Ringraziamo il Dott. Emir Islamovic per l'assistenza in laboratorio e in serra. Ringraziamo anche il Dr. Sherry Flint-Garcia per aver fornito le linee di introgressione mais x teosinte.

1. Crescita del materiale vegetale
<ol><li>Selezionare le linee dell'impianto per l'inoculazione e lo screening. Per questo lavoro sono state utilizzate due linee di granturco, cinque linee di teosinte e quaranta linee di mais x teosinte con resistenza insolita agli U. maydis (tabella 1).</li>
	<li>Semi vegetali per esperimenti sperimentali(iniezione di U. maydis) e controllo (iniezione d'acqua) di inoculazione dell'ago. Eseguire questa questa cosa per ogni linea di piante.</li>
	<li>Piantare quattro semi (replicati) per ogni linea vegetale in piccoli appartamenti spingendo i semi di circa 1/2 pollice nel terreno con il dito e coprendo leggermente il terreno(figure 1A e 1B). Non imballare il terreno sopra il seme. Piantare il seme più in profondità o imballare il terreno sul seme può causare problemi con l'emergere della piantina.</li>
	<li>Innaffia i semi nel terreno. Assicurarsi che il terreno sia imbevuto e che i semi rimangano sotto il terreno dopo l'irrigazione.</li>
	<li>Dopo l'irrigazione, posizionare le piante in una camera di crescita con ambienti diurni e notturni di temperatura di 28/20 °C e 14/10 ore di fotoperiodo, rispettivamente e circa 500 μmol/m2 sec   di radiazioni fotosinteticamente attive nella parte superiore del baldacchino. Mantenere l'umidità relativa durante il giorno e la notte rispettivamente a circa il 70% e il 90%.</li>
	<li>Mantenere tutte le piante nella stessa camera di crescita per mantenere un ambiente di crescita congruente durante l'esperimento.</li>
	<li>Dopo 10 giorni, rimuovere le piante dalla camera di crescita e inoculare le piante con la coltura di sospensione cellulare U. maydis utilizzando un metodo di inoculazione dell'iniezione di ago. Nota: Le piante di mais possono essere inoculate 7 giorni dopo la semina8-10. Tuttavia, le piante di teosinte sono troppo piccole dopo 7 giorni. Pertanto, inoculare sia il mais che le piante di teosinte 10 giorni dopo la semina per verificarsi la coerenza all'interno dell'esperimento (vedere fase 2.12).</li>
</ol>2. Inoculazione dell'iniezione di ago
<ol><li>Fai tutto il lavoro in un cappuccio a flusso laminare. Rimuovere le scorte di glicerolo U. maydis dallo stoccaggio del congelatore. Utilizzare un ciclo sterile e scorte di glicerolo striato di ceppi di tipo selvatico U. maydis 1/2 (tipo di accoppiamento a1b1) e 2/9 (accoppiamento di tipo a2b2, vicino isogenico a 1/2) su piatti di agar destrosio di patate (PDA). Mantenere i ceppi separatamente.</li>
	<li>Posizionare le piastre PDA striate con U. maydis in un incubatore a 30 °C per due giorni. Se si utilizza un diverso agente patogeno biotrofico utilizzare il ceppo, i mezzi e le condizioni di crescita appropriati. Monitorare la crescita dell'agente patogeno durante il periodo di due giorni per garantire che il ceppo di Maydis negli Stati Uniti sta crescendo bene.</li>
	<li>Rimuovere le piastre PDA dall'incubatore dopo due giorni. Le piastre devono avere una buona crescita patogena e contenere singole colonie(figura 2A). È importante ottenere singole colonie. Se le singole colonie non sono presenti riposano le piastre a una concentrazione inferiore.</li>
	<li>Fai tutto il lavoro in una cappa di flusso laminare. Utilizzare uno stuzzicadenti sterile per selezionare una singola colonia per ogni ceppo dalle piastre PDA. Posizionare lo stuzzicadenti contenente una singola colonia in un brodo di destrosio di patate da 3 ml (PDB). Si consiglia di avere 2-3 culture.</li>
	<li>Mettere le colture PDB da 3 ml in un incubatore/agitatore a 30 °C per due giorni a 200 giri/min. Monitora la crescita della cultura nel periodo di due giorni per garantire la crescita della cultura. La cultura dovrebbe apparire molto nuvolosa.</li>
	<li>Rimuovere le colture liquide dall'incubatore/agitatore e misurare la concentrazione a OD600 per assicurarsi che le cellule siano state coltivate ad un OD di 1,0 (~1 x 107 cellule/ml)17.</li>
	<li>Portare le colture di sospensione cellulare U. maydis ad una concentrazione finale di 1 x 106 cellule/ml, utilizzando acqua in un volume finale di coltura di 30 ml. Questa concentrazione si traduce costantemente in una buona infezione delle piante con la coltura di sospensione cellulare patogena. 17 di cui: la commissione per i 
