Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia (MCB 1.021.831, JM) y J. &amp; E. Programa de Investigación Biomédica (Departamento de Salud de Florida, JM).

1. Preparación de muestra <ol><li> Llevar a cabo la preparación de la muestra y todas las manipulaciones de la muestra en un cuarto oscuro para prevenir un uncaging no deseado. </li><li> Solubilizar DM-nitrofen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimetoxifenil) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis [(oxi-carbonilo) metil] -1,2-etanodiamina) en HEPES 50 mM tampón, mM de KCl, pH 7,0 a una concentración final de 400 mM 100 (ε 350 nm = 4330 M -1 cm -1 9). </li><li> Añadir CaCl2 de la solución madre 0,1 M para conseguir una proporción deseable de [Ca 2 +]: [DM-nitrofen]. Para las proteínas con Kd para el Ca 2 + asociación mayores de 10 micras, la proporción de [Ca2 +]: [DM-nitrofen] de 1:01 es preferible evitar la unión de foto-lanzado Ca 2 + para uncaged DM-nitrofen . En efecto, teniendo en cuenta el valor de Kd para DM-nitrofen ser 10 nM y la concentración total de DM-nitrofen y Ca 2 + para ser 400 mM, ~ 90% de una proteína fijadora de calciocon K d = 10 M estarán en el apoform. Por otro lado, para el estudio de Ca 2 + unión a proteínas con Kd &lt;10 M, es preferible disminuir la [Ca2 +]: relación de [DM-nitrofen] a 0,95 para prevenir Ca 2 + complejación con el apo- proteína antes de la jaula fotodisociación. </li><li> Solubilizar el compuesto de referencia, K 3 [Fe (III) (CN) 6] o Na 2 CrO 4, en el mismo tampón que para la muestra. </li></ol> 2. Configuración del Experimento <ol><li> La configuración experimental básico se muestra en la Figura 2. </li><li> Utilice un agujero de pasador (P 2) para ajustar el diámetro del haz de sonda (632 nm de salida de láser de He-Ne, ~ 5 mW de potencia de láser) a 1 mm y propagar el haz de sonda a través del centro de una célula se coloca en una temperatura controlado soporte de la celda utilizando un M 1 espejo. </li><li> Use un espejo (M 2) detrás de la muestra para centrar el haz de sondaen un centro de detector sensible a la posición. </li><li> Enfocar el haz de sonda en el centro del detector de tal manera que la diferencia en el voltaje entre los dos primeros diodos y dos diodos parte inferior, así como la diferencia en el voltaje entre los dos diodos en el lado izquierdo y derecho del detector es cero. </li><li> Posteriormente, la forma de un diámetro del haz de la bomba, una salida de 355 nm de Q-switched Nd: YAG, FWHM 5 nseg) usando un agujero de alfiler 3 mm (P 1) colocado entre dos espejos del láser 355 nm. </li><li> Copropagate el haz de bomba a través del centro de la cubeta como se demuestra en la Figura 2. Es importante que los dos rayos láser se propagan a través del centro de la célula óptica en forma casi colineal para obtener un ángulo de desviación medible y por lo tanto de alta amplitud de la señal PBD. En condiciones experimentales, el ángulo de la intersección de los haces de sonda y de la bomba es menor que 15 °. </li><li> Use un compuesto de referencia para alinear la sonda y la bombahaz para lograr una señal de PBD satisfactoria, es decir, una buena relación S / N y estable amplitud PBD en escalas de tiempo más largas (~ 100 ms). </li><li> Ajustar la posición del haz de la bomba con respecto al haz de la sonda por un ajuste incremental de 355 espejos