Este protocolo proporciona una plataforma de cultivo celular donde las propiedades de la matriz extracelular como la rigidez, la composición de proteínas y la morfología celular se pueden controlar con precisión de una manera rentable y fácil. El método es rentable y no requiere capacitación o instalaciones especiales. También es compatible con múltiples métodos de cuantificación celular como la tinción inmunofluorescente y la mancha occidental.
Esta técnica proporciona una comprensión mecanicista de la biología celular Schwann. Con información adicional sobre el diseño de biomateriales para la regeneración del sistema nervioso, se puede aplicar a cualquier célula dependiente del anclaje. La parte más difícil de este protocolo, es la impresión de microcontactos.
Antes de comenzar el protocolo, la impresión de microcontacto en el sustrato utilizando un florescente para etiquetar la proteína para verificar visualmente la impresión final al patrón. Comience mezclando vigorosamente el elastómero base PDMS y los agentes de curado con una punta de pipeta hasta que las burbujas se dispersen homogéneamente dentro de la mezcla. A continuación, retire las burbujas con desicación al vacío.
Coloque una gota de la mezcla desiccida de PDMS en un cubreobjetos cuadrado o circular, y gire el cubreobjetos en una recubridora de centrifugado a 2.500 rpm durante 30 segundos. Incubar el cubreobjetos en un horno a 60 grados centígrados, durante una o dos horas, o a temperatura ambiente durante la noche. Para preparar un sustrato micro patrónado, coloque una oblea de silicio con patrón dentro de un plato Petri circular de 150 milímetros de diámetro por 15 milímetros de altura y vierta PDMS desgastado en la oblea.
Solidificó el PDMS en un horno a 60 grados centígrados durante la noche. Deje que el PDMS se enfríe a temperatura ambiente. A continuación, utilice un bisturí quirúrgico para cortar sellos de 30 por 30 milímetros cuadrados que contienen los patrones correctos teniendo cuidado de no dañar la oblea de silicio.
Esterilice los sellos PDMS y los resbalones de cubierta sintonizables sumergiéndolos en 70% etanol durante 30 minutos. Para confirmar la eficacia del micropatrón, seque la superficie de los sellos PDMS utilizando una corriente de aire filtrada y pipeta de 15 microgramos por mililitro de solución BSA para cubrir todo el lado estampado del sello. Incubar los sellos con la solución BSA durante una hora a temperatura ambiente para permitir la adsorción de proteínas, luego secar al aire los sellos para eliminar la solución de BSA.
Utilice la corriente de aire filtrada para secar la superficie de los resbalones de cubierta sintonizables. Ponga el lado estampado del sello en contacto conformado con el cubreobjetos sintonizable para permitir la adsorción BSA en la superficie del cubreobjetos, y presione suavemente el sello contra el cubreobjetos durante cinco minutos. Examine el micropatrón con un microscopio de fluorescencia con un filtro FITC.
Para imprimir áreas adhesivas celulares en lugar de patrones fluorescentes sustituya la laminin por proteína BSA. Retire los sellos de los resbalones de la cubierta y transfiera los resbalones de la cubierta a una placa esterilizada de seis pozos. Añadir dos mililitros de 0.2%Pluronic F-127 solución en cada pozo para cubrir la superficie del resbalón de la cubierta e incubar la placa durante una hora a temperatura ambiente.
Aspirar la solución F-127 y lavar los resbalones de la cubierta cinco veces con PBS, una vez con el medio de cultivo celular, luego sembrar las células Schwann a una densidad de siembra de 1000 células por centímetro cuadrado. 45 minutos después de la siembra celular, retire el medio de cultivo celular y lave los resbalones de la cubierta dos veces con PBS para evitar que varias células se adhieran al mismo patrón. Mantenga las celdas en el entorno de cultivo celular deseado durante 48 horas antes de la cuantificación.
Para crear sustratos de cultivo celular con patrón de línea para examinar celdas alineadas, haga los sellos de acuerdo con las direcciones del manuscrito y córtalos a las dimensiones deseadas. Prepare dos platos Petri recubiertos con una superficie PDMS sintonizable como se describió anteriormente, y realice la impresión de microcontactos para imprimir áreas adhesivas de celda con patrón de línea en uno de los platos. Después de retirar los sellos, llene el plato Petri con cuatro mililitros de 0.2%Pluronic F-127 solución y incubarlo durante una hora.
Enjuague cada lado del sello PDMS tres veces con 70% de etanol y séquelo con aire. Gire los sellos PDMS e imprima el área adhesiva de celda sin colocar en la segunda placa Petri como se describió anteriormente. Después de incubar los platos con la solución F-127, retirar la solución y lavar los platos tres veces con PBS y una vez con medio de cultivo celular fresco.
Luego sembrar las células en los platos, y mantenerlos en las condiciones deseadas durante 48 horas antes de preparar los licatos. Para preparar los linces, lave las células con PBS frío durante dos minutos, luego agregue 80 microlitros de solución RIPA, preparados de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, en cada área adhesiva celular, e incubar las células en un bloque de hielo durante 25 minutos. Raspa las células Schwann con el rascador celular durante cinco minutos y recoge el lisado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros etiquetado.
Centrifugar el lysate durante 15 minutos a 12 miles de veces G y cuatro grados centígrados. Recoger el sobrenadante y transferirlo a un tubo de microcentrífuga limpia. Los sustratos recubiertos de Laminina resultaron en una mayor tasa de proliferación en comparación con sustratos recubiertos de colágeno y fibronectina.
Las células Schwann en sustratos con recubrimiento de laminin y diferentes módulos mostraron que sustratos relativamente más blandos disminuyeron las tasas de proliferación celular. Las células también fueron analizadas para la expresión de proteínas. La expresión del factor c-Jun de transcripción se reguló a medida que los sustratos se volvían más blandos.
Sin embargo, fue significativamente regulado hacia abajo en los sustratos más blandos. En sustratos rígidos, los sustratos recubiertos de colágeno resultaron en la expresión c-Jun más alta, ya que los sustratos se volvieron más blandos, laminin mostró los niveles más altos de c-Jun. Las células fueron teñidas con rhodamine-phalloidin para explorar el papel de la diseminación celular y el área en la expresión c-Jun.
Cuando se crearon líneas adhesivas celulares en los sustratos de cultivo celular, la relación de aspecto nuclear de las células sembradas en el sustrato del patrón aumentó en comparación con la de las células en sustratos sin patrón. La expresión del receptor de neurotrofina c-Jun y p75 se reguló al alza en células densas con un área de propagación más pequeña. Las células con patrón de línea también dieron lugar a una expresión más alta de C-Jun y p75 NTR en comparación con las células no nutridas.
Las geometrías adhesivas celulares impresas de microcontacto se crearon para controlar con precisión el área de propagación celular y el alargamiento, al tiempo que se eliminan las interacciones de celda a célula. El aumento de la relación de aspecto celular hizo que el alargamiento nuclear aumentara. La expresión de c-Jun fue regulada tanto por el alargamiento celular como por la inhibición de la propagación celular.
La tinción de inmunofluorescencia tanto para los núcleos como para la actina confirmó que el área de propagación celular y el alargamiento se controlaron con precisión a través de este método de micropatrnado. Esta técnica allanó una manera de utilizar nuestros sustratos sintonizables como método para analizar mecánicamente la biología celular Schwann y la señalización en el contexto de la regeneración y el cáncer.
