Este trabajo fue apoyado por becas de La Fondation Yves Cotrel de l&#39;Institut de France, París, Francia (a Dr. Moreau), los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (Grant PP2-99466 con el Dr. Moreau) y de Cuarta Dimensión Spine LLC , Nueva York, EE.UU. (Beca de investigación del Dr. Moreau).

Todo el procedimiento se lleva a cabo bajo el capó biológica estéril y todas las soluciones y equipo que entren en contacto con las células deben ser estériles. 1. Preparación de las soluciones Esenciales <ol><li> Preparar soluciones de acuerdo con la Tabla 1. </li><li> Mantener la solución salina equilibrada (BSS) a temperatura ambiente y todas las demás soluciones a 4 º C hasta el momento del uso. </li><li> Medios frío caliente a 37 ° C en el baño de agua durante unos minutos antes de usar. </li></ol> 2. Preparación y almacenamiento de PBMC <ol><li> Recoger 10 ml de sangre completa en tubos de recogida tratados con EDTA para preparar dos alícuotas de PBMC utilizando 5 ml para cada alícuota. </li><li> Transferencia de 5 ml de sangre completa de el tubo de recogida tratada con EDTA a un tubo de 50 ml. </li><li> Añadir un volumen igual de BSS y mezclar la muestra con la pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo. </li><li> Colocar 3 ml de Ficoll en dos 15 ml tubos Falcon. </li><li> Capa con cuidado 4,5 mlde mezcla de sangre diluida sobre el Ficoll en cada tubo. </li><li> Deje que los tubos se apoyan para un máximo de 5 minutos para favorecer una clara separación de la sangre y de Ficoll. </li><li> Centrifugar los tubos a 400 xg durante 30 min a temperatura ambiente sin freno. </li><li> Retire con cuidado los tubos de la centrífuga a fin de no perturbar la estratificación. Las PBMC son visibles en la interfaz BSS / Ficoll. </li><li> Cosecha de la capa de nubes de PBMCs en la interfase de los dos tubos con una pipeta y transferir a un nuevo tubo de 50 ml. </li><li> Añadir 20 ml de medio completo. </li><li> Centrifugar el tubo a 288 xg durante 7 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración. </li><li> Resuspender el sedimento de células en 500 l de los medios de comunicación suplementarios. </li><li> Añadir un volumen igual de medio de congelación. </li><li> Transferir la suspensión celular a un criovial. </li><li> Coloque el vial en un recipiente cryofreezing con isopropanol. </li><li> Guarde el recipiente de congelación a -80 ° C durante la noche. </li><li> Transfer las PBMC congelados alícuotas en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 3. Ensayo funcional 1. Día 1 <ol><li> Coloque alícuota de nitrógeno líquido en baño de agua a 37 ° C durante un minuto o hasta que descongelar. </li><li> Transferir la suspensión celular a un tubo de 50 ml con una pipeta estéril. </li><li> Añadir 15 ml de medio completo y girar hacia abajo las células a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración. </li><li> Suspender suavemente sedimento celular en 1 ml de medio de PHA. </li><li> Completar el volumen a 20 ml con el mismo medio. </li><li> Tape el tubo sin apretar para permitir la entrada de aire. </li><li> Deje el tubo de la noche a 37 ° C en una incubadora de CO 2 para permitir que los linfocitos en reposo como para transformarse en linfoblastos rápidamente proliferantes. </li></ol> 2. Día 2 <ol><li> Tome el tubo de la incubadora, atornillar los tapones por completo y hacer que giren las celdas hacia abajo a 200 xg durante 5 mina temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración. </li><li> Suspender suavemente sedimento celular en 1 ml de medio completo. </li><li> Completar el volumen a 20 ml con el mismo medio. </li><li> Tape el tubo sin apretar para permitir la entrada de aire. </li><li> Deje el tubo durante la noche a 37 ° C en una incubadora de CO 2 para expandir el número de células. </li></ol> 3. Día 3 <ol><li> Obtener el tubo fuera de la incubadora, las tapas de tornillo completamente y girar hacia abajo las células a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración. </li><li> Lavar las células dos veces con 10 ml de medio RPMI-1640 por centrifugación a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 600 l de RPMI-1640. </li><li> Medir la concentración de células y la viabilidad, usando un contador de células automatizado y analizador de viabilidad. </li><li> Añadir el volumen adecuado de RPMI-1640 para ajustarse a una concentración celular de 1,5 x 10 5 cells/20 