Los autores desean agradecer a George Farr y a los miembros del laboratorio de Horwich por sus útiles discusiones. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Médico Howard Hughes.

Los procedimientos descritos aquí para la anestesia, la eutanasia, y la perfusión cardiaca de ratones fueron realizados bajo protocolo aprobado por el comité institucional del cuidado y del uso animal de la universidad de Yale.
1. Preparación de instrumentos y soluciones libres de ARNasa
<ol><li>La ARNasa es un contaminante común de todas las superficies de laboratorio, incluyendo las tapas de banco, las micropipetas y el investigador.<ol>
<li>Cambie los guantes con frecuencia o regularmente limpie con una solución descontaminante de RNAse.</li>
		<li>Las herramientas de disección de acero inoxidable y la cristalería se pueden hacer libres de ARNasa calentando a >200 ° C durante 1 hora o más. Nota: La esterilización por vapor no destruye la ARNasa. Alternativamente, limpie con una solución descontaminante de RNase, luego con etanol al 70% libre de ARNasa y seque al aire.</li>
		<li>Limpie los bancos, otras superficies de laboratorio y micropipettors con la solución descontaminante de la ARNasa, entonces con el etanol 70% RNase-libre. Designe un banco de laboratorio específico o un área de trabajo para la recuperación y el análisis del ARN. Nota: Retire los eyectores de punta antes de limpiar los ejes de los pipeteadores y déjelos apagados, si es posible.</li>
		<li>Use tubos, tubos de microcentrífugas, pipetas y puntas de micropipetas que estén certificados por su fabricante como libres de ARNasa. Se recomienda el uso de puntas de unión muy bajas y microtubos. Si es posible, use cajas o bolsas recién abiertas de estos componentes y manténgalas separadas del suministro general de laboratorio.</li>
		<li>Obtenga soluciones libres de ARNasa [PBS (PBS) sin calcio y magnesio de Dulbecco, etanol, etanol al 70% sin ARNasa] de fuentes comerciales. Use botellas recién abiertas para cada experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La fuente del tinte Azure B es fundamental para la recuperación exitosa del ARN intacto. Pruebe cada lote de tinte antes de comprometer muestras preciosas para la tinción y la recolección. Recoger unos pocos miles de neuronas de un animal no experimental, preparar el ARN, y determinar la integridad del ARN como se describe a continuación para encontrar uno que produce consistentemente números de RIN por encima de 8.5.<ol>
<li>Disuelva el colorante Azure B (1%, peso/vol) en etanol al 70% libre de ARNasa, típicamente 0,3 g en etanol de 30 ml en un tubo centrífuga de 50 ml. Mezcle bien en un balancín en RT durante la noche o hasta que todas las partículas se hayan disuelto. Un tubo de esta solución se puede utilizar para teñir múltiples portaobjetos sin afectar la intensidad de la tinción.</li>
		<li>Como precaución, utilice un tubo diferente de mancha para cada réplica biológica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use los cryomolds y O.C.T. para incrustar secciones del cordón sin tratamiento adicional.</li>
	<li>Mantenga el criostato a -20 a -24 °C. Después de sececcionar, coloque las guías en un congelador de -80 °C hasta que se haya preparado un número suficiente. Comience la preparación del ARN tan pronto como sea posible después de que se hayan hecho las diapositivas. Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga los bloques OCT no seccionados o parcialmente seccionados, en lugar de los portaobjetos, a 80 °C.</li>
	<li>Haga el almacenador intermediario del tiocianato de guanidina para la preparación del ARN de las neuronas de motor disecadas usando las soluciones proporcionadas por el fabricante del kit de preparación del ARN según sus instrucciones.</li>
</ol>2. Preparación de secciones de la médula espinal de ratones (Figura 1A)