láser nm. </li><li> Medir la amplitud de la señal de referencia de PBD como una diferencia entre dos fotodiodos superior e inferior en el detector sensible a la posición. La señal de PBD debe exhibir un rápido aumento de la amplitud en una escala de tiempo rápida (&lt;10 microsegundos) y permanecer estable en 100 mseg escala de tiempo como se demuestra en la Figura 3. Balón a la variabilidad del tiro de la amplitud AP está dentro del 5% de la amplitud de la señal y la reproducibilidad de la señal se ve afectada principalmente por las vibraciones. </li><li> Comprobar la linealidad en la amplitud de la señal PBD con respecto a la energía calorífica liberada por la medición de la dependencia lineal de la señal de PBD en la potencia del láser de excitación y en el número de Einsteins absorbida, E una= (1-10-A), donde A corresponde a la absorbancia de referencia a la longitud de onda de excitación. </li><li> Mantener la potencia del láser por debajo de aproximadamente 1000 mu J y la absorbancia del compuesto de muestra / referencia a la longitud de onda de excitación de menos de 0,5 para evitar la absorción múltiple de fotones y disminución de la potencia del haz de la bomba, respectivamente, y garantizar la linealidad de la señal de PBD. </li></ol> 3. PBD Medidas <ol><li> Comience con la medición de las huellas PBD para la referencia. Coloque la solución del compuesto de referencia en una célula de cuarzo de 0,5 cm x 1,0 cm x 1,0 cm o 1,0 cm y la posición de la celda en el soporte de temperatura controlada. Ambas longitudes de trayectoria proporcionan amplitud PBD comparables. </li><li> Detectar la señal de PBD referencia como una función de la temperatura en el rango de temperatura de 16-35 ° C con el incremento de temperatura de 3 ° C. </li><li> En cada cambio de temperatura, compruebe la posición del haz de prueba en el detector sensible a la posición y volverajustar la posición al centro del detector, si es necesario. </li><li> Comprobar la linealidad de la señal de PBD como una función de la [(dn / dt) / C p ρ] plazo de acuerdo con la Ecuación 2. </li><li> Colocar la solución de la muestra en la misma célula óptica como para el compuesto de referencia manteniendo la misma orientación de la célula óptica como para la medición de referencia. </li><li> Detectar los rastros de PBD de la muestra en el mismo rango de temperatura como para la referencia y comprobar la linealidad de la amplitud de la muestra PBD con respecto a la [(dn / dt) / C p ρ] plazo. </li></ol> 4. Análisis de Datos La magnitud de la desviación es directamente proporcional al cambio de volumen debido al calentamiento de la muestra (? V ª) y cambio de volumen no térmico (nonth? V) de acuerdo con la Ecuación 1: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="Ecuación 1" /> La amplitud de la muestra (A S) Y de referencia (A r) señal de PBD puede ser descrito usando las Ecuaciones 2 y 3, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="Ecuación 2" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="Ecuación 3" /> Señal de PBD es directamente proporcional al parámetro de respuesta del instrumento (K) y el número de Einsteins absorbida (Ea). El primer término en la ecuación 2, (dn / dt) (1/ρC p) Q, corresponde al cambio de la señal debido a la calor liberado al disolvente. El dn / dt término representa el cambio dependiente de