</li>
</ol>Nota: Varie concentrazioni di sospensione cellulare devono essere testate quando si utilizzano diversi ceppi patogeni per determinare il titolo cellulare appropriato necessario per l'inoculazione18,19. La concentrazione finale data per la coltura di sospensione cellulare può essere utilizzata come punto di partenza per la tura. L'adeguata concentrazione della coltura di sospensione cellulare patogena deve essere verificata visualizzando i fenotipi vegetali con una buona infezione (figure 3A-E).
<ol start="8"><li>Mescolare volumi uguali dei due ceppi di U. maydis prima dell'inoculazione. Se si utilizza un ceppo patogeno procedere al passaggio 2.9. Preparare nuove colture di sospensione cellulare U. maydis per ogni esperimento di inoculazione e scartare le colture di sospensione cellulare dopo due giorni.</li>
	<li>Per l'inoculazione sperimentale dell'iniezione di ago, riempire una siringa da 3 ml con la coltura di sospensione cellulare U. maydis disegnando la coltura di sospensione cellulare nella siringa.</li>
	<li>Per l'inoculazione dell'iniezione dell'ago di controllo, riempire una siringa da 3 ml conacqua 17. Utilizzare la stessa procedura per l'inoculazione sperimentale dell'iniezione di ago.</li>
	<li>Attaccare un ago ipodermico da 0,457 mm x 1,3 cm all'estremità di ogni siringa da 3 ml. La dimensione selezionata dell'ago fornirà la coltura di sospensione cellulare tra le foglie della pianta con danni minimi al tessuto vegetale.</li>
	<li>Rimuovere gli impianti sperimentali e di controllo dalla camera di crescita 10 giorni dopo la semina in preparazione delle inoculazioni di iniezione dell'ago(figura 2B)(vedere fase 1.7).</li>
	<li>Inserire con cura l'ago ipodermico contenente la coltura di sospensione cellulare U. maydis nel gambo di una pianta sperimentale con un angolo di 90° appena sopra la linea del suolo. Inserire l'ago fino a quando non si trova al centro dello stelo. Non spingere l'ago attraverso lo stelo (Figura 2C).</li>
	<li>Iniettare l'impianto sperimentale con circa 100 μl della coltura di sospensione cellulare U. maydis 18,19. Questo varierà leggermente a seconda dell'altezza della piantina. La coltura della sospensione cellulare spingerà attraverso il gambo e si sposterà nel vortice della pianta. La coltura di sospensione cellulare sarà visibile nel vortice della pianta. Continuare a iniettare 100 μl della coltura di sospensione cellulare in ogni singola pianta fino a quando la siringa da 3 ml è vuota.</li>
	<li>Dopo l'iniezione, rimuovere con cura l'ago dallo stelo della pianta. Rimuovere l'ago dalla siringa da 3 ml ora vuota e riempire con acqua. Attaccare l'ago alla siringa e spingere l'acqua attraverso l'ago per rimuovere qualsiasi tessuto vegetale che può essere catturato nella punta dell'ago.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2.9 a 2.15 per ogni impianto sperimentale. Seguire lo stesso protocollo per gli impianti di controllo iniettando acqua.</li>
	<li>Riposizionare gli impianti sperimentali e di controllo inoculati nella camera di crescita. Innaffiare le piante ogni giorno bagnando il terreno non il tessuto vegetale.</li>
	<li>Controllare quotidianamente le piante per rilevare lo sviluppo di agenti patogeni e le reazioni di resistenza delle piante.</li>
</ol>3. Screening della reazione di resistenza
<ol><li>Segnare e registrare le reazioni di resistenza per ogni pianta 7, 10, 14 e 21 giorni dopo l'inoculazione (dpi) utilizzando una scala di valutazione della reazione di resistenza da 1 a 5. La gravità della malattia aumenta con l'aumentare dei valori numerici nella scala di classificazione (tabella 2). Una reazione di resistenza 1C (clorosi fogliare), 1A (produzione di antocianina fogliare) o 2 (piccole galle fogliari) indica resistenza. A 3 (galle staminali), 4 (galla basale) o 5 (morte vegetale) la reazione di resistenza indica suscettibilità(figure 3A-E e tabella 2)18,19.</li>
	<li>Segna impianti sperimentali e di controllo e registra i livelli di reazione di resistenza.</li>
	<li>Confrontare le reazioni di resistenza degli impianti sperimentali e di controllo. Selezionare piante sperimentali con una resistenza di reazione 1C, 1A o 2. Queste piante sono considerate resistenti a U. maydis18,19.</li>
	<li>Ripetere l'intero esperimento per verificare i fenotipi della pianta.</li>
</ol>

