Este protocolo se ha diseñado para garantizar que los problemas que se encuentran con frecuencia durante los experimentos cristalográficos en serie resueltos en el tiempo no comprometan la calidad de los datos. Una de las principales ventajas de este método es su adaptabilidad a los sistemas de cristal individuales. La prueba de extrusión de cámara de alta velocidad también nos permite medir directamente la estabilidad de la extrusión.
En primer lugar, cargue 50 microlitros de LCP a base de monoolela cristalina en una jeringa de 100 microlitros unos 30 minutos antes de la inyección. Para la inyección en un entorno de vacío, cargue cinco microlitros de MAG 7.9 y cinco microlitros de parafina líquida en la parte posterior de una segunda jeringa. Sosteniendo la jeringa verticalmente, expulse las burbujas de aire de la jeringa.
Conecte la jeringa con MAG 7.9 y la parafina a un acoplador de jeringa estándar. Y purgue el aire del acoplador presionando suavemente el émbolo hasta que un pequeño volumen de la mezcla sea visible en la punta de la aguja del acoplador. Conecte la jeringa de muestra al acoplador de la jeringa que lleva el coche para no introducir aire en la muestra.
Mezclar en el lípido y la parafina pasando la muestra a través del acoplador varias veces. A continuación, cargue 20 microlitros de LCP premezclado en otra jeringa de 100 microlitros. Retire la jeringa vacía del acoplador y conecte el LCP premezclado al cristal que contiene la jeringa utilizando un acoplador de jeringa estándar.
A continuación, pase la muestra a través del acoplador 100 veces. Para llevar la muestra a la fase cúbica, añadir tres microlitros de monooleina y mezclar 50 veces. Repita este procedimiento hasta que se haya formado una fase transparente para evitar un exceso de monooleina.
Como prueba preliminar para la rigidez y la extrusión de la muestra, desprenda la jeringa vacía del acoplador de la jeringa y sostenga la jeringa verticalmente, apriete una pequeña cantidad de toma de muestras a través del acoplador. Si la muestra extruida forma un cilindro vertical, entonces la muestra está lista para pruebas de extrusión. Ajuste el volumen total de la muestra a 100 microlitros añadiendo más LCP premezclado.
Coloque la jeringa de muestra y dos jeringas vacías en el acoplador de jeringa de tres vías. Mezclar al menos 50 veces pasando la mitad de la muestra a la segunda jeringa y luego presionando ambas mitades de la muestra en la tercera jeringa simultáneamente. Coloque la jeringa que contiene la muestra mixta bajo un microscopio estéreo para verificar una distribución homogénea de cristales.
Purgue una bomba HPLC y todas las líneas de agua para asegurarse de que los caudales sean precisos. A continuación, purgue la etapa hidráulica del inyector. A continuación, encienda y conecte la cámara al software suministrado.
Con un vídeo en directo para obtener retroalimentación visual, coloque la punta de la boquilla en el centro del marco y enfójela con la etapa de tres ejes. Establezca la velocidad de fotogramas de la cámara en 1.000 fotogramas por segundo. A continuación, establezca la resolución en 512 por 512 píxeles.
Con el tiempo de exposición ahora ajustado por la velocidad de fotogramas, ajuste el nivel de iluminación hasta que la boquilla sea visible. Vuelva a colocar la punta de la boquilla de modo que se centre de izquierda a derecha y se encuentre en el tercio superior del marco. Configure la cámara en modo de lapso de tiempo.
Establezca el intervalo en 30 segundos y las repeticiones en 40 veces. Establezca el modo de disparo al azar. E introduzca el número de fotogramas que desea grabar en 1.000.
Ahora, cargue el depósito con 20 microlitros de la muestra de prueba y conecte la boquilla capilar. Fije el depósito lleno al inyector. A continuación, conecte la línea de gas al puerto de la boquilla e inicie el flujo de gas.
Después de esto, inicie simultáneamente la bomba y la grabación de la cámara. Supervise la extrusión hasta que la presión de la bomba aumente bruscamente cerca de la hora de finalización esperada. A continuación, detenga la grabación, apague la bomba y desahogue la presión del sistema abriendo la válvula de alivio.
Después de esto, abra el archivo de vídeo con el software de análisis y calibrar las herramientas de medición. Encuentre un fotograma en el vídeo donde haya una función rastreable visible en la extrusión. Registre el número de fotograma.
A continuación, avance el vídeo a un fotograma donde la misma función esté visible pero se haya movido desde su posición en el paso anterior. Registre el número de fotograma. Con la herramienta de medición de línea recta, mida la distancia desde el punto inicial y final de la entidad a través de la medida de análisis.
Repita los pasos anteriores varias veces para cada segmento del vídeo. Por último, trace la serie de datos. El material de partida ideal para el procedimiento descrito aquí son las altas densidades de microcristales incorporadas en un medio portador viscoso para el inyector.
Los cristales proteicos se utilizaron para recopilar datos TRSFX sobre la bacteria bombeada de protones rodopsin, que reveló los cambios ultra rápidos que se producen después de la absorción de fotones. Después de la preparación de la muestra utilizando un acoplador de tres vías, la inspección visual del material en la jeringa muestra homogeneidad de la muestra. Y las imágenes del microscopio pueden confirmar la densidad de los cristales.
La muestra se encuentra en fase cúbica cuando el medio de entrega es transparente y viscoso. Las mezclas turbias son una indicación de que la muestra está en una fase de esponja o lamelar, pero no son concluyentes, ya que la alta densidad cristalina puede oscurecer la claridad del LCP. Se puede realizar una prueba de baja presión para identificar la fase de esponja tirando del émbolo de la jeringa de la muestra.
Durante la prueba de chorro, la muestra debe extruir una larga columna continua de LCP que se mueve a una velocidad casi constante. Las muestras que se ejecutan en modo de goteo indican que la viscosidad es demasiado baja. Los datos de las muestras que forman una columna deben mostrar que la extrusión permanece por encima de una velocidad mínima dictada por los parámetros experimentales.
Después de la optimización utilizando este protocolo, los datos cristalográficos serie de resolución de tiempo se pueden recopilar en una instalación experta. Esto revelará los cambios conformacionales en toda la proteína a medida que realiza su función.