la temperatura en el índice de refracción, ρ es la densidad del disolvente, C p es la capacidad calorífica. Todos los parámetros son conocidos por el agua destilada y se pueden determinar para una solución tampón mediante la comparación de una señal de PBD para el compuesto de referencia en agua destilada y en un tampón apropiado. Q es la cantidad de calor returned para el disolvente. El ρ (dn / d ρ) es un término constante-unidad menos que es independiente de la temperatura en el rango de temperatura de 10-40 ° C 10. Plazo ABS Delta n corresponde al cambio en el índice de refracción debido a la presencia de especies absorbentes en la solución y que es insignificante si la longitud de onda del haz de la sonda se desplaza en relación con los espectros de absorción de cualquier especie en la solución. La señal que surge a partir del compuesto de referencia (A r) se expresa por la Ecuación 3 donde E h ν es la energía del fotón a la longitud de onda de excitación, E h ν = 80,5 kcal / mol para 355 nm de excitación. <ol><li> Tome la amplitud de la señal de PBD referencia como la diferencia entre la señal de predisparo y PBD mensaje de activación como se demuestra en la Figura 3. De manera similar, determinar la amplitud de la rápida (A s rápido) y de fase lenta (A s lenta) De la señal de muestra de PBD. </li><li> Para eliminar el parámetro de respuesta del instrumento, K, la escala de la amplitud de la señal de la muestra PBD por la amplitud de la señal de PBD de la referencia. La relación de la señal de muestra para la señal de referencia se obtiene la ecuación 4 y se puede escribir como: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="Ecuación 4" /> </li><li> Usando esta ecuación, determinar el calor liberado a la solución (Q) y cambio de volumen no térmico (nonth? V) asociado con una reacción foto-iniciada de la pendiente y la intersección, respectivamente, de una parcela de [(A s / A r) E h ν] plazo frente a la temperatura término dependiente [(dn / dt) (1/ρCp)]. </li><li> Para determinar el volumen de reacción y el cambio de entalpía para el rápido y el lento proceso, escalar el volumen observado y el cambio de entalpía para el rendimiento cuántico apropiado de acuerdo con las ecuaciones 5-7. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg&quot; alt = &quot;Ecuación 5&quot; /&gt; <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="Ecuación 6" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="Ecuación 7" /> Para un proceso de múltiples pasos con una cinética que ocurren en la escala de tiempo entre 10 microsegundos ~ 200 mseg, el volumen y cambios de entalpía asociadas con los pasos individuales de la reacción pueden ser determinadas. Las amplitudes y tiempos de vida para los pasos individuales se analizaron ajustando los datos a la función f (t) que describe el perfil de tiempo del volumen y cambios de entalpía. <img alt="Ecuación 8" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" /> donde α 0 corresponde a la A s rápido y α i corresponde a A s lenta para cada proceso individual y τ i son la vida útil de los pasos de reacción individuales. A partir de la temperatura de la dependencia de la constante de velocidad FOr procesos individuales (K i = 1 / τ i) los parámetros de entalpía de activación y de entropía se puede determinar fácilmente mediante gráficos Eyring. </li></ol>