<ol>
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S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+tumors+caused+by+Ustilago+maydis+require+organ-specific+genes+in+host+and+pathogen.">Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen.</a> Sci.. 328, 89-92 (2010).</li><li>Kamper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+maize+plants+expressing+the+Totivirus+antifungal+protein,+KP4,+are+highly+resistant+to+corn+smut.">Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut.</a> Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).</li><li>Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+regulatory+subunit+of+a+cAMP-Dependent+protein+kinase+is+required+for+gall+formation+in+maize.">The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize.</a> , (1997).</li><li>Gold, S. E., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+two+chitin+syn-+thase+genes+in+the+phytopathogenic+fungus+Ustilago+maydis.">Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis.</a> Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).</li><li>Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ustilago+maydis+as+a+Pathogen.">Ustilago maydis as a Pathogen.</a> Annu. Rev. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indole-3-acetic+acid+(IAA)+biosynthesis+in+the+smut+fungus+Ustilago+maydis+and+its+relevance+for+increased+IAA+levels+in+infected+tissue+and+host+tumor+formation.">Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation.</a> Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).</li><li>Mart&#237;nez-Espinoza, A., Garc&#237;a-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilaginales+as+Plant+Pests+and+Model+Systems.">The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems.</a> Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).</li><li>Banuett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Ustilago+maydis,+a+fungal+pathogen+that+induces+tumors+in+maize.">Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize.</a> Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).</li><li>Keen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+plant+pathology:+a+retrospective+view+on+understanding+host-parasite+interactions.">A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo studio il metodo di inoculazione dell'iniezione di ago utilizzato per fornire un ceppo di U. maydis nel gambo di 700 piante di mais e teosinte ha avuto successo. Inoltre, è stata utilizzata una scala di valutazione della resistenza alle malattie rivista per migliorare le piante e rilevare lo sviluppo di agenti patogeni. Come risultato dell'utilizzo di entrambi i metodi, le linee vegetali resistenti agli U. maydis sono state identificate tra 700 piante di mais e teosinte che ora possono essere...