l. </li&gt; <li> Tratar las células con OPN recombinante (rOPN) o vehículo (PBS) en 1,5 ml de tubos de Eppendorf. <ol><li> Transferir 100 l de suspensión celular a dos 1,5 ml tubos Eppendorf estériles. </li><li> Añadir rOPN en un tubo a una concentración final de 0,5 g / ml. </li><li> Añadir un volumen igual de PBS en el segundo tubo. </li><li> Mezclar con cuidado cada condición por la pipeta hacia arriba y hacia abajo dos veces utilizando un conjunto de pipeta estéril a 100 l. </li></ol></li><li> Preparar la muestra pequeña de 96 pocillos de microplacas. <ol><li> Añadir 5 l de medio RPMI-1640 para cada pocillo. </li><li> Centrifugar la placa a 200 xg durante 3 minutos para eliminar las burbujas de aire. </li></ol></li><li> Seed las células no tratadas así como las células tratadas con rOPN o PBS. <ol><li> Antes de la transferencia de células a partir de tubo para microplacas, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo una vez para asegurar una suspensión uniforme de las células. </li><li> Añadir 40 l de suspensión celular por pocillo por cuadruplicado para células no tratadas, por duplicado para rOPN o PBS las células tratadas. Refer a la Figura 1 para el diseño. Este diseño permite a 12 pacientes a ensayar en la misma microplaca. </li><li> Deje la placa de la célula bajo la campana estéril durante 5 min para permitir que las células descansan y se asientan de manera uniforme a la parte inferior del pozo antes de colocar en la incubadora. </li></ol></li><li> Incubar la placa durante 18 horas a 37 ° C en una incubadora de CO 2 para optimizar el efecto de OPN. </li></ol> 4. Día 4 <ol><li> Ejecute el plato con compuestos. <ol><li> Tome la placa de la incubadora y se deja a temperatura ambiente durante alrededor de 30 min. </li><li> Preparar 1 ml de 100 mM de somatostatina e isoproterenol en medio RPMI-1640 mediante la adición de 10 l de solución madre (10 mM) en 990 l de medio RPMI-1640. </li><li> Llene la placa de compuesto por dispensación 20 l en pocillos apropiados como se indica en la Figura 2. </li><li> Cubrir la placa compuesto con un sello perforable precortado para evitar un cambio en la concentración del compuesto debido a la evaporación anteso durante la incubación en el sistema basado en CDS-. </li><li> Plato de carga celular, puntas de pipeta, y la placa de compuesto en el sistema basado en la CDS-. </li><li> Nombre de la placa en el software del instrumento basado CDS-. </li><li> Seleccione el protocolo apropiado. El protocolo editado para la clasificación con PBMCs se denomina &quot;células Agonist no adherentes Small Plate Sample RT 15 min. Vaya al cuadro de protocolo y seleccione este protocolo en la lista de protocolos </li><li> Iniciar el protocolo haciendo clic en &quot;Inicio&quot;. </li><li> El sistema de fluidos integrado añade simultáneamente los compuestos a todos los pocillos mediante la inyección de 5 l por pocillo para lograr una concentración final de 10 mM en un volumen total de 50 l. </li><li> El sistema basado en CDS-recoge automáticamente los datos para 15 minutos después de la adición del compuesto. </li></ol></li><li> Análisis de los datos <ol><li> Seleccione las gamas bajas y altas de las frecuencias a utilizar en el cálculo de los valores extraídos de la nocélulas adherentes. </li><li> Seleccionar corrección de deriva para corregir el cambio lineal en las mediciones de impedancia de línea de base en el tiempo. </li><li> Seleccione el filtrado de datos para reducir las variaciones en la medición de la respuesta cinética debido al ruido electrónico y la adición del compuesto. </li><li> Seleccione el método de Max-Min para el tiempo de análisis completo. </li><li> Exportar datos a Excel en virtud de la opción de formato de placa. </li><li> Calcular el delta G (Delta G) restando el promedio de magnitud de la respuesta a la estimulación Gi (RMGI) a partir de la media de la magnitud de la respuesta a la estimulación Gs (RMGS) utilizando la siguiente fórmula: Delta G = RMGI - RMGS </li><li> Calcular el porcentaje del efecto de plegado (Fe) de OPN en respuesta mediada por Gi dividiendo la media de la magnitud de la respuesta a Gi estimulación en presencia de OPN (RmGiOPN) con la media de la magnitud de la respuesta a Gi estimulación en presencia de PBS ( RmGiPBS) utilizando la siguiente fórmula: Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li> Consulte T2 capaz de clasificar a los pacientes. </li></ol></li></ol>

<ol>
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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cellular+dielectric+spectroscopy,+a+whole-cell,+label-free+technology+for+drug+discovery+on+Gi-coupled+GPCRs.">Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs.</a> J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).</li><li>Peters, M. F., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cellular+impedance+assays+for+detection+of+GPCR+pleiotropic+signaling+and+functional+selectivity.">Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity.</a> J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+Gi-coupled+receptor+signaling+occurs+in+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis.</a> J. Clin. Invest. , (2013).</li></ol>

Este trabajo condujo a varias patentes sostenga por el Hospital de la Universidad Sainte-Justine y muchos otros están pendientes en varios países. Cuarta Dimensión Spine LLC es el licenciatario exclusivo del Hospital Universitario de Sainte-Justine.

Hemos descrito un procedimiento detallado de una prueba basada en células pronóstico de la escoliosis idiopática, que es aplicable a las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) recién aisladas o conservado congelado hasta por un año en el nitrógeno líquido. Dado que el uso PBMCs aisladas recientemente es engorroso al probar gran número de personas, el procedimiento se presentó con PBMC congelados que ofrecen una alternativa más práctica en el ámbito clínico. Sin embargo, se encontraron problemas con la aglutinación de células después de la descongelación cuando se utilizaron inicialmente CMSP congeladas, lo que lleva a veces a la variabilidad inter-ensayo. Para maximizar la reproducibilidad del ensayo, se recomienda evitar el ciclo de congelación-descongelación y el uso de la muestra congelada sólo una vez. El procedimiento es muy sencillo, lo que permite una detección precisa de la función de la proteína Gi defectuoso en un corto período de tiempo. Usando este procedimiento, los niños asintomáticos y escolióticas se pueden clasificar fácilmente para predecir mejor su evolución clínica sin ningún peligro para su salud. Hobargo, cuando se realiza la clasificación de acuerdo con el grado de máxima respuesta a Gi estimulación en relación con los sujetos control sanos 12, debe cumplirse una serie de requisitos para los sujetos de control. De hecho, con el fin de tener una cohorte de comparación adecuada, los sujetos de control debe ser la edad y acompañado de género, no puede estar en cualquier tipo de medicación, y proporcionar información privada, como la historia pasado individual / familiar médica. Estos requisitos pueden constituir un obstáculo importante para el reclutamiento de los sujetos de control. Por lo tanto, la realización de clasificación mediante el examen del grado de desequilibrio entre la respuesta a Gi y Gs proteína de estimulación en el mismo individuo es ideal para eliminar la necesidad de utilizar los sujetos de control. El uso del sistema basado en CDS-para llevar a cabo esta prueba de pronóstico es significativa en términos de proporcionar simultáneamente Gi-y las respuestas celulares mediadas por Gs en el mismo ensayo. Aunque muchos pacientes se pueden clasificar sin amambigüedad usando el rango dinámico fijo para este ensayo, un pequeño número de pacientes se exhibir valores en el límite de rangos, como se ilustra por los resultados del presente informe. Para discriminar estos individuos, hemos introducido la evaluación del efecto de OPN en respuesta a la estimulación Gi mediante la demostración de que la OPN induce un efecto diferencial sobre la respuesta celular mediada por Gi entre los tres grupos funcionales. De hecho, encontramos que en presencia de OPN, respuesta a Gi de estimulación aumenta en FG1, mientras que disminuye en FG2 y GD3, en un grado mayor en FG2. A pesar de los altos costos de OPN, el uso de esta quimiocina es esencial para distinguir los casos ambiguos, y por lo tanto mejorar la precisión de nuestro ensayo de clasificación. Sin embargo, este ensayo tiene la desventaja de que se requiere un mínimo de 1,5 x 10 5 células por pocillo para observar la respuesta celular con el sistema basado CDS-bajo nuestras condiciones experimentales. Ciertas muestras de los pacientes no tienen un número suficiente decélulas para ser probados. En este caso, es necesario recordar a los pacientes durante la extracción de sangre adicional, que puede ser preocupante para las familias y frustrante para el personal médico y de laboratorio. Se planean estudios futuros en nuestro laboratorio para abordar esta cuestión. Sin embargo, el protocolo actual se basa en métodos simples y probadas para preparar células mientras que la prueba se automatiza utilizando un sistema libre de etiquetas validado 13, 14 para monitorear las respuestas de las células. La plataforma de pruebas es relativamente barato en comparación con la plataforma genética disponible para el pronóstico de otras enfermedades. Además, el costo de todos los materiales desechables, incluyendo los tubos de recogida de sangre, consejos, el electrodo especial microplacas y cónica y tubos Eppendorf, no es muy caro y se estima en menos de 3.000 dólares para completar una prueba de aproximadamente mil pacientes. Aunque esta estimación no incluye los costos de mano de obra para la preparación de muestrasy la realización de la prueba, esta prueba sigue siendo considerablemente más asequible que las plataformas de secuenciación de próxima generación. Digno de mención, es no sólo la comparación de costos a las plataformas genéticas, pero más específicamente relacionados con el campo de la AIS, es decir los costos asociados a las imágenes radiológicas. Hoy en día, más de un millón de niños en los EE.UU. y alrededor de 100 mil niños en Canadá son diagnosticados con escoliosis idiopática, y el costo total de diagnóstico y seguimiento de los niños con escoliosis por exposición a los rayos X es de más de 2,5 mil millones de dólares anuales en América del Norte. Por lo tanto, se esperaría que nuestro procedimiento de ensayo basado en células para ser adecuado para la detección y seguimiento de los niños con escoliosis idiopática sin riesgo para la salud y a un menor coste de rutina.