<ol>
	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations.">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li><li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water.">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li><li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El principio físico detrás de métodos fototérmica es que una molécula fotoexcitado disipa el exceso de energía a través de la relajación vibracional al estado fundamental, lo que resulta en el calentamiento térmico de la 1,12 disolvente circundante. Para disolventes tales como agua, esto produce una rápida expansión de volumen (? V ª). Moléculas en estado excitado también pueden someterse a procesos fotoquímicos que producen cambios de volumen no térmicos (nonth? V) debid...

Métodos foto-térmica, como la calorimetría fotoacústica, desviación del rayo fototérmica (PDB), y rallado transitorias acoplado con excitación láser de nanosegundos representan una poderosa alternativa a los transitorios espectroscopias ópticas para los estudios con resolución temporal de los intermedios de corta duración 1,2. En contraste con las técnicas ópticas, como la absorción transitoria y espectroscopia de IR, que supervisan el perfil de tiempo de los cambios de absorción en el cromóforo circundante; técnicas fototérmicos detectar la dependencia del tiempo de los cambios de calor / volumen y por lo tanto son herramientas valiosas para la investigación de los perfiles de tiempo de ópticamente procesos &quot;silenciosos&quot;. Hasta el momento, la calorimetría fotoacústica y rallado transitoria se ha aplicado con éxito para estudiar la dinámica de conformación de procesos foto-inducidos, incluyendo la migración ligando diatómico en globinas 3,4, ligando con la proteína sensor de oxígeno FixL 5, electrón y el transporte de protones en hemo-cobre oxidasas 6 unND fotosistema II, así como la foto-isomerización en la rodopsina 7 y dinámica de conformación en criptocromo 8. Para ampliar la aplicación de técnicas fototérmica a los sistemas biológicos que se carece de un cromóforo y / o fluoróforo interna, la técnica de PBD se combinó con el uso del compuesto enjaulado a la foto-gatillo de un aumento en la concentración de ligando / sustrato dentro de unos pocos microsegundos o más rápido, dependiendo en el compuesto enjaulado. Este enfoque permite el monitoreo de la dinámica y de la energética de los cambios estructurales asociados con el ligando / sustrato unión a las proteínas que se carece de un fluoróforo interna o cromóforo y en escala de tiempo que no es accesible con instrumentos de parada de flujo comercial. Aquí una aplicación de PBD para supervisar la termodinámica del compuesto jaula, Ca 2 + DM-nitrofen, foto-escisión, así como la cinética del Ca 2 + asociación para el dominio C-terminal del sensor de calcio neuronal de Downcorriente Reguladora Element Antagonista Modulador (SUEÑO) se presenta. El Ca 2 + es foto-liberado de Ca 2 + DM-nitrofen dentro de 10 microsegundos y vuelve a enlazar a una jaula unphotolysed con una constante de tiempo de ~ 300 microsegundos. Por otro lado, en la presencia de apoDREAM se observa una cinética adicional que se produzca en la escala de tiempo de milisegundos y refleja la unión a la proteína ligando. La aplicación de PBD para sondear las transiciones conformacionales en los sistemas biológicos ha sido de alguna manera limitado debido a las dificultades instrumentales, por ejemplo ardua la alineación de la sonda y haz de bombeo para lograr una señal fuerte y reproducible PBD. Sin embargo, un diseño meticuloso de una instrumentación configuración, un control preciso de la temperatura, y una alineación cuidadosa del haz de la sonda y la bomba proporcionan una señal de PBD consistente y robusto que permite la monitorización de volumen resuelta en el tiempo y cambios de entalpía en una amplia escala de tiempo de 10 microsegundos a unos 200 ms. Además, en modificaciónciones del procedimiento experimental para asegurar la detección de muestra y de referencia trazas bajo temperatura idéntica, la composición del tampón, la orientación célula óptica, la potencia del láser, etc reduce significativamente el error experimental en volúmenes y entalpías de reacción medidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col /> 
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#39;,N&#39;-Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D-6814</td>
			<td style="width:220px;">DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation,</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Adrich</td>
			<td>0909C</td>
			<td>HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium ferricyanide(III)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:84px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:220px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium chromate</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">307831</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">He-Ne Laser Diode 5mW 635nm </td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">54-179</td>
			<td style="width:220px;">use as a probe beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Oscilloscope, </td>
			<td style="width:84px;">LeCroy</td>
			<td style="width:119px;">Wave Surfer 42Xs</td>
			<td style="width:220px;">400 MHz bandwith</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:84px;">Continuum</td>
			<td style="width:119px;">ML II</td>
			<td>pump beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M355; Nd:YAG laser mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">47-324</td>
			<td>laser mirror for 355 nm laser line</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M1 and M2; Laser diode mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-532</td>
			<td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P1 and P2; Iris Diaphragm</td>
			<td style="width:84px;">Edmind Optics</td>
			<td style="width:119px;">62-649</td>
			<td style="width:220px;">pin hole to shape the probe and pum beams</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">L1; bi-convex lens</td>
			<td style="width:84px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">LB1844</td>
			<td style="width:220px;">a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 - 2000 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DM, dichroic mirror</td>
			<td style="width:84px;">Thorlab </td>
			<td style="width:119px;">DMLP505</td>
			<td style="width:220px;">a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F1; Edge filter</td>
			<td style="width:84px;">Andower </td>
			<td style="width:119px;">500FH90-25</td>
			<td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-controlled cuvette holder</td>
			<td style="width:84px;">Quantum Northwest</td>
			<td style="width:119px;">FLASH 300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

Desviación del rayo fototérmica junto con fotoacústica calorimetría y rallado térmica pertenece a la familia de métodos fototérmicos que controlar el volumen y el tiempo de entalpía perfil cambios de luz inducidos cambios conformacionales en proteínas en microsegundos a milisegundos escalas de tiempo que no son accesibles mediante parada tradicional instrumentos de flujo. Además, puesto que se sondean cambios globales en el volumen y / o entalpía, estas técnicas se pueden aplicar a las proteínas y otras biomacromoléculas que carecen de un fluoróforo y una etiqueta o cromóforo. Para monitorear la dinámica y energética de los cambios estructurales asociados con Ca 2 + vinculante a los transductores de calcio, tales sensores de calcio neuronales, un compuesto de calcio enjaulado, DM-nitrofen, se emplea para la foto-trigger un rápido aumento (τ &lt;20 microsegundos) en el calcio libre concentración y el volumen asociado y entalpía cambios se probaron utilizando la técnica de deflexión de haz fototérmica.

Un ejemplo representativo de PBD traza de Ca 2 + foto de liberación de Ca 2 + DM-nitrofen se muestra en la Figura 3. La fase rápida corresponde a la foto-disociación de Ca 2 + DM-nitrofen y Ca 2 + liberación, mientras que la fase lenta refleja Ca 2 + vinculante a la jaula nonphotolysed. La trama de la muestra de amplitud PBD para la fase de rápido y lento escala a la amplitud del compuesto de referencia como una función del factor de dependido...

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Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection | Chemistry | Video

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Aquí se presenta una aplicación de la técnica de deflexión de haz fototérmica en combinación con un compuesto de calcio enjaulado, DM-nitrofen, para supervisar microsegundos y milisegundos dinámica y de la energética de cambios estructurales asociados con la asociación de calcio a un sensor de calcio neuronal, elemento regulador aguas abajo Antagonista Modulador .

Submillisecond Cambios conformacionales en proteínas resueltas por fototérmica Desviación de haz

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

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8.9K vistas.  Florida International University.  Aquí se presenta una aplicación de la técnica de deflexión de haz fototérmica en combinación con un compuesto de calcio enjaulado, DM-nitrofen, para supervisar microsegundos y milisegundos dinámica y de la energética de cambios estructurales asociados con la asociación de calcio a un sensor de calcio neuronal, elemento regulador aguas abajo Antagonista Modulador . 

Video: Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

La Determinación De Los Planos De Unión Al Hielo De Las Proteínas Anticongelante Por La Afinidad De Plano De Hielo Basado En Fluorescencia

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Investigación

Química

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

El uso de la cromatografía de gases para analizar los cambios de composición de ácidos grasos en el tejido de hígado de rata durante el embarazo

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

El radiomarcado y cuantificación de los niveles celulares de Fosfoinosítidos por acoplado a cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de centelleo

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). The fibronectin protein film was immobilized on the silicon nitride (SiN) membrane that forms the SALVI detection area. During ToF-SIMS analysis, three modes of analysis were conducted including high spatial resolution mass spectrometry, two-dimensional (2D) imaging, and depth profiling. Mass spectra were acquired in both positive and negative modes. Deionized water was also analyzed as a reference sample. Our results show that the fibronectin film in water has more distinct and stronger water cluster peaks compared to water alone. Characteristic peaks of amino acid fragments are also observable in the hydrated protein ToF-SIMS spectra. These results illustrate that protein molecule adsorption on a surface can be studied dynamically using SALVI and ToF-SIMS in the liquid environment for the first time.

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work presents a protocol for liquid handling and sample introduction to a microchannel for in situ time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of protein biomolecules in an aqueous solution.

In Situ caracterización de proteínas hidratadas en agua por Salvi y TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Un ensayo de HS-MRM para la cuantificación de las proteínas de la célula huésped en productos biofarmacéuticos de proteínas por cromatografía líquida QTOF masa espectrometría por movilidad iónica

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables the acquisition of photoluminescence spectra covering the time regime from nanoseconds up to 0.1 s. This enables us to follow the changes in the intensity (decay) and emission of the spectra over time. Using this method, it is possible to study diverse photophysical phenomena, such as the emission of phosphorescence, and the contributions of prompt and delayed fluorescence in molecules showing thermally activated delayed fluorescence (TADF). Remarkably, all spectra and decays are obtained in a single experiment. This can be done for solids (thin film, powder, crystal) and liquid samples, where the only limitations are the spectral sensitivity of the camera and the excitation wavelength (532 nm, 355 nm, 337 nm, and 266 nm). This technique is, thus, very important when investigating the excited state dynamics in organic emitters for their application in organic light-emitting diodes and other areas where triplet harvesting is of paramount importance. Since triplet states are strongly quenched by oxygen, emitters with efficient TADF luminescence, or those showing room temperature phosphorescence (RTP), must be correctly prepared in order to remove any dissolved oxygen from solutions and films. Otherwise, no long-lived emission will be observed. The method of degassing solid samples as presented in this work is basic and simple, but the degassing of liquid samples creates additional difficulties and is particularly interesting. A method of minimizing solvent loss and changing the sample concentration, while still enabling to remove oxygen in a very efficient and a repeatable manner, is presented in this work.

Here, we present a method of the spectroscopic characterization of organic molecules by means of time-resolved photoluminescence spectroscopy on the nanosecond-to-millisecond timescale in oxygen-free conditions. Methods to efficiently remove oxygen from the samples and, thus, limit luminescence quenching are also described.

Tiempo-resolved fotofísicas caracterización de trío cosecha compuestos orgánicos en un libre de oxígeno ambiente usando un iCCD cámara

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

Partícula magnética de ADN vinculante el análisis por la dispersión ligera dinámica y electroforética

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

La expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescente de manera eficiente en las plantas

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound electrons with neutral molecules/atoms. State-of-the-art in vacuo anion generation techniques allow application to a broad range of atomic, molecular, and cluster anion systems. These are separated and selected using time-of-flight mass spectrometry. Electrons are removed by linearly polarized photons (photo detachment) using table-top laser sources which provide ready access to excitation energies from the infra-red to the near ultraviolet. Detecting the photoelectrons with a velocity mapped imaging lens and position sensitive detector means that, in principle, every photoelectron reaches the detector and the detection efficiency is uniform for all kinetic energies. Photoelectron spectra extracted from the images via mathematical reconstruction using an inverse Abel transformation reveal details of the anion internal energy state distribution and the resultant neutral energy states. At low electron kinetic energy, typical resolution is sufficient to reveal energy level differences on the order of a few millielectron-volts, i.e., different vibrational levels for molecular species or spin-orbit splitting in atoms. Photoelectron angular distributions extracted from the inverse Abel transformation represent the signatures of the bound electron orbital, allowing more detailed probing of electronic structure. The spectra and angular distributions also encode details of the interactions between the outgoing electron and the residual neutral species subsequent to excitation. The technique is illustrated by the application to an atomic anion (F&#8722;), but it can also be applied to the measurement of molecular anion spectroscopy, the study of low lying anion resonances (as an alternative to scattering experiments) and femtosecond (fs) time resolved studies of the dynamic evolution of anions.

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&lt;sup&gt;&amp;#8722;&lt;/sup&gt;

Here, we present a protocol for photoelectron imaging of anionic species. Anions generated in vacuo and separated by mass spectrometry are probed using velocity mapped photoelectron imaging, providing details of anion and neutral energy levels, anion and neutral structure and the nature of the anion electronic state.

La proyección de imagen del fotoelectrón de aniones ilustrado por 310 Nm la separación de F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

Mejora de extrusión de alta viscosidad de microcristales para Cristalografía de femtosegundo Serial tiempo resuelto en láseres de rayos x

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...