maize. Samples were taken at five different processing stages. We demonstrate that sampling can take place at multiple stages during microscale processing, that the processing technique can be utilized in the context of a specialized maize breeding program, and that, in our example, most of the nutritional content was lost during food product processing.

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Here, we present a microscale protocol for processing grain samples and for incorporating this microscale approach into a high-throughput analytical pipeline. This is a higher throughput adaptation of currently available protocols.

Alto rendimiento, microescala protocolo para el análisis de los parámetros de procesamiento y cualidades nutritivas en maíz (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

Evaluación de las capacidades de eliminación de materia particulada de árbol hojas

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...