Algunos de los datos que se muestran aquí se obtuvieron en el laboratorio de la Dra. Jacqueline N. Crawley en el Instituto Nacional de Salud Mental de EE.UU. y nos gustaría darle las gracias por lo que nos permite mostrar los datos en el papel. También agradecemos a Kazuo Nakanishi por su ayuda en el desarrollo de programas para el análisis del comportamiento ImageFZ. Esta investigación fue apoyada por la subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (B) (21.300.121), subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica en áreas innovadoras (Red Integral de la Ciencia del Cerebro) del Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes y Cultura de Japón , subvención de Neuroinformática Japan Center (NIJC), y subvenciones de CREST de Japón Organismo de Ciencia y Tecnología (JST).

<ol>
	<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> What's wrong with my mouse: behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , (2007).</li><li>Fanselow, M. S., Poulos, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroscience+of+mammalian+associative+learning.">The neuroscience of mammalian associative learning.</a> Annu. Rev. Psychol. 56, 207-234 (2005).</li><li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotion+circuits+in+the+brain.">Emotion circuits in the brain.</a> Annu. Rev. 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Confirmamos que no hay conflictos de interés conocidos asociados con esta publicación y no ha habido un importante apoyo financiero para este trabajo que podría haber influido en el resultado.

La prueba de acondicionamiento miedo contextual y complementada es uno de los paradigmas más utilizados para evaluar el aprendizaje y la memoria. Esta prueba es una forma de condicionamiento pavloviano en el que se hace una asociación entre un contexto y / o un estímulo condicionado (señal auditiva) y un estímulo aversivo (estímulo eléctrico plantar eléctrica). Después de incluso una sola pareja formada por el contexto / señal auditiva y descarga en las patas, los ratones muestran una congelación de larga duración cuando se enfrentan ya sea con el contexto o el taco. En esta prueba, el comportamiento de congelación se utiliza como un índice de la memoria del miedo. Los estudios farmacológicos y de lesión han puesto de manifiesto que la formación de la memoria, la consolidación, y la recuperación están regulados por varias regiones del cerebro, tales como la amígdala, el hipocampo, la corteza prefrontal y 3,33-35. Además, los estudios de genética molecular han demostrado el papel de los genes y moléculas que participan en el aprendizaje y la memoria en estas regiones del cerebro utilizando ratones modificados genéticamente 36 específicos. Por lo tanto, esta prueba es simplcorreo y útil para explorar la base neurobiológica subyacente aprendizaje miedo y la memoria. En este artículo de la película, presentamos nuestro protocolo para proporcionar experimentadores con información detallada de entender y fácil de realizar la prueba. Comportamiento de congelación se cuantificó a través de la observación directa de los experimentadores humanos. Se espera que un experimentador bien entrenado para producir resultados fiables y estables a través de observaciones. Sin embargo, este método implica problemas potenciales, tales como las diferencias en el método de observación, sesgos del observador, y los errores de cuantificación simples, lo que dificulta la comparación directa de los resultados de los experimentadores independientes y diferentes laboratorios. Un sistema de medición de equipo basado en Photobeam automatizado también se ha utilizado 26,30-32. Sin embargo, este sistema también presenta problemas potenciales en la medición de las conductas de congelación. Debido a la disposición de sensor, este sistema podría ser incapaz de detectar pequeños movimientos de la cabeza que Typically marcarán como &quot;activa&quot; a través de la observación humana. Además, temblores durante la congelación podría ser considerado como nonfreezing porque cuando se congela un animal, interrupciones intermitentes en la Photobeam se observan como consecuencia de temblor. Como método alternativo, la imagen-y el vídeo-análisis de los sistemas automatizados se han desarrollado 17-20,37,38. Anagnostaras et al. 37 describieron unos sistemas con programas de software de análisis de imágenes que tienen una buena validez y la puntuación de la congelación, así 17,20,37-38. Sin embargo, la mayoría de estos sistemas y programas de análisis tienen que ser obtenidos de proveedores comerciales y son típicamente costosos. Hemos desarrollado el programa de software ImageFZ para el análisis del comportamiento de la congelación, y este programa se distribuye como un programa de software libre. ImageFZ detecta el ratón como un cuerpo de píxeles (una partícula) y discrimina sutil movimiento del ratón como &quot;congelamiento&quot; o &quot;no-congelación&quot; en función de la cantidad deárea de regiones que no se superponen entre las partículas de cada par de imágenes consecutivas. Como se muestra en los resultados representativos, las mediciones utilizando el programa de ImageFZ son consistentes con o más precisa que la obtenida usando otros métodos. Así, el programa ImageFZ mide automáticamente el comportamiento que los observadores humanos juzgan como la congelación utilizando criterios definidos. Además, el programa ImageFZ calcula la distancia recorrida (cm) antes, durante, y después de la exposición descarga en las patas, lo que facilita una evaluación de la sensibilidad de choque y análisis del comportamiento de congelación. Existen diferencias metodológicas entre los laboratorios. Estas diferencias pueden resultar en dificultades en la comparación de los datos entre los laboratorios y en la reproducción de los resultados de diferentes laboratorios. Para obtener datos más estables y comparables, es necesario estandarizar el protocolo de prueba tanto como sea posible. El sistema de análisis con ImageFZ conduce a la automatización de los procedimientos de ensayo, que puede contribuir ala estandarización de protocolos utilizado a través de los laboratorios. Varias respuestas de comportamiento deben ser considerados al analizar el comportamiento de la congelación. En primer lugar, cuando los animales se enfrentan a una situación de miedo, pueden huir en lugar de congelar 39. Huir es una de las respuestas de miedo, y su incidencia va llevar a subestimar la memoria del miedo. En segundo lugar, la congelación puede depender de un nivel de actividad general, y el nivel de actividad en los ratones experimentales y de control necesita ser examinado. Por ejemplo, aunque los ratones que carecen del receptor de acetilcolina muscarínico M1 mostraron niveles reducidos de congelación en comparación con los ratones de tipo salvaje, diversas pruebas de comportamiento indican que los resultados se pueden atribuir a su fenotipo hiperactividad en lugar de su deterioro de la memoria 18. ImageFZ calcula la distancia (cm) recorrida por los sujetos. Están disponibles para examinar si existen diferencias en los niveles de actividad en general entre los sujetos de los datos. Si hay una diferencia de grupo enla distancia recorrida, un posible enfoque para el problema es considerar la distancia recorrida durante la primera 2 min de la formación como la actividad de línea de base y utilizar una relación de supresión (relación de supresión = (actividad durante el ensayo) / (actividad durante la línea base + la actividad durante testing)) como un índice secundario de miedo 17,40. Por último, una diferencia en la sensibilidad al dolor, la inducción de los cambios en la reactividad a una descarga en las patas eléctrica, en su caso, puede resultar en variaciones en el comportamiento de congelación. ImageFZ también calcula la distancia recorrida (cm) en detalle desde 2 segundos antes de una exposición de una descarga en las patas 2 segundos a 2 segundos después de su exposición (durante 6 s), que se puede utilizar como un índice de sensibilidad descarga en las patas. Sistemas de vídeo-análisis de se han desarrollado para medir el comportamiento de congelación del albino, negro, agouti, y diluir los ratones marrones. ImageFZ utiliza una bandeja de suelo negro y negro rejillas para examinar ratones blancos (véase la Figura 1B). Las rejillas negros están hechos de especificación<html> aliado procesado metales con recubrimiento de pintura negro y tienen una conductividad eléctrica similar a la de las rejillas de metal no recubiertos, que se utilizan típicamente para ratones negros. ImageFZ también analiza el comportamiento de congelación en ratas y otros roedores a través de ajustes de los parámetros del programa. En la versión actual de ImageFZ, el comportamiento del sujeto se registra utilizando una cámara de vídeo desde la pared superior para analizar la congelación. ImageFZ también podría ser utilizado en una configuración donde se capturan las imágenes desde el lado de la cámara. Además, la ImageFZ controla un máximo de 4 aparatos. Esta característica permite al investigador para examinar simultáneamente 4 ratones, ahorrando tiempo y reduciendo las posibles influencias de las diferencias en el tiempo de ejecución de cada sujeto y el fin de las pruebas sobre el comportamiento. Por lo tanto, ImageFZ simplifica el procedimiento de prueba y análisis del comportamiento de congelación, y este programa facilita la prueba con menos mano de obra y sin ningún tipo de formación para los experimentos conductuales. e_content &quot;&gt; En el laboratorio Miyakawa, hemos evaluado más de 110 cepas de ratones genéticamente modificados y el control de ratones de tipo salvaje en la prueba de acondicionamiento miedo contextual y con claves utilizando el sistema de análisis de video para dilucidar los efectos de un determinado gen en el aprendizaje y la memoria 41-42 Hemos obtenido un gran conjunto de datos en bruto para más de 5.000 ratones Los datos en bruto que se utilizó para los artículos de investigación publicados 4-16 se incluyen en el &quot;Ratón Fenotipo Database &#39;como una base de datos pública (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). El presente artículo película proporciona información detallada acerca de los detalles de nuestro procedimiento experimental y promueve la comprensión de la situación de prueba.

La prueba de acondicionamiento miedo contextual y con claves es el paradigma conductual se utiliza para evaluar el miedo asociativo aprendizaje y la memoria en roedores 1-3. Esta prueba ha sido ampliamente utilizada para comprender los mecanismos neurobiológicos del aprendizaje y la memoria en el miedo transgénicos y knock-out ratones 1,4-16. Comportamiento de congelación, que se define como la inmovilidad completa, con la excepción de la respiración, es una respuesta común a situaciones de miedo. En este paradigma de comportamiento, después los animales son expuestos a un emparejamiento de una señal auditiva con una descarga en las patas eléctrica, que responden al estímulo produce miedo por mostrar un comportamiento de congelación, que se mide como un índice de aprendizaje asociativo miedo y la memoria. Esta prueba requiere equipo menos elaborado, menos esfuerzo físico por parte del investigador, y mucho menos tiempo de entrenamiento para los ratones que otras tareas de aprendizaje y memoria, sino que por lo general requiere aproximadamente 5-10 min / día por ratón durante 2 días. Aunque el procedimiento de la prueba es simple y requiere poco tiempo para llevar a cabo, el investigador debe observar cuidadosamente y medir el comportamiento del ratón, por lo que varios sistemas de medición automáticos se han desarrollado para llevar a cabo el análisis del comportamiento 17-20. Nuestro sistema de vídeo-análisis, que hemos desarrollado con el programa de software ImageFZ, nos permite analizar fácilmente el comportamiento de congelación y producir resultados de alta fiabilidad. En este artículo se proporciona información detallada sobre los procedimientos de pruebas y se describe cómo utilizar el programa de software ImageFZ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;ImageFZ&#160; program</td>
			<td>Developed by Tsuyoshi Miyakawa</td>
			<td></td>
			<td>&#160;This program is available through O&#39;Hara &#38; Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditioning chamber</td>
			<td>O&#39;Hara &#38; co., Japan</td>
			<td>CL-3002L</td>
			<td>For mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cued test chamber</td>
			<td>O&#39;Hara &#38; co., Japan</td>
			<td>CLT-3002L</td>
			<td>For mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface</td>
			<td>O&#39;Hara &#38; co., Japan</td>
			<td>CL-1040</td>
			<td>The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled shock generator</td>
			<td>O&#39;Hara &#38; co., Japan</td>
			<td>SGA-2040</td>
			<td>The shock generator can be controlled by ImageFZ program.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock grid tester (ammeter)</td>
			<td>O&#39;Hara &#38; co., Japan</td>
			<td>SG-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB video capture device</td>
			<td>XLR8</td>
			<td>USB2IVOSX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad image splitter</td>
			<td>Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan</td>
			<td>400AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soundproof room</td>
			<td>O&#39;Hara &#38; co., Japan</td>
			<td>CL-4210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Monitor</td>
			<td>San Diego Instruments, Inc., CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>16 x 16 photbeam array&#160; ( 2.5 cm spacing)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contextual and cued fear conditioning test using a video analyzing system in mice

La prueba de acondicionamiento miedo contextual y con claves es una de las pruebas de comportamiento que evalúa la capacidad de los ratones para aprender y recordar una asociación entre las señales ambientales y experiencias aversivas. En esta prueba, los ratones se colocan en una cámara de acondicionamiento y se dan recortes de un estímulo condicionado (una señal auditiva) y un estímulo no condicionado aversivo (una descarga en las patas eléctrica). Después de un tiempo de retardo, los ratones son expuestos a la misma cámara de acondicionamiento y una cámara en forma diferente con la presentación de la señal auditiva. Congelación comportamiento durante la prueba se mide como un índice de la memoria del miedo. Para analizar el comportamiento de forma automática, se ha desarrollado un sistema de análisis de vídeo utilizando el programa de software de aplicación ImageFZ, que está disponible como descarga gratuita en http://www.mouse-phenotype.org/. En este caso, para mostrar los detalles de nuestro protocolo, demostramos nuestro procedimiento para el contexto y con claves de prueba acondicionado miedo en ratones C57BL/6J usando el sist ImageFZem. Además, hemos validado nuestro protocolo y el rendimiento del sistema de análisis de vídeo mediante la comparación de tiempo de congelación medida por el sistema ImageFZ o un sistema de medición de equipo basado en Photobeam con que anotado por un observador humano. Como se muestra en nuestros resultados representativos, los datos obtenidos por ImageFZ fueron similares a los analizados por un observador humano, lo que indica que el análisis de comportamiento utilizando el sistema de ImageFZ es altamente fiable. El presente artículo película proporciona información detallada sobre los procedimientos de prueba y promover la comprensión de la situación experimental.

En la prueba de condicionamiento del miedo, los experimentadores humanos utilizan para cuantificar el comportamiento de congelación a través de la observación directa de trabajo intensivo 26-29, pero los sistemas de medición de la computadora recientemente Photobeam-basado (por ejemplo, el sistema de &#39;Freeze monitor&#39;) y la imagen-de análisis se han utilizado para automáticamente medir el comportamiento de congelación 26,30-32. ImageFZ es un sistema de imagen-el análisis automatizado, que produce resultados comparables a los obtenidos a través de la observación humana, como se describe a continuación. En este caso, se compararon los resultados de la observación humana con los de análisis ImageFZ bajo diferentes parámetros: &#39;Tarifa (cuadros / s) &quot;y&quot; Freezing criterio (píxeles).&#39; En este experimento, cinco ratones C57BL/6J macho (peso corporal medio ± SD (g), 31,4 ± 3,55, con una media ± SD tamaño del cuerpo (píxeles), 351,6 ± 62,2) fueron utilizados en 15-27 semanas de edad. La observación humana se realizó utilizando un programa de eventos de grabación (un programa de software Macintosh OS9), un evento clave de prensado que continúand durante 2 segundos o más cuando un ratón aparece un brote de ningún movimiento fue considerado &quot;congelación&quot;. El porcentaje de congelación se calcula cada 60 segundos en cada prueba y se utiliza para los análisis de correlación. El porcentaje de congelación anotado por los 2 observadores (fiabilidad entre observadores, para el acondicionamiento, r = 0,879; prueba de contexto, r = 0,957; para la prueba con claves, r = 0.866, para todos los casos, r = 0.888) fue en promedio de generar un ser humano anotar. Se examinaron las correlaciones entre los porcentajes de congelación medidos a través de ImageFZ con cada velocidad de cuadro (es decir, 1, 2, y 4 fps) y los obtenidos a través de observaciones humanos. Como se ilustra en la Figura 4, los porcentajes calculados de congelación a través de ImageFZ (1, 2, y 4 fps) fueron altamente correlacionados con el valor promedio obtenido de las mediciones de los 2 observadores. En particular, la captura de imágenes a una velocidad más alta no siempre produce la mejor correlación. Análisis de imágenes a 1 fps generado resultados similares a los obtenidos a partir de los observadores humanos en eprueba ach. Se examinaron las correlaciones entre los porcentajes de congelación medidos a través de las observaciones humanas y utilizando ImageFZ en cada condición de los &quot;criterio de congelación (píxeles)&quot; (es decir, 20, 30 y 40 píxeles). Los porcentajes de congelación calculados utilizando ImageFZ en el &#39;criterio de congelación (píxeles) &quot;de 20, 30 y 40 píxeles fueron, en todos los casos, altamente correlacionados con los obtenidos a través de las observaciones humanas (Figura 5). Como se muestra en la Figura 5D, cuando el criterio de congelación se establece en un valor bajo, el sutil movimiento de un ratón, que se considera ser &quot;congelamiento&quot; por los observadores humanos, sería considerado &quot;no congelar &#39;usando ImageFZ. Por el contrario, si el criterio se establece en un valor alto, el movimiento de un ratón, calificó como &quot;no-congelación&quot; por los observadores humanos, se consideraría «congelación» utilizando ImageFZ (Figuras 5C, 5F y 5I). Por lo tanto, para obtener los resultados más fiables, cada parámetro del programa ImageFZ debe ser calibrado nosotrosción de los datos obtenidos a través de observaciones humanos en cada entorno de prueba. Además, se compararon los resultados generados por un observador humano, usando un sistema basado en ordenador de haz de luz de medición (el sistema de congelación del monitor), a los obtenidos utilizando ImageFZ (véase la Figura 6). El observador humano fue cegado al grupo de tratamiento y los resultados de la puntuación ImageFZ. Para los ajustes de los parámetros del sistema de congelación del monitor, se utilizó 3 medidas del porcentaje de congelación de un sistema previamente validado 30. En pocas palabras, el número de intervalos de 10 segundos en los que los animales requiere más de 1 o 2 segundos para cruzar la primera viga de nuevo el intervalo de (10 seg 1 seg y 10 seg 2 seg, respectivamente) y la latencia entre el comienzo de cada intervalo de 5 seg y Se midió la tercera nueva interrupción del haz dentro de este intervalo (Latency3). Los porcentajes de los intervalos en los que el ratón estaba helada o el porcentaje de la cantidad total de tiempo rEQUIRED para romper se calcularon la tercera Photobeam. Los porcentajes de congelación medidos en cada sistema se ilustran en la Figura 6. Los grupos se compararon mediante dos vías de medidas repetidas ANOVA seguido de pruebas t (véase la Tabla 1). Los porcentajes de congelación medidos usando ImageFZ (Figura 6B) fueron más similares a los obtuvo a través de la observación humana (Figura 6A) de los datos obtenidos usando un sistema basado en Photobeam (figuras 6C-E). Los porcentajes de congelación medidos utilizando el programa ImageFZ en cada prueba fueron altamente correlacionados con los marcados a través de la observación humana (acondicionamiento, r = 0,947; prueba de contexto, r = 0,970; cued prueba, r = 0,934), mientras que las correlaciones entre los porcentajes de congelación mide utilizando el sistema de medición de equipo basado en Photobeam (10seg 1seg, 10 seg 2 seg o Latency3) y el observador humano fueron menores (acondicionamiento, r = 0.503, 0.593 y 0.761; contexto test, r = 0,772, 0,819, y 0,912) en comparación con las correlaciones entre los porcentajes de congelación medidos usando ImageFZ y la observación humana (Figuras 7A y 7B). Además, la Figura 7 revela que las diferencias entre los porcentajes obtenidos de congelación a través de la observación humana y utilizando ImageFZ en cada ratón fueron las diferencias más pequeñas. Estos resultados indicaron que los porcentajes de congelación medidos usando ImageFZ fueron similares a los obtenidos a través de la observación humana y que ImageFZ es altamente preciso en la medición de la cantidad de congelación. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig1.jpg" /> Figura 1. Aparatos para el contexto y con claves de prueba condicionamiento del miedo. (A) Una cámara cuadrada de acrílico para la prueba de acondicionamiento y el contexto, ( <strong&gt; B) rejillas de metal sobre un suelo de plástico blanco para ratones marrón negro, agutí o diluir (arriba) y las rejillas de metal negro electrificables en un piso de plástico negro para ratones blancos (abajo), las imágenes ampliadas de las redes se muestran en la derecha Panel, (C) un generador de ruido blanco / tono y un generador de shock, (D) una sala insonorizada, y (E) una cámara triangular de acrílico con un piso plano para la prueba con claves. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig2.jpg" /> Figura 2. Representación esquemática del protocolo. (A) Descripción general del contexto y cued prueba acondicionado miedo, (B) acondicionamiento, (C) cONTEXTO prueba, y (D) con claves de prueba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig3.jpg" /> Figura 3. Análisis de la imagen por el programa de software ImageFZ. Para cada par de imágenes sucesivas, la cantidad de área (píxeles) a través del cual el ratón se movía se calcula por ImageFZ. Cuando esta zona se encuentra por debajo de un cierto umbral (por ejemplo, 30 píxeles), el comportamiento es juzgado para ser «congelación». Cuando la cantidad de área igual o superior al umbral, el comportamiento es considerado como &quot;no-congelación&quot;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Las comparaciones de los porcentajes de congelación calculados a partir de las imágenes a diferentes velocidades de cuadro utilizando ImageFZ con los medidos a través de la observación humana. Las pruebas de condicionamiento de miedo se llevaron a cabo utilizando ratones macho C57BL/6J (n = 5). Durante las pruebas, dos observadores anotaron el comportamiento de la congelación. Al mismo tiempo, se capturaron las imágenes en directo a 4 fps utilizando el programa ImageFZ. Los archivos capturados a 4 fps se recortan después de extraer los fotogramas que corresponden a las imágenes captadas a 1 fps o 2 fps. Los valores de los parámetros de la &quot;Tarifa (cuadros / s)&quot; se establece en 1, 2 o 4 fps, y los porcentajes de congelación en cada 60 seg bin se calcularon a partir de archivos de imagen usando ImageFZ análisis fuera de línea. Cada punto representa un porcentaje de congelación de cada bandeja de 60 seg. Se calcularon coeficientes de correlación de Pearson entre los datos obtenidos a partir de la observación humana y el análisis ImageFZ.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Los porcentajes de congelación calculados a partir de las imágenes en diferentes valores criterio de congelación utilizando ImageFZ y los medidos a través de observaciones humanos se compararon. Las pruebas de condicionamiento de miedo se llevaron a cabo utilizando ratones macho C57BL/6J (n = 5). Durante las pruebas, dos observadores registraron el comportamiento de congelación, y las imágenes en directo fueron capturados utilizando el programa ImageFZ. Los porcentajes de congelación en cada 60 seg bin se calcularon a partir de las imágenes (1 cuadro / s) a través ImageFZ análisis fuera de línea, el establecimiento de los valores de los parámetros de &quot;criterio de congelación (píxeles) &#39;a 20, 30, o 40 píxeles. Cada punto representa un porcentaje de congelación de cada bandeja de 60 seg. Coeficiente de correlación de Pearsoncoeficientes entre los datos obtenidos de la observación humana y el análisis ImageFZ se calcularon en cada prueba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig6.jpg" /> Figura 6. Los porcentajes de congelación se midieron utilizando sistemas automatizados y la observación humana en grupos no acondicionados y acondicionado de los ratones macho C57BL/6J (n = 5, cada grupo). (A) la observación humana, (B) ImageFZ, (C) Congelar sistema de monitor 1 (10seg 1seg), (D) Congelar sistema Monitor 2 (10 seg 2 seg), y (E) Congelar sistema Monitor 3 (Latency3). Grupo comparaciones se realizaron utilizando dos vías de medidas repetidas ANOVA seguido de pruebas t (uncovs acondicionado grupo nditioned grupo, *, P &lt;0,05; †, p &lt;0,01). Los datos obtenidos utilizando ImageFZ fueron similares a los marcados a través de la observación humana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig6highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="La figura 7" fo:content-width="4.3in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig7highres.jpg" width="420" /> Figura 7. Se muestran la correlación y la distribución de frecuencia de las diferencias entre los porcentajes de congelación, medidos utilizando sistemas automatizados y la observación humana. (AB) Gráficos de dispersión y coeficientes de correlación de Pearson entre porcentajes de congelación obtenidos a través de sistemas automatizados y la observación humana. Los porcentajes de congelación, calculadas utilizando ImageFZ, están altamente correlacionados con los obtenidos a través de la observación humana. (CF) Ocurrencias de menos de un 10% DIFrencia entre los porcentajes de congelación obtenidos de los sistemas automatizados vs observación humana fueron mayores cuando los datos analizados utilizando ImageFZ se compararon con los analizados a través de la observación humana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig7highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> ANOVAs </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Condición </td><td> Tiempo </td><td> Condición x Tiempo </td></tr><tr><td> Día 1 (acondicionamiento) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Humano </td><td> F (1,8) = 28,53, p = 0,0007 </td><td> F (7,56) = 20.79, p &lt;0.0001 </td><td> F (7,56) = 16,58, p &lt;0,0001 </td></tr><tr><td> ImageFZ </td><td> F (1,8) = 13,97, p = 0,0057 </td><td> F (7,56) = 21.40, p &lt;0.0001 </td><td> F (7,56) = 11.69, p &lt;0.0001 </td></tr><tr><td> Freeze Monitor (1sec10sec) </td><td> F (1,8) = 5,16, p = 0,0528 </td><td> F (7,56) = 2.39, p = 0.0329 </td><td> F (7,56) = 0,72, p = 0,6572 </td></tr><tr><td> Freeze Monitor (2sec10sec) </td><td> F (1,8) = 4,07, p = 0,0782 </td><td> F (7,56) = 3,44, p = 0,0039 </td><td> F (7,56) = 1.52, p = 0.1803 </td></tr><tr><td> Freeze Monitor (Latency3) </td><td> F (1,8) = 4,44, p = 0,0682 </td><td> F (7,56) = 9,94, p &lt;0,0001 </td><td> F (7,56) = 4,33, p = 0,0007 </td></tr><tr><td> Día 2 (contexto) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Humano </td><td> F (1,8) = 42,94, p = 0,0002 </td><td> F (4,32) = 1.91, p = 0.1336 </td><td> F (4,32) = 1.48, p = 0.2302 </td></tr><tr><td> ImageFZ </td><td> F (1,8) = 49,61, p = 0,0001 </td><td> F (4,32) = 2,06, p = 0,1087 </td><td> F (4,32) = 0,83, p = 0,5174 </td></tr><tr><td> Freeze Monitor (1sec10sec) </td><td> F (1,8) = 20,28, p = 0,002 </td><td> F (4,32) = 1,63, p = 0,1918 </td><td> F (4,32) = 0,55, p = 0,6997 </td></tr><tr><td> Freeze Monitor (2sec10sec) </td><td>F (1,8) = 40,20, p = 0,0002 </td><td> F (4,32) = 2,66, p = 0,0504 </td><td> F (4,32) = 1,20, p = 0,3306 </td></tr><tr><td> Freeze Monitor (Latency3) </td><td> F (1,8) = 35,30, p = 0,0003 </td><td> F (4,32) = 2,49, p = 0,0626 </td><td> F (4,32) = 1,09, p = 0,3793 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Las comparaciones de las estadísticas.

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Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

En este artículo se presenta un protocolo para un temor prueba contextual y complementada acondicionado mediante un sistema de análisis de vídeo para evaluar el aprendizaje del miedo y la memoria en ratones.

Contextuales y complementada el condicionamiento del miedo de prueba utilizando un sistema de análisis de vídeo en ratones

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

contextual-cued-fear-conditioning-test-using-video-analyzing-system

Research

JoVE Journal

Behavior

50.9K vistas.  Fujita Health University.  En este artículo se presenta un protocolo para un temor prueba contextual y complementada acondicionado mediante un sistema de análisis de vídeo para evaluar el aprendizaje del miedo y la memoria en ratones. 

Video: Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

Trace Fear Conditioning in Mice

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings between a neutral stimulus and an unconditioned stimulus. There is a 20 sec trace period that separates each conditioning trial. On the following day freezing is measured during presentation of the conditioned stimulus (CS) and trace period. On the third day there is an 8 min test to measure contextual memory. The representative results are from mice that were presented with the aversive unconditioned stimulus (shock) compared to mice that received the tone presentations without the unconditioned stimulus. Trace fear conditioning has been successfully used to detect subtle learning and memory deficits and enhancements in mice that are not found with other fear conditioning methods. This type of fear conditioning is believed to be dependent upon connections between the medial prefrontal cortex and the hippocampus. One current controversy is whether this method is believed to be amygdala-independent. Therefore, other fear conditioning testing is needed to examine amygdala-dependent learning and memory effects, such as through the delay fear conditioning.

In the following experiment we describe a protocol for trace fear conditioning in mice. This type of associative memory includes a trace period that separates the neutral stimulus and the unconditioned stimulus.

Traza el condicionamiento del miedo en ratones

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings ...

Investigación

Comportamiento

Using the Threat Probability Task to Assess Anxiety and Fear During Uncertain and Certain Threat

Fear of certain threat and anxiety about uncertain threat are distinct emotions with unique behavioral, cognitive-attentional, and neuroanatomical components. Both anxiety and fear can be studied in the laboratory by measuring the potentiation of the startle reflex. The startle reflex is a defensive reflex that is potentiated when an organism is threatened and the need for defense is high. The startle reflex is assessed via electromyography (EMG) in the orbicularis oculi muscle elicited by brief, intense, bursts of acoustic white noise (i.e., &#8220;startle probes&#8221;). Startle potentiation is calculated as the increase in startle response magnitude during presentation of sets of visual threat cues that signal delivery of mild electric shock relative to sets of matched cues that signal the absence of shock (no-threat cues). In the Threat Probability Task, fear is measured via startle potentiation to high probability (100% cue-contingent shock; certain) threat cues whereas anxiety is measured via startle potentiation to low probability (20% cue-contingent shock; uncertain) threat cues. Measurement of startle potentiation during the Threat Probability Task provides an objective and easily implemented alternative to assessment of negative affect via self-report or other methods (e.g., neuroimaging) that may be inappropriate or impractical for some researchers. Startle potentiation has been studied rigorously in both animals (e.g., rodents, non-human primates) and humans which facilitates animal-to-human translational research. Startle potentiation during certain and uncertain threat provides an objective measure of negative affective and distinct emotional states (fear, anxiety) to use in research on psychopathology, substance use/abuse and broadly in affective science. As such, it has been used extensively by clinical scientists interested in psychopathology etiology and by affective scientists interested in individual differences in emotion.

Potentiation of the startle reflex is measured via electromyography of the orbicularis oculi muscle during low (uncertain) and high (certain) probability electric shock threat in the Threat Probability Task. This provides an objective measure of distinct negative emotional states (fear/anxiety) for research on psychopathology, substance use/abuse, and broad affective science.

Usando el Grupo de probabilidad de amenaza para evaluar la ansiedad y el miedo durante una amenaza incierta y Certain

Fear of certain threat and anxiety about uncertain threat are distinct emotions with unique behavioral, cognitive-attentional, and neuroanatomical ...

Quantifying Social Motivation in Mice Using Operant Conditioning

In this protocol, social motivation is measured in mice through a pair of operant conditioning paradigms. To conduct the experiments, two-chambered shuttle boxes were equipped with two operant levers (left and right) and a food receptacle in one chamber, which was then divided from the second chamber by an automated guillotine door covered by a wire grid. Different stimulus mice, rotated across testing days, served as a social stimulus behind the wire grid, and were only visible following the opening of the guillotine door. Test mice were trained to lever press in order to open the door and gain access to the stimulus partner for 15 sec. The number of lever presses required to obtain the social reward progressively increased on a fixed schedule of 3. Testing sessions ended after test mice stopped lever pressing for 5 consecutive minutes. The last reinforced ratio or breakpoint can be used as a quantitative measure of social motivation. For the second paradigm, test mice were trained to discriminate between left and right lever presses in order to obtain either a food reward or the social reward. Mice were rewarded for every 3 presses of each respective lever. The number of food and social rewards can be compared as a measurement of the value placed upon each reward. The ratio of each reward type can also be compared between mouse strains and the change in this ratio can be monitored within testing sessions to measure satiation with a given reward type. Both of these operant conditioning paradigms are highly useful for the quantification of social motivation in mouse models of autism and other disorders of social behavior.