Le malattie fungine delle piante rappresentano una delle minacce più eminenti per l'agricoltura. La necessità di sviluppare colture con una migliore resistenza alle malattie è in aumento a causa del fabbisogno alimentare di una popolazione mondiale in crescita. Gli agenti patogeni vegetali infettano naturalmente le piante coltivate sul campo causando malattie che hanno un impatto negativo sulla resa dellecolture 6. È stato dimostrato che identificare e utilizzare piante resistenti può migliorare la resistenza e ridurre la perdita di resa. Cultivar resistenti sono state identificate in molte specie vegetali tra cui mais, grano, riso e sorgo inoculando le piante con un agente patogeno vegetale e selezionando per linee resistenti7. Pertanto, lo sviluppo e l'uso di un metodo di inoculazione efficiente consentirebbero a molte piante di essere inoculate e vengono vengono utilizzati metodi di inoculazione e schermamento della resistenza. Sono stati utilizzati vari metodi di inoculazione tra cui l'inoculazione del tuffo, la pipettazione della coltura di sospensione delle cellule patogene nel vortice della pianta e l'inoculazione dell'iniezione diago 8-11. Con ogni metodo, l'agente patogeno deve essere introdotto in modo affidabile tra le foglie della pianta in cui l'agente patogeno entra nella pianta attraverso la formazione di appresoria per garantire lo sviluppo patogenoe l'infezione delle piante 12,13.
Il metodo di inoculazione del tuffo prevede l'immersione di una piantina vegetale in una coltura di sospensione cellulare patogena, mentre il metodo di pipettaggio richiede di posizionare la coltura di sospensione cellulare patogena nel vortice della piantina vegetale. Tuttavia, ci sono problemi con entrambi i metodi. In primo luogo, entrambi i metodi dipendono dal movimento naturale dell'agente patogeno dalla superficie fogliare nel tessuto vegetale che è altamente variabile. La maggior parte degli agenti patogeni entra naturalmente nella pianta attraverso aperture stomatali o ferite sulla superficie fogliare della pianta. Tuttavia, c'è una significativa variabilità nella capacità degli agenti patogeni di penetrare nella superficie fogliare vegetale attraverso gli stomi e / o le ferite sulla superficie fogliare. Pertanto, la penetrazione dell'agente patogeno non può essere controllata con un metodo di inoculazione che potrebbe portare a dati incoerenti. In secondo luogo, quando si vaglia un gran numero di piante, immergere le piantine in una coltura di sospensione cellulare patogena può richiedere molto tempo e può limitare il numero di piante che possono essere schermate. Al contrario, il protocollo di inoculazione dell'iniezione di ago descritto nel presente documento fornisce la coltura di sospensione cellulare patogena tra le foglie della pianta facilitando la formazione di appressoria14. L'agente patogeno utilizza quindi gli appressori di nuova sviluppo per entrare nella pianta eliminando il problema della penetrazione dell'agente patogeno. Inoltre, il protocollo di inoculazione dell'iniezione di ago fornisce una gamma di fenotipi per piante di mais e teosinte che sono state inoculate con U. maydis e dimostrano una buona infezione. I fenotipi possono essere usati come marcatore per determinare la migliore concentrazione per la coltura di sospensione cellulare patogena con conseguente fenotipi vegetali coerenti all'interno e tra diversi esperimenti.
A seguito dell'inoculazione delle piante con una coltura di sospensione cellulare patogena, le piante sono in genere schermate per rilevare un fenotipo resistente osuscettibile 8-11,15. Mentre le scale di valutazione della malattia sono state ampiamente utilizzate per schermare e classificare i fenotipi delle piante, le scale di classificazione differiscono a seconda dell'agente patogeno analizzato. Pertanto, uno stabilimento di protocollo sulla scala di classificazione delle malattie per le interazioni u. maydis e mais può essere utilizzato per agenti patogenifungini simili 16.
La presente serie di protocolli descrive in dettaglio l'inoculazione dell'iniezione di aghi con una coltura di sospensione cellulare U. maydis e lo screening della reazione di reazione di resistenza alle malattie di mais, teosinte e mais x linee di introgressione teosinte. I protocolli attuali non si limitano all'inoculazione dell'iniezione di aghi di U. maydis nelle piante di mais, ma possono essere utilizzati per relativamente qualsiasi agente patogeno fungino e specie vegetale. Pertanto, includere i dettagli di entrambi i metodi nello stesso protocollo consentirà ai ricercatori di utilizzare direttamente i protocolli per l'inoculazione e lo screening o di manipolare i protocolli originali per adattarsi meglio all'agente patogeno e alle specie vegetali di interesse.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed for plants</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Collected from original crosses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Conviron</td>
			<td>PGR14 REACH-IN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planting flats</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>14-3385-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>10-1059-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Lab Conoco</td>
			<td>70875372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stocks were grown from original culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile loop</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S17356A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato dextrose agar (PDA) plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R454311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator set to 30 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-690-650F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile toothpicks</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Purchased from Walmart and sterilized by autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato dextrose broth (PDB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1008617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator-shaker set to 30 &#176;C</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>14-278-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4001000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U. maydis&#160;cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Grown from glycerol stock as described in the methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles</td>
			<td>Kendall Brands</td>
			<td>8881250321</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and efficient method for assessing pathogenicity of ustilago maydis on maize and teosinte lines

Il mais è una delle principali colture cerealicole in tutto il mondo. Tuttavia, la suscettibilità agli agenti patogeni biotrofici è il vincolo primario per aumentare la produttività. U. maydis è un agente patogeno fungino biotrofico e l'agente causale del mais sul mais. Questa malattia è responsabile di perdite di resa significative di circa $ 1,0 miliardi all'anno negli StatiUniti 1 Diversi metodi tra cui la rotazione delle colture, l'applicazione di fungicidi e i trattamenti delle sementi sono attualmente utilizzati per controllare il mal di mais2. Tuttavia, la resistenza dell'ospite è l'unico metodo pratico per gestire il malumore di mais. L'identificazione delle piante coltivate tra cui mais, grano e riso resistenti a vari agenti patogeni biotrofi ha diminuito significativamente le perdite diresa ogni anno 3-5. Pertanto, l'uso di un metodo di inoculazione patogena che fornisca in modo efficiente e riproducibile l'agente patogeno tra le foglie delle piante, faciliterebbe la rapida identificazione delle linee di mais resistenti a U. maydis. Come, un primo passo verso l'identificazione delle linee di mais resistenti a U. maydis, un metodo di inoculazione dell'iniezione di ago e un metodo di screening della reazione di resistenza è stato utilizzato per inoculare le linee di introgressione di mais, teosinte e mais x teosinte con un ceppo di U. maydis e per selezionare piante resistenti.
Le linee di introgressione di mais, teosinte e mais x teosinte, costituite da circa 700 piante, sono state piantate, inoculate con un ceppo di U. maydise vengono schernite per la resistenza. I metodi di inoculazione e screening hanno identificato con successo tre linee di teosinte resistenti a U. maydis. Qui viene presentato un protocollo dettagliato di inoculazione dell'iniezione di ago e screening della reazione di resistenza per le linee di introgressione di mais, teosinte e mais x teosinte. Questo studio dimostra che l'inoculazione dell'iniezione di aghi è uno strumento inestimabile in agricoltura in grado di fornire efficacemente U. maydis tra le foglie delle piante e ha fornito linee vegetali resistenti a U. maydis che ora possono essere combinate e testate nei programmi di allevamento per una migliore resistenza alle malattie.

Un'inoculazione riuscita dell'iniezione di ago può essere determinata visualizzando il fenotipo delle piante inoculate con U. maydis (sperimentale). La maggior parte delle piante sperimentali erano suscettibili all'infezione da U. maydis. Le piante sensibili hanno mostrato uno sviluppo di malattie molto grave dimostrato dalla formazione di staminali e galle basali con teliospore nere(figure 3D e 3E, tabella 2). Diverse piante erano morte dopo l'inocul...

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A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

Viene descritto l'uso di un metodo di iniezione dell'ago per inoculare il mais e le piante teosinte con l'agente patogeno biotrofico Ustilago maydis. Il metodo di inoculazione dell'iniezione dell'ago facilita la somministrazione controllata dell'agente patogeno fungino tra le foglie della pianta in cui l'agente patogeno entra nella pianta attraverso la formazione di appresoria. Questo metodo è altamente efficiente, consentendo inoculazioni riproducibili con U. maydis.

Un metodo rapido ed efficiente per valutare la patogenicità dei maydis di Ustilago sulle linee di mais e teosinte

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

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Research

JoVE Journal

Environment

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

8.4K Views.  University of Georgia. Viene descritto l'uso di un metodo di iniezione dell'ago per inoculare il mais e le piante teosinte con l'agente patogeno biotrofico Ustilago maydis. Il metodo di inoculazione dell'iniezione dell'ago facilita la somministrazione controllata dell'agente patogeno fungino tra le foglie della pianta in cui l'agente patogeno entra nella pianta attraverso la formazione di appresoria. Questo metodo è altamente efficiente, consentendo inoculazioni riproducibili con 

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Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. Unfortunately, traditional benthic larval sampling methods, such as the dip-net, can be time-consuming and expensive. An alternative protocol involves collection of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Chironomidae is a species-rich family of flies (Diptera) whose immature stages typically occur in aquatic habitats. Adult chironomids emerge from the water, leaving their pupal skins, or exuviae, floating on the water&#8217;s surface. Exuviae often accumulate along banks or behind obstructions by action of the wind or water current, where they can be collected to assess chironomid diversity and richness. Chironomids can be used as important biological indicators, since some species are more tolerant to pollution than others. Therefore, the relative abundance and species composition of collected SFPE reflect changes in water quality. Here, methods associated with field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of chironomid SFPE are described in detail. Advantages of the SFPE method include minimal disturbance at a sampling area, efficient and economical sample collection and laboratory processing, ease of identification, applicability in nearly all aquatic environments, and a potentially more sensitive measure of ecosystem stress. Limitations include the inability to determine larval microhabitat use and inability to identify pupal exuviae to species if they have not been associated with adult males.

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrates are often used to monitor and assess water quality. An efficient protocol involves collections of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Here, techniques for field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of Chironomidae SFPE are described.

Uso di Chironomidae (Ditteri) pupa esuvie come Rapid Bioassessment protocollo per i corpi idrici-galleggiante Surface

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

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Ambiente

The Use of an Automated System (GreenFeed) to Monitor Enteric Methane and Carbon Dioxide Emissions from Ruminant Animals

Ruminant animals (domesticated or wild) emit methane (CH4) through enteric fermentation in their digestive tract and from decomposition of manure during storage. These processes are the major sources of greenhouse gas (GHG) emissions from animal production systems. Techniques for measuring enteric CH4 vary from direct measurements (respiration chambers, which are highly accurate, but with limited applicability) to various indirect methods (sniffers, laser technology, which are practical, but with variable accuracy). The sulfur hexafluoride (SF6)&#160;tracer gas method is commonly used to measure enteric CH4 production by animal scientists and more recently, application of an Automated Head-Chamber System (AHCS) (GreenFeed, C-Lock, Inc., Rapid City, SD), which is the focus of this experiment, has been growing. AHCS is an automated system to monitor CH4 and carbon dioxide (CO2) mass fluxes from the breath of ruminant animals. In a typical AHCS operation, small quantities of baiting feed are dispensed to individual animals to lure them to AHCS multiple times daily. As the animal visits AHCS, a fan system pulls air past the animal&#8217;s muzzle into an intake manifold, and through an air collection pipe where continuous airflow rates are measured. A sub-sample of air is pumped out of the pipe into non-dispersive infra-red sensors for continuous measurement of CH4 and CO2 concentrations. Field comparisons of AHCS to respiration chambers or SF6 have demonstrated that AHCS produces repeatable and accurate CH4 emission results, provided that animal visits to AHCS are sufficient so emission estimates are representative of the diurnal rhythm of rumen gas production. Here, we demonstrate the use of AHCS to measure CO2 and CH4 fluxes from dairy cows given a control diet or a diet supplemented with technical-grade cashew nut shell liquid.

The Use of an Automated System GreenFeed to Monitor Enteric Methane and Carbon Dioxide Emissions from Ruminant Animals

Accuracy and precision of the techniques used to measure methane emissions from ruminant animals are critically important for the success of greenhouse gas mitigation efforts. This manuscript describes the principles and operation of an automated system to monitor methane and carbon dioxide mass fluxes from the breath of ruminant animals.

L&#39;uso di un sistema automatizzato (GreenFeed) per monitorare enterica metano e anidride carbonica Emissioni dei ruminanti

Ruminant animals (domesticated or wild) emit methane (CH4) through enteric fermentation in their digestive tract and from decomposition of manure during ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ecological interactions. Arthropods are usually tracked in nature by tagging them with a unique mark and then re-collecting them over time and space to determine their dispersal capabilities. In addition to actual physical tags, such as colored dust or paint, various types of proteins have proven very effective for marking arthropods for ecological research. Proteins can be administered internally and/or externally. The proteins can then be detected on recaptured arthropods with a protein-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Here we describe protocols for externally and internally tagging arthropods with protein. Two simple experimental examples are demonstrated: (1) an internal protein mark introduced to an insect by providing a protein-enriched diet and (2) an external protein mark topically applied to an insect using a medical nebulizer. We then relate a step-by-step guide of the sandwich and indirect ELISA methods used to detect protein marks on the insects. In this demonstration, various aspects of the acquisition and detection of protein markers on arthropods for mark-release-recapture, mark-capture, and self-mark-capture types of research are discussed, along with the various ways that the immunomarking procedure has been adapted to suit a wide variety of research objectives.

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Amministrazione e Rilevamento di segni di proteine ​​su artropodi per Dispersione ricerca

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

Reliable Method for Assessing Seed Germination, Dormancy, and Mortality under Field Conditions

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester fabric and glue can be folded and glued to construct a strip of compartments that house seeds and identifying information, while allowing contact with soil leachate, water, microorganisms, and ambient temperature. Strips may be constructed with a wide range of compartment numbers and sizes and allow the researcher to house a variety of genotypes within a single species, different species, or seeds that have experienced different treatments. As opposed to individual seed packets, strips are more easily retrieved as a unit. While replicate packets can be included within a strip, different strips can act as blocks or can be retrieved at different times for observation of seed behavior over time. We used a high temperature glue gun to delineate compartments and sealed the strips once the seed and tags identifying block and removal times were inserted. The seed strips were then buried in the field at the desired depth, with the location marked for later removal. Burrowing animal predators were effectively excluded by use of a covering of metal mesh hardware cloth on the soil surface. After the selected time interval for burial, strips were dug up and seeds were assessed for germination, dormancy and mortality. While clearly dead seeds can often be distinguished from ungerminated living ones by eye, dormant seeds were conclusively identified using a standard Tetrazolium chloride colorimetric test for seed viability.

Here we present a protocol for assessing seed survivorship, germination and dormancy under field conditions using buried, labeled seed strips and tetrazolium chloride (TZ) viability testing.

Metodo affidabile per valutare la germinazione dei semi, dormienza, e mortalità in normali condizioni operative

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which promotes growth of large weaponry and body size. Populations of the same species display each phenotype depending on environmental conditions. Although antler and body size of male white-tailed deer (Odocoileus virginianus) varies by physiographic region in Mississippi, USA and is strongly correlated with regional variation in nutritional quality, the effects of population-level genetics from native stocks and previous re-stocking efforts cannot be disregarded. This protocol describes how we designed a controlled study, where other factors that influence phenotype, such as age and nutrition, are controlled. We brought wild-caught pregnant females and six-month-old fawns from three distinct physiographic regions in Mississippi, USA to the Mississippi State University Rusty Dawkins Memorial Deer Unit. Deer from the same region were bred to produce a second generation of offspring, allowing us to assess generational responses and maternal effects. All deer ate the same high-quality (20% crude protein deer pellet) diet ad libitum. We uniquely marked each neonate and recorded body mass, hind foot, and total body length. Each subsequent fall, we sedated individuals via remote injection and sampled the same morphometrics plus antlers of adults. We found that all morphometrics increased in size from first to second generation, with full compensation of antler size (regional variation no longer present) and partial compensation of body mass (some evidence of regional variation) evident in the second generation. Second generation males that originated from our poorest quality soil region displayed about a 40% increase in antler size and about a 25% increase in body mass when compared to their wild harvested counterparts. Our results suggest phenotypic variation of wild male white-tailed deer in Mississippi are more related to differences in nutritional quality than population-level genetics.

Phenotypic differences among cervid populations may be related to population-level genetics or nutrition; discerning which is difficult in the wild. This protocol describes how we designed a controlled study where nutritional variation was eliminated. We found that phenotypic variation of male white-tailed deer was more limited by nutrition than genetics.