Escoliosis idiopática es una deformación en la columna de causa desconocida que generalmente se define como una curvatura lateral mayor de 10 grados acompañados por una rotación vertebral 1. La condición afecta a un 4% de la población pediátrica y se diagnostica con mayor frecuencia entre las edades de 9 a 13 años 2,3,4. El diagnóstico es fundamentalmente de la exclusión y se hace sólo después de descartar otras causas de la deformidad de la columna, como la malformación vertebral, neuromusculares o trastornos sindrómicos. Tradicionalmente, la asimetría trunkal es revelada por Adams prueba de flexión hacia delante y se mide con scoliometer durante el examen físico 5. El diagnóstico puede ser confirmado por la observación radiográfica de la curva y la medición del ángulo utilizando el método de Cobb 6. Una vez diagnosticada, la principal preocupación para los médicos en el manejo de los niños con escoliosis es si la curva va a progresar. De hecho, la progresión de la curva es a menudo impredecible yes observada entre las niñas con más frecuencia que en los niños 7. Si no se trata, la curva puede progresar de manera espectacular, creando una deformidad física significativa e incluso problemas cardiopulmonares. Estas manifestaciones se convierten en peligro la vida cuando la curva es superior a 70 ° 8,9. Las opciones actuales de tratamiento para prevenir o detener la progresión de la curva se incluyen refuerzos y cirugía. En general, se recomienda refuerzo de curvas entre 25-40 °, mientras que la cirugía se reserva para las curvas de más de 45 ° o que no responden al uso de órtesis. Aproximadamente, el 10% de los niños diagnosticados con escoliosis idiopática tienen progresión de la curva que requiere cirugía correctiva 10. En la actualidad, no existe un método probado o prueba disponible para identificar este tipo de pacientes. En consecuencia, todos los niños diagnosticados son sometidos a múltiples radiografías durante varios años, por lo general hasta que alcanzan la madurez esquelética. Se estima que los pacientes típicos con escoliosis tendránaproximadamente 22 exámenes radiológicos más de un período de 3 años 11. Debido al riesgo potencial de múltiples exámenes radiográficos, los enfoques alternativos que podrían permitir realizar el pronóstico de la escoliosis idiopática, sin exponer a los niños a la radiación ionizante son muy deseables. Con la intención de satisfacer esta necesidad, hemos desarrollado previamente un ensayo de cribado basados ​​en la célula como una prueba de pronóstico para identificar cuanto antes los niños asintomáticos con riesgo de desarrollar escoliosis idiopática. La prueba permite predecir el resultado clínico, tanto en niños asintomáticos y afectadas por el análisis del estado funcional de las proteínas Gi y clasificar a los niños en tres grupos funcionales (FG1, FG2 y FG3) de acuerdo con el grado de la respuesta máxima a la estimulación de proteínas Gi 12 tal como se mide por CDS sistema basado en. Este sistema se utiliza en gran medida para evaluar la transducción de señales a través de proteínas G en diversos tipos de células 13,14,15,16. Se da información sobre larespuesta total integrada de las células a los estímulos externos mediante la medición de cambios en la impedancia después de la activación de los receptores de la superficie celular. Las células se sembraron en microplacas que contienen electrodos en la parte inferior de los pocillos y el sistema aplica un pequeño voltaje que inducen corrientes extracelulares y transcelular. Después de la inyección del compuesto en el pozo, receptores de la superficie celular son estimulados y se producen los eventos de transducción de señal, dando lugar a cambios celulares que afectan el flujo de las corrientes extracelulares y transcelular, y por lo tanto afectan a la magnitud medida. Con este enfoque, los pacientes y los niños con escoliosis más en riesgo de desarrollar escoliosis son menos sensibles a la proteína Gi estimulación en comparación con los controles sanos, y la clasificación se basa en el porcentaje de grado de reducción en relación con el grupo control. Los rangos de clasificación se fijan entre 10 y 40% para FG3, 40 y 60% para FG2, y 60 y 90% para FG1 12. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Más recientemente, se ha modificado este enfoque mediante la demostración de que los tres grupos funcionales se distinguen claramente de acuerdo al perfil de un desequilibrio entre la respuesta a Gi y Gs estimulación. De hecho, encontramos que la respuesta a la estimulación Gi predominó en FG3, mientras que no se observó desequilibrio aparente en FG2. Por el contrario, FG1 exhibió predominio de la respuesta a la estimulación Gs. Además, hemos proporcionado la evidencia de que los pacientes pertenecientes a FG2 están en mayor riesgo de progresar hasta el punto de necesitar la cirugía 17. La precisión de esta prueba de clasificación Además, se ha mejorado mediante la demostración de un efecto diferencial de la osteopontina (OPN) en respuesta a la estimulación Gi entre los grupos funcionales. Aquí documentamos los pasos detallados de los procedimientos experimentales y analíticas de la prueba de funcionamiento en la actualidad se realiza en nuestro laboratorio.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>350-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Therno Scientific Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin</td>
			<td>Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Osteopontin</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc</td>
			<td>1433-OP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-06-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>24-MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey small sample 96W microplate</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1026496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey tips</td>
			<td>Cybio</td>
			<td>OL3800-25-559N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut pierceable seals</td>
			<td>Excel Scientific, Inc</td>
			<td>XP-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicell XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>1284</td>
			<td>Class II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY5093570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89032-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51019557</td>
			<td>5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1019185</td>
			<td>CDS-based instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy

Este protocolo se detalla el procedimiento experimental y de análisis para un ensayo basado en células desarrollado en nuestro laboratorio como una prueba funcional para predecir el pronóstico de la escoliosis idiopática en niños asintomáticos y afectadas. El ensayo consiste en la evaluación del estado funcional de las proteínas Gi y GS en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) por espectroscopía dieléctrica celular (CDS), utilizando un instrumento automatizado basado CDS-, y la clasificación de los niños en tres grupos funcionales (FG1 , GD2, GD3) con respecto al perfil de desequilibrio entre el grado de respuesta a Gi y Gs proteínas estimulación. La clasificación se ve confirmado por el efecto diferencial de la osteopontina (OPN) en respuesta a la estimulación Gi entre los grupos y la severa progresión de la enfermedad es referenciado por FG2. Aproximadamente, se requiere un volumen de 10 ml de sangre para extraer las PBMC por gradiente de Ficoll-y las células entonces se almacenan en nitrógeno líquido. El número adecuado de PBMC para realizar el ensayo se obtiene después de dos días de cultivo celular. Esencialmente, las células se incubaron primero con phytohemmaglutinin (PHA). Después de 24 h de incubación, el medio se sustituye por un medio de cultivo con PHA libre para un 24 h adicionales antes de la siembra de células y el tratamiento de OPN. Después las células se espectroscópicamente examinados para sus respuestas a la somatostatina y el isoproterenol, que activan respectivamente las proteínas Gi y GS a través de sus receptores afines. Tanto la somatostatina y el isoproterenol se inyectan simultáneamente con un sistema integrado de fluidos y las respuestas de las células son monitoreados durante 15 min. El ensayo se puede realizar con PBMC frescas o congeladas y el procedimiento se completa dentro de 4 días.

La viabilidad celular fue comparable entre todas las muestras con valores consistentes en el rango de 86 y 96%. En contraste, se observaron grandes variaciones en el número de células entre las muestras (Tabla 3). De las 32 muestras utilizadas, dos tenían insuficiencia del número de células y no se han clasificado. Un ejemplo de los resultados de la clasificación funcional de acuerdo con el grado de desequilibrio entre Gi y de señalización Gs se mostró en la Figura 3. El eje vertical de esta cifra se divide en tres secciones que delimitan los grupos funcionales con rangos dinámicos establecidos como&gt; 10 para FG3, entre 10 y -10 para FG2, y finalmente &lt;-10 para FG1. Entre 30 pacientes analizados aquí, 14, 6, y 5 pacientes fueron claramente clasifican en GD3, GD2, y FG1, respectivamente, mientras que cinco pacientes, en particular 345, 353, 370, 371, y 382, ​​estaban en el límite de rangos. La evaluación del efecto de OPN en respuesta a la estimulación Gi había puesto de manifiesto que la OPN aumentó la respuesta en PAtes 353 y 371. En contraste, la respuesta se redujo en más de 50% en los pacientes 345 y 382 y por menos de 50% en paciente 370 después del tratamiento rOPN. Así, de acuerdo con nuestros criterios de clasificación (Tabla 2), hemos sido capaces de categorizar a los pacientes 353 y 371 en FG1, los pacientes 345 y 382 en FG2, y el paciente 370 en FG3. Paralelamente, todos los pacientes fueron seleccionados por su respuesta a la proteína Gi estimulación y comparados con los sujetos control. Como era de esperar, todos los pacientes fueron menos sensibles que los sujetos de control, y los pacientes clasificados en el mismo grupo funcional por nuestro nuevo procedimiento mostraron niveles similares de la respuesta máxima (Figura 5). Por otra parte, la disparidad entre los pacientes de cada grupo funcional fue consistente con nuestra gama clásica de clasificación 12, validando nuestro nuevo procedimiento. La clasificación de una gran cohorte de pacientes con escoliosis seguidos regularmente en nuestra clínica especial en Sainte-Justine Hospital ha puesto de manifiesto que los tresgrupos funcionales se distribuyeron de manera similar entre los casos moderados, mientras que el FG2 era predominante entre los casos severos (Figura 6), la identificación de pacientes clasificados en este grupo funcional como un mayor riesgo de progresión grave de la enfermedad y lo que indica que esta prueba de clasificación puede ser útil en el el pronóstico de la escoliosis idiopática. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5"> Solución A </td><td> Anhidro D-glucosa </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> CaCl2 2H 2 O </td><td> 0,05 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0,98 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5,4 mM </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 145 mM </td></tr><tr><td> Solución B </td><td> NaCl </td><td> 140 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Solución salina equilibrada (BSS) </td><td> Solución A </td><td> 1 volumen </td></tr><tr><td> Solución B </td><td> 9 volumen </td></tr><tr><tdrowspan = &quot;3&quot;&gt; multimedia completo </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td rowspan="3"> Medios complementarios </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Medios de congelación </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Medios PHA </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Fitohemaglutinina </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Esencialsoluciones. <table border="1"><tbody><tr><td> Rangos dinámicos con Delta G </td><td> Grupos Funcionales </td><td> Rangos dinámicos con Fe </td></tr><tr><td> Delta G &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> Fe&gt; 100% </td></tr><tr><td> -10 &lt;Delta G &lt;10 </td><td> FG2 </td><td> Fe &lt;50% </td></tr><tr><td> Delta G&gt; 10 </td><td> FG3 </td><td> 50% &lt;Fe &lt;95% </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Categorización de los grupos funcionales de acuerdo con rangos dinámicos establecidos con Delta G y Fe. <table border="1"><tbody><tr><td> Pacientes </td><td> Viabilidad (%) </td><td> La concentración celular (× 10 6 / ml) </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88.7 </td><td> 11.64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90.5</td><td> 13.6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94.4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94.3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94.2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94.6 </td><td> 8.52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91.2 </td><td> 0.82 </td><td> Número insuficiente de células </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90.3 </td><td> 8.92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92.6 </td><td> 8.28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91.3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86.9 </td><td> 7.62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91.2 </td><td> 7.51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90.3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95.1 </td><td> 16.94 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92.3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89.4 </td><td> 7.67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93.5 </td><td> 7.84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86.5 </td><td> 2.2 </td><td> Número insuficiente de células </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92.6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93.4 </td><td> 10.9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92.5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88.8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93.9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92.9 </td><td> 15.67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93.1 </td><td> 9.99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93.6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ Td&gt; <td> 92.6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91.1 </td><td> 8.46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93.9 </td><td> 14.82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92.1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92.9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89.1 </td><td> 7.73 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 3. El porcentaje de viabilidad y la concentración de células como se determina usando un contador de células automatizado y analizador de viabilidad. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> Figura 1. Diseño para la siembra de células. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> Figura 2.Diseño para dispensar compuestos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> Figura 3. Rango dinámico de la clasificación funcional utilizando el sistema CDS-. Gráfico ilustra los valores del grado de desequilibrio entre las respuestas a Gi y Gs estimulación obtenida en PBMCs de pacientes con escoliosis idiopática. Los valores se midieron por el sistema basado en CDS-en respuesta a 10 mM de somatostatina e isoproterenol. Cada punto representa el Delta G de ambas respuestas en duplicado. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> Figura 4. Efecto de rOPN en respuesta a la estimulación Gi en PBMCs. Las células se privaron de suero durante 18 horas en presencia o ausencia de 0,5 g / ml rOPN y después se estimularon con 10<html> 56; M de la somatostatina para iniciar la respuesta celular mediada por Gi. Los datos en el gráfico se generaron a partir de impedancia mínima y máxima corresponden a la media de la respuesta por duplicado. <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> Figura 5. El estado funcional de las proteínas Gi en PBMCs de control y los sujetos scoliostic. PBMCs de sujetos de control y pacientes con escoliosis fueron expuestas a concentraciones crecientes de somatostatina para estimular las proteínas Gi a través de receptores de somatostatina endógena. La respuesta celular se midió por el sistema basado en CDS-como se describe en la sección de procedimiento. Se generaron curvas de impedancia máxima-mínima. Cada curva representa la regresión no lineal. Los datos se normalizaron a la respuesta máxima en células procedentes de sujetos de control y cada punto corresponde a la media de la respuesta por duplicado./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande la figura. <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> Figura 6. Distribución de los grupos funcionales entre las diferentes fases de la escoliosis. Un gran cohorte de pacientes con escoliosis con 794 curvaturas moderadas (entre 10-44 °) y 162 casos graves (curvatura mayor de 45 º), seguido regularmente en Hospital Sainte-Justine, fueron clasificados de acuerdo a su grado de desequilibrio entre la respuesta a Gi y Gs estimulación. Las respuestas se midieron por el sistema basado en CDS-en respuesta a 10 mM de somatostatina e isoproterenol.

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Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Un protocolo estructurado se presenta para un ensayo basado en células como una prueba funcional para predecir el pronóstico de la escoliosis idiopática usando espectroscopía dieléctrica celular (CDS). El ensayo puede realizarse con células mononucleares de sangre periférica frescas o congeladas (PBMCs) y el procedimiento se completa dentro de 4 días.

Protocolo de ensayo basado en células para la predicción pronóstica de la escoliosis idiopática del Uso de Celular Espectroscopía Dieléctrica

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

cell-based-assay-protocol-for-prognostic-prediction-idiopathic

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K vistas.  Sainte-Justine University Hospital Research Center.  Un protocolo estructurado se presenta para un ensayo basado en células como una prueba funcional para predecir el pronóstico de la escoliosis idiopática usando espectroscopía dieléctrica celular (CDS). El ensayo puede realizarse con células mononucleares de sangre periférica frescas o congeladas (PBMCs) y el procedimiento se completa dentro de 4 días. 

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An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative short-term and long-term effects on the mother. Prior to women undergoing surgery, can we predict who is at risk for developing significant postoperative pain and potentially prevent or minimize its negative consequences? These are the fundamental questions that a team from the University of Washington, Stanford University, the Catholic University in Brussels, Belgium, Santa Joana Women's Hospital in S&atilde;o Paulo, Brazil, and Rambam Medical Center in Israel is currently evaluating in an international research collaboration. The ultimate goal of this project is to provide optimal pain relief during and after cesarean section by offering individualized anesthetic care to women who appear to be more 'susceptible' to pain after surgery.
A significant number of women experience moderate or severe acute post-partum pain after vaginal and cesarean deliveries. 1 Furthermore, 10-15% of women suffer chronic persistent pain after cesarean section. 2 With constant increase in cesarean rates in the US 3 and the already high rate in Brazil, this is bound to create a significant public health problem. When questioning women's fears and expectations from cesarean section, pain during and after it is their greatest concern. 4 Individual variability in severity of pain after vaginal or operative delivery is influenced by multiple factors including sensitivity to pain, psychological factors, age, and genetics. The unique birth experience leads to unpredictable requirements for analgesics, from 'none at all' to 'very high' doses of pain medication. Pain after cesarean section is an excellent model to study post-operative pain because it is performed on otherwise young and healthy women. Therefore, it is recommended to attenuate the pain during the acute phase because this may lead to chronic pain disorders. The impact of developing persistent pain is immense, since it may impair not only the ability of women to care for their child in the immediate postpartum period, but also their own well being for a long period of time.
In a series of projects, an international research network is currently investigating the effect of pregnancy on pain modulation and ways to predict who will suffer acute severe pain and potentially chronic pain, by using simple pain tests and questionnaires in combination with genetic analysis. A relatively recent approach to investigate pain modulation is via the psychophysical measure of Diffuse Noxious Inhibitory Control (DNIC). This pain-modulating process is the neurophysiological basis for the well-known phenomenon of 'pain inhibits pain' from remote areas of the body. The DNIC paradigm has evolved recently into a clinical tool and simple test and has been shown to be a predictor of post-operative pain.5 Since pregnancy is associated with decreased pain sensitivity and/or enhanced processes of pain modulation, using tests that investigate pain modulation should provide a better understanding of the pathways involved with pregnancy-induced analgesia and may help predict pain outcomes during labor and delivery. For those women delivering by cesarean section, a DNIC test performed prior to surgery along with psychosocial questionnaires and genetic tests should enable one to identify women prone to suffer severe post-cesarean pain and persistent pain. These clinical tests should allow anesthesiologists to offer not only personalized medicine to women with the promise to improve well-being and satisfaction, but also a reduction in the overall cost of perioperative and long term care due to pain and suffering. On a larger scale, these tests that explore pain modulation may become bedside screening tests to predict the development of pain disorders following surgery.

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain PPOP

Diffuse noxious inhibitory control, temporal summation and wound hyperalgesia testing are demonstrated in the obstetric patient. These tests evaluate inhibitory and excitatory mechanisms of pain processing and are here utilized to evaluate endogenous analgesia at different time-points during pregnancy and the peripartum period to help reveal individual s risk for persistent pain.

Un paradigma experimental para la predicción del dolor post-operatorio (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative ...

Investigación

Medicina

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Un método para el aislamiento de los islotes murinos y Trasplante Renal subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Enfoque Formación: Un análisis basado en células para determinar el potencial oncogénico de un gen

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and negatively impact patient quality of life and long term survival. Advances in the understanding of the biological pathways associated with normal tissue toxicities have allowed for the development of interventional drugs, however, current response studies are limited by a lack of quantitative metrics for assessing the severity of skin reactions. Here we present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe the instrumentation design of the DOS system as well as the inversion algorithm for extracting the optical parameters. Finally, to demonstrate clinical utility, we present representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema and compare the results with a commonly employed visual scoring. The described DOS method offers an objective, high through-put evaluation of skin toxicity via functional response that is translatable to the clinical setting.

We present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe DOS instrumentation design, optical parameters extraction algorithms and the animal handling procedures required to yield representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema.

Espectroscopia óptica difusa para la evaluación cuantitativa de la radiación ionizante aguda La toxicidad cutánea inducida utilizando un modelo de ratón

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently inhibit viral replication, they have no direct effect on the expression of viral proteins transcribed from a viral covalently closed circular DNA (cccDNA). As high viral antigen load may play a role in this chronic and HBV-related carcinogenesis, the goal of HBV treatment is to eradicate viral proteins. HBV regulatory protein X (HBx) binds to the host DNA damage-binding protein 1 (DDB1) protein to degrade structural maintenance of chromosomes 5/6 (Smc5/6), resulting in activation of viral transcription from cccDNA. Here, using a split luciferase complementation assay system, we present a comprehensive compound screening system to identify inhibitors of the HBx-DDB1 interaction. Our protocol enables easy detection of interaction dynamics in real time within living cells. This technique may become a key assay to discover novel therapeutic agents for treatment of HBV infection.

Here, we present a method for screening anti-hepatitis B viral agents that inhibit the HBx-DDB1 interaction using a split luciferase assay system. This system allows easy detection of protein-protein interactions and is suitable for identifying inhibitors of such interactions.

Identificación de inhibidores de la interacción HBx-DDB1 mediante un sistema de ensayo de Luciferase dividido

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Quantification of Optic Nerve Cross Sectional Area on MRI: A Novel Protocol using Fiji Software

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic nerve cross-sectional assessment and quantification using 3 T MRI for image acquisition and ImageJ's Fiji software for image processing quantification. Image acquisition was performed using 3 T MRI, with proper instructions for the patient to ensure straight fixation during imaging. A T2-weighted fat suppressed sequence was used. A coronal cut taken 3 mm behind the globe and perpendicular to the optic nerve axis should be uploaded to the software. Using the threshold function, the white matter area of the optic nerve is selected and quantified, thus, eliminating inter-individual measurement bias. We also described the normal limits for the optic nerve cross-sectional area according to age, based on previously published literature. We used the described protocol to assess optic nerve of a suspected glaucoma patient. The optic nerve cross-sectional area was found to be within the normal limits, a finding further confirmed via optical coherence tomography of the optic nerve.

We provided a detailed protocol for a standardized method of optic nerve assessment and quantification using MRI, utilizing a widely available imaging sequence, and open access software for image analysis. Following this standardized protocol would provide meaningful data for comparison between different patients and different studies.