This article describes a new protocol for the quantitative measurement of social motivation in mice using operant conditioning for a social reward. The protocol is useful for the measurement of social motivation in mouse models of autism and other disorders of social behavior.

La cuantificación de la motivación social en ratones utilizando Condicionamiento operante

In this protocol, social motivation is measured in mice through a pair of operant conditioning paradigms. To conduct the experiments, two-chambered ...

Determining Ultrasonic Vocalization Preferences in Mice using a Two-choice Playback Test

Mice emit ultrasonic vocalizations (USVs) during a variety of conditions, such as pup isolation and adult social interactions. These USVs differ with age, sex, condition, and genetic background of the emitting animal. Although many studies have characterized these differences, whether receiver mice can discriminate among objectively different USVs and show preferences for particular sound traits remains to be elucidated. To determine whether mice can discriminate between different characteristics of USVs, a playback experiment was developed recently, in which preference responses of mice to two different USVs could be evaluated in the form of a place preference.
First, USVs from mice were recorded. Then, the recorded USVs were edited, trimmed accordingly, and exported as stereophonic sound files. Next, the USV amplitudes generated by the two ultrasound emitters used in the experiment were adjusted to the same sound pressure level. Nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitters were used to play the USVs back. Finally, to investigate the preference of subject mice to selected USVs, pairs of two differing USV signals were played back simultaneously in a two-choice test box. By repeatedly entering a defined zone near an ultrasound emitter and searching the wire mesh in front of the emitter, the mouse reveals its preference for one sound over another. This model allows comparing the attractiveness of the various features of mouse USVs, in various contexts.

Ultrasonic vocalizations (USVs) in mice differ depending on age, sex, condition, and genetic background. Using two ultrasound emitters broadcasting simultaneously in different locations, this two-choice test can evaluate murine recognition and preference responses to different characteristics of USVs.

La determinación de Preferencias ultrasónico Vocalización en ratones utilizando una prueba de reproducción de dos elección

Mice emit ultrasonic vocalizations (USVs) during a variety of conditions, such as pup isolation and adult social interactions. These USVs differ with age, ...

Whisker-signaled Eyeblink Classical Conditioning in Head-fixed Mice

Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive repertoire of scientific techniques available to study learning and memory at the cellular level, it is ideal to have a stable cranial platform. Because mice do not readily tolerate restraint, they are usually trained while moving about freely in a chamber. Conditioned stimulus (CS) and unconditioned stimulus (US) information are delivered and eyeblink responses recorded via a tether connected to the mouse's head. In the head-fixed apparatus presented here, mice are allowed to run as they desire while their heads are secured to facilitate experimentation. Reliable conditioning of the eyeblink response is obtained with this training apparatus, which allows for the delivery of whisker stimulation as the CS, a periorbital electrical shock as the US, and analysis of electromyographic (EMG) activity from the eyelid to detect blink responses.

The preparation presented here for whisker-signaled eyeblink conditioning in head-fixed mice precisely stimulates specific whiskers while allowing mice to ambulate on a cylindrical treadmill. A whisker stimulation conditioned stimulus (CS) paired with a periorbital shock unconditioned stimulus (US) results in reliable associative learning on this apparatus.

Eyeblink Condicionamiento clásico bigote-señalado en la cabeza de ratones fijo

Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive ...

Reducing State Anxiety Using Working Memory Maintenance

The purpose of this protocol is to explain how to examine the relationship between working memory processes and anxiety by combining the Sternberg Working Memory (WM) and the threat of shock paradigms. In the Sternberg WM paradigm, subjects are required to maintain a series of letters in the WM for a brief interval and respond by identifying whether the position of a given letter in the series matches a numerical prompt. In the threat of shock paradigm, subjects are exposed to alternating blocks where they are either at risk of receiving unpredictable presentations of a mild electric shock or are safe from the shock. Anxiety is probed throughout the safe and threat blocks using the acoustic startle reflex, which is potentiated under threat (Anxiety-Potentiated Startle (APS)). By conducting the Sternberg WM paradigm during the threat of shock and probing the startle response during either the WM maintenance interval or the intertrial interval, it is possible to determine the effect of WM maintenance on APS.

This protocol demonstrates how to measure anxiety-potentiated startle during the Sternberg Working Memory paradigm.

Reducción de la ansiedad estatal mediante el mantenimiento de la memoria de trabajo

The purpose of this protocol is to explain how to examine the relationship between working memory processes and anxiety by combining the Sternberg Working ...

Using Electroencephalography Measurements and High-quality Video Recording for Analyzing Visual Perception of Media Content

This article explores a method to detect differences in visual perception in humans. The method used is based on the psychological (or "cognitive") function of eyeblinks. Participants' eyeblinks are detected and acquired while watching videos specifically created for the investigation. The detection and acquisition of eyeblinks are carried out with the help of a 20-channel electroencephalographic (EEG) wireless device. The international 10-20 system for electrode placement is followed. A high-definition (HD) video camera is used to record participants' facial expressions, for contrast purposes. Instead of using pre-existing media content, purpose-made video content has been created following specific criteria of interest for this investigation, with stimuli enabling researchers to manage the precise parameters of interest. Otherwise, results could be contaminated with uncontrolled variables. The synchronization of the presentation of video stimuli with EEG recordings needs to be done in milliseconds. Analysis of collected data is performed with robust software for working with big matrices. Statistically significant differences in eyeblink rate related to media professionalization and editing style are found with the reported experimental procedures.

We present detection, acquisition, and analysis of eyeblink rates while watching media content.

Utilizando mediciones de electroencefalograma (EEG) y grabación de vídeo de alta calidad para el análisis de la percepción Visual del contenido de los medios de comunicación

This article explores a method to detect differences in visual perception in humans. The method used is based on the psychological (or "cognitive") ...

Analyzing Spatial Learning and Prosocial Behavior in Mice Using the Barnes Maze and Damsel-in-Distress Paradigms

The Barnes maze is a reliable measure of spatial learning and memory that does not require food restriction or exposure to extremely stressful stimuli. The Barnes maze can also assess other mouse behaviors, such as general motivation to escape from the maze platform and exploratory behavior. The Barnes maze can measure whether a genetic mutation or environmental variable can impact the acquisition and retention of spatial memories, as well as provide information about the search strategy employed by the mice. Here we use the Barnes maze to detect a memory deficit in adult mice following a single developmental ethanol exposure event. The newly described Damsel-in-Distress paradigm exposes a male mouse to a female mouse trapped in a chamber in the open center field of the arena. It provides an opportunity for the mouse to socially respond to the trapped female and exhibit prosocial behavior. The Damsel-in-Distress paradigm can also be used to examine mouse behavior in a novel arena and measure locomotor activity. Both the Barnes Maze and the Damsel-in-Distress protocols require minimal financial investment and most aspects of the tests can be constructed from common lab supplies. These flexible and accessible tools can also be used to detect behavioral changes over the course of development.

This protocol measures spatial learning and memory using the Barnes maze. A novel Damsel-in-Distress paradigm is used to assess locomotor activity and prosocial behavior in mice.

Analizar el aprendizaje espacial y el comportamiento Prosocial en los ratones con el laberinto de Barnes y paradigmas de la damisela en peligro

The Barnes maze is a reliable measure of spatial learning and memory that does not require food restriction or exposure to extremely stressful stimuli. ...

Visual Classical Conditioning in Wood Ants

Several species of insects have become model systems for studying learning and memory formation. Although many studies focus on freely moving animals, studies implementing classical conditioning paradigms with harnessed insects have been important for investigating the exact cues that individuals learn and the neural mechanisms underlying learning and memory formation. Here we present a protocol for evoking visual associative learning in wood ants through classical conditioning. In this paradigm, ants are harnessed and presented with a visual cue (a blue cardboard), the conditional stimulus (CS), paired with an appetitive sugar reward, the unconditional stimulus (US). Ants perform a Maxilla-Labium Extension Reflex (MaLER), the unconditional response (UR), which can be used as a readout for learning. Training consists of 10 trials, separated by a 5-minute intertrial interval (ITI). Ants are also tested for memory retention 10 minutes or 1 hour after training. This protocol has the potential to allow researchers to analyze, in a precise and controlled manner, the details of visual memory formation and the neural basis of learning and memory formation in wood ants.

We present a protocol for the classical conditioning of harnessed ants that permits researchers to study visual learning and memory formation at a level of analysis not possible with freely moving individuals.

Visual condicionamiento clásico en madera hormigas

Several species of insects have become model systems for studying learning and memory formation. Although many studies focus on freely moving animals, ...

Fear Incubation Using an Extended Fear-Conditioning Protocol for Rats

Emotional memory has been primarily studied with fear-conditioning paradigms. Fear conditioning is a form of learning through which individuals learn the relationships between aversive events and otherwise neutral stimuli. The most-widely utilized procedures for studying emotional memories entail fear conditioning in rats. In these tasks, the unconditioned stimulus (US) is a footshock presented once or several times across single or several sessions, and the conditioned response (CR) is freezing. In a version of these procedures, called cued fear conditioning, a tone (conditioned stimulus, CS) is paired with footshocks (US) during the training phase. During the first test, animals are exposed to the same context in which training took place, and freezing responses are tested in the absence of footshocks and tones (i.e., a context test). During the second test, freezing is measured when the context is changed (e.g., by manipulating the smell and walls of the experimental chamber) and the tone is presented in the absence of footshocks (i.e., a cue test). Most cued fear conditioning procedures entail few tone-shock pairings (e.g., 1-3 trials in a single session). There is a growing interest in less common versions involving an extensive number of pairings (i.e., overtraining) related to the long-lasting effect called fear incubation (i.e., fear responses increase over time without further exposure to aversive events or conditioned stimuli). Extended fear-conditioning tasks have been key to the understanding of fear incubation&#8217;s behavioral and neurobiological aspects, including its relationship with other psychological phenomena (e.g., post-traumatic stress disorder). Here, we describe an extended fear-conditioning protocol that produces overtraining and fear incubation in rats. This protocol entails a single training session with 25 tone-shock pairings (i.e., overtraining) and a comparison of conditioned freezing responses during context and cue tests 48 h (short-term) and 6 weeks (long-term) after training.

We describe an extended fear-conditioning protocol that produces overtraining and fear incubation in rats. This protocol entails a single training session with 25 tone-shock pairings (i.e., overtraining) and a comparison of conditioned freezing responses during context and cue tests 48 h (short-term) and 6 weeks (long-term) after training.

La incubación del miedo utilizando un protocolo de acondicionamiento del miedo extendido para ratas

Emotional memory has been primarily studied with fear-conditioning paradigms. Fear conditioning is a form of learning through which individuals learn the ...