Protocollo per la valutazione degli effetti relativi di ambiente e genetica sulla Antler e la crescita del corpo per un cervide longevo

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic pathway of dimethylarsinic acid (DMAV) thiolation, have been recently found in the environment as well as human organs. DMMTAV and DMDTAV can be quantified to determine the ecological effects of dimethylated thioarsenicals and their stability in environmental media. The synthesis method for these compounds is unstandardized, making replicating previous studies challenging. Furthermore, there is a lack of information about storage techniques, including storage of compounds without species transformation. Moreover, because only limited information about synthesis methods is available, there may be experimental difficulties in synthesizing standard chemicals and performing quantitative analysis. The protocol presented herein provides a practically modified synthesis method for the dimethylated thioarsenicals, DMMTAV and DMDTAV, and will help in the quantification of species separation analysis using high performance liquid chromatography in conjunction with inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS). The experimental steps of this procedure were modified by focusing on the preparation of chemical reagents, filtration methods, and storage.

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

This article presents modified experimental protocols for dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV) synthesis, inducing dimethylarsinic acid (DMAV) thiolation through mixing of DMAV, Na2S, and H2SO4. The modified protocol provides an experimental guideline, thereby overcoming limitations of the synthesis steps that could have caused experimental failures in quantitative analysis.

Preparazione di MAURIZIOBANDIERIV e DMDTAV mediante DMAV per applicazioni ambientali: sintesi, purificazione e conferma

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

The Hawaii Protocol for Scientific Monitoring of Coffee Berry Borer: a Model for Coffee Agroecosystems Worldwide

Coffee berry borer (CBB) is the most devastating insect pest for coffee crops worldwide. We developed a scientific monitoring protocol that is aimed at capturing and quantifying the dynamics and impact of this invasive insect pest as well as the development of its host plant across a heterogeneous landscape. The cornerstone of this comprehensive monitoring system is timely georeferenced data collection on CBB movement, coffee berry infestation, mortality by the fungus Beauveria bassiana, and coffee plant phenology via a mobile electronic data recording application. This electronic data collection system allows field records to be georeferenced through built-in global positioning systems, and is backed by a network of weather stations and records of farm management practices. Comprehensive monitoring of CBB and host plant dynamics is an essential part of an area-wide project in Hawaii to aggregate landscape-level data for research to improve management practices. Coffee agroecosystems in other parts of the world that experience highly variable environmental and socioeconomic factors will also benefit from implementing this protocol, in that it will drive the development of customized integrated pest management (IPM) to manage CBB populations.

Comprehensive monitoring of coffee berry borer and host plant dynamics is essential for aggregating landscape-level data to improve management of this invasive pest. Here, we present a protocol for scientific monitoring of coffee berry borer movement, infestation, mortality, coffee plant phenology, weather, and farm management via a mobile electronic data recording application.

Il protocollo di Hawaii per monitoraggio scientifico di Coffee Berry Borer: un modello per caffè agroecosistemi in tutto il mondo

Coffee berry borer (CBB) is the most devastating insect pest for coffee crops worldwide. We developed a scientific monitoring protocol that is aimed at ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

Un flessibile a basso costo sistema idroponico per valutare le risposte della pianta a piccole molecole in condizioni sterili

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole grain composition and processing characteristics vary among maize hybrids and can impact the quality of the final processed product. Therefore, in order to produce healthier processed food products from maize, it is necessary to know how to optimize processing parameters for particular sets of germplasm to account for these differences in grain composition and processing characteristics. This includes a better understanding of how current processing techniques impact the nutritional quality of the final processed food product. Here, we describe a microscale protocol that both simulates the processing pipeline to produce cornflakes from large flaking grits and allows for the processing of multiple grain samples simultaneously. The flaking grits, the intermediate processed products, or final processed product, as well as the corn grain itself, can be analyzed for nutritional content as part of a high-throughput analytical pipeline. This procedure was developed specifically for incorporation into a maize breeding research program, and it can be modified for other grain crops. We provide an example of the analysis of insoluble-bound ferulic acid and p-coumaric acid content in maize. Samples were taken at five different processing stages. We demonstrate that sampling can take place at multiple stages during microscale processing, that the processing technique can be utilized in the context of a specialized maize breeding program, and that, in our example, most of the nutritional content was lost during food product processing.

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Here, we present a microscale protocol for processing grain samples and for incorporating this microscale approach into a high-throughput analytical pipeline. This is a higher throughput adaptation of currently available protocols.

Alto-rendimento, Microscale protocollo per l'analisi dei parametri di elaborazione e qualità nutrizionali in mais (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

Valutare le capacità di rimozione del particolato di albero foglie

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...