Cuantificación del área de la sección transversal del nervio óptico en la resonancia magnética: un protocolo novedoso utilizando el software de Fiji

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic ...

A Real-World High-Intensity Interval Training Protocol for Cardiorespiratory Fitness Improvement

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, few studies have tested the efficiency of HIIT protocols in a &#34;real world&#34; setting, e.g., HIIT protocols designed for outdoor spaces without specialized equipment. This study presents a &#34;real world&#34; training protocol, named &#34;beep training&#34;, and compares the efficiency of a HIIT regiment versus a traditional long-duration Moderate-Intensity Continuous Training (MICT) regiment using this beep training protocol on VO2 max of overweight untrained men. Twenty-two subjects performed outdoor running with MICT (n = 11) or HIIT (n = 11). Cardiorespiratory fitness was assessed before and after training protocols using a metabolic analyzer. Both training protocols were performed 3 days a week for 8 weeks using the Beep Test results. The MICT group performed the exercise program at 60%-75% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax) and with a progression of the distance of 3,500-5,000 m. The HIIT group performed the interval exercise with 7-10 bouts of 200 m at 85%-100% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax), interspersed with 1 min of passive recovery. Although the HIIT group presented a significantly lower training volume than the MICT group (p &#60; 0.05) after 8 weeks of beep training, HIIT was superior to MICT in improving VO2 max (MICT: ~4.1%; HIIT: ~7.3%; p &#60; 0.05). The &#34;real world&#34; HIIT regiment based on beep training protocol is a time-efficient, low-cost, and easy-to-implement protocol for overweight untrained men.

This study presents a low-cost and easy-to-implement "real world" high-intensity interval training (HIIT) protocol for scientific research and discusses its efficiency for cardiorespiratory fitness.

Un protocolo de entrenamiento en intervalos de alta intensidad en el mundo real para la mejora de la aptitud cardiorrespiratoria

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, ...

Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug against hyperlipidemia in Traditional Chinese Medicine (TCM) and Indian Medicine theories, however the potential mechanism requires further exploration. The present research aims to reveal the mechanism of FP against hyperlipidemia based on an integrated strategy combining network pharmacology prediction with metabolomics validation. A high-fat diet (HFD)-induced mice model was established by evaluating the plasma lipid levels, including total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C). Network pharmacology was applied to find out the active ingredients of FP and potential targets against hyperlipidemia. Metabolomics of plasma and liver were performed to identify differential metabolites and their corresponding pathways among the normal group, model group, and intervention group. The relationship between network pharmacology and metabolomics was further constructed to obtain a comprehensive view of the process of FP against hyperlipidemia. The obtained key target proteins were verified by molecular docking. These results reflected that FP improved the plasma lipid levels and liver injury of hyperlipidemia induced by a HFD. Gallic acid, quercetin, and beta-sitosterol in FP were demonstrated as the key active compounds. A total of 16 and six potential differential metabolites in plasma and liver, respectively, were found to be involved in the therapeutic effects of FP against hyperlipidemia by metabolomics. Further, integration analysis indicated that the intervention effects were associated with CYP1A1, AChE, and MGAM, as well as the adjustment of L-kynurenine, corticosterone, acetylcholine, and raffinose, mainly involving tryptophan metabolism pathway. Molecular docking ensured that the above ingredients acting on hyperlipidemia-related protein targets played a key role in lowering lipids. In summary, this research provided a new possibility for preventing and treating hyperlipidemia.

The present protocol describes an integrated strategy for exploring the key targets and mechanisms of Fructus Phyllanthi against hyperlipidemia based on network pharmacology prediction and metabolomics verification.

Predicción de farmacología en red y validación metabolómica del mecanismo de Fructus phyllanthi contra la hiperlipidemia

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug ...

Descubrimiento de biomarcadores no invasivos para la proteómica lagrimal mediante LC-MS

A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for several ocular diseases and conditions. The suspension trapping column has been reported to be an efficient and user-friendly sample preparation workflow for the broad application of downstream proteomic analysis. Yet, this strategy has not been well-studied in the analysis of human tear proteome. The present protocol describes an integrated workflow from clinical human tear samples to purified peptides for non-invasive tear protein biomarker research using mass spectrometry, which provides insights into disease biomarkers and monitoring when combined with bioinformatics analysis. A protein suspension trapping sample preparation was applied and demonstrated the discovery of tear proteome with fast, reproducible, and user-friendly procedures, as a universal, optimized sample preparation for human tear fluid analysis. In particular, the suspension trapping procedure outperformed in-solution sample preparation in terms of peptide recovery, protein identification, and shorter sample preparation time.

Autor destacado: Avance del análisis del líquido lagrimal mediante un protocolo estandarizado para la investigación proteómica 

This protocol describes a method for collecting tear samples using Schirmer strips and an integrated quantitative workflow for discovering non-invasive tear protein biomarkers. The suspension trapping sample preparation workflow enables fast and robust tear sample preparation and mass spectrometric analysis, resulting in higher peptide recovery yields and protein identification than standard in-solution procedures.

Preparación de muestras con captura de suspensión de proteínas para proteómica lagrimal mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for ...