<ol><li>Limpie todas las herramientas de disección, portaobjetos de vidrio, cuchillas de afeitar y plataforma de disección horneando o limpiando con una solución descontaminante de RNasa, seguida de etanol al 70% libre de ARNasa. Dejar secar durante 2 min. Mantenga todo libre de polvo cubriéndolo con toallitas de laboratorio.</li>
	<li>Los procedimientos de manipulación de animales, incluida la anestesia, la perfusión cardíaca y la eutanasia, deben llevarse a cabo de acuerdo con los requisitos del comité institucional local de cuidado y uso de animales (IACUC), con el objetivo de llevar rápidamente al animal al punto de disección de la médula espinal.<ol>
<li>Anestesiar el ratón mediante la inyección intraperitoneal (ip) de una dosis letal de ketamina (450 mg/kg).</li>
		<li>Una vez que se alcanza un nivel profundo de anestesia y se confirma por la falta de una respuesta de dedo del pie-pellizco, coloque el lado ventral del ratón hacia arriba en una plataforma de disección (una tabla de poliestireno, por ejemplo), abra la cavidad torácica para exponer el corazón e inserte la aguja de mariposa de 27 G de un conjunto de infusión en el ventrículo izquierdo (que está a la derecha del investigador). Mella la aurícula derecha con un pórceps agudo, y perfundir con PBS a una velocidad de 5-7 ml/min durante aproximadamente 2 min usando una bomba peristáltica. El líquido que fluye de la aurícula debe estar en gran parte libre de sangre en este punto.</li>
		<li>Retire la aguja de perfusión, decapitar el ratón y darle la vuelta en el tablero de disección. Abra la piel para exponer la columna vertebral, use pequeñas tijeras y desobósceros para extraer las vértebras y levante la médula espinal mientras corta las raíces nerviosas con un pórceps afilado. La velocidad y la práctica son esenciales para moverse desde el inicio de la perfusión hasta la extracción del cordón; esto no debe tomar más de 7 min.</li>
		<li>Enjuague el cordón durante 10 segundos en agua sin ARNasa para lavar cualquier sangre residual. Coloque la médula espinal en un portaobjetos de vidrio libre de ARNasa con un fórceps curvo muy suavemente pero rápidamente. Divida la médula espinal transversalmente usando una cuchilla de afeitar limpia en 9-10 piezas.</li>
		<li>Coloque las piezas en un cryomold lleno de O.C.T. usando los mismos pórceps, y alinee verticalmente usando una aguja limpia. Coloque el molde en una bandeja poco profunda que contenga 2-metilbutano preenfriado con nitrógeno líquido, y luego coloque la bandeja en un baño de nitrógeno líquido para congelar rápidamente las piezas de la médula espinal para evitar la degradación del ARN.</li>
		<li>Guarde el bloque integrado en OCT a -80 °C durante un hasta 6 meses antes de sección. El proceso desde la recuperación del cordón a través de la congelación debe realizarse dentro de los 5 min para mantener la integridad del ARN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Criosección del bloque incrustado en O.C.T. a -20 °C con un criostato para producir rebanadas de 20 μm, cada una conteniendo 9-10 secciones transversales de la médula espinal, en portaobjetos de membrana PEN de 2 μm sin ARNasa mantenidos inicialmente a temperatura ambiente para garantizar que las secciones se adhieran al portaobjetos. Vuelva a congelar inmediatamente la sección en una superficie de -20 °C dentro del criostato. Mantenga las guías a -80 °C hasta que se utilicen.</li>
</ol>3. Tinción de las secciones de la médula espinal (Figura 1A)
<ol><li>En un estante limpio, coloque seis tubos cónicos de 50 ml. Llénelos todos con 25-30 ml de etanol al 70% libre de ARNasa, de modo que la profundidad sea suficiente para cubrir todas las secciones de un portaobjetos cuando el portaobjetos esté sumergido. Haga 30-35 ml de solución 1% de Azure B como se describió anteriormente y manténgala en el mismo bastidor para minimizar el tiempo entre el cambio de soluciones durante el lavado o la tinción. Mantenga tres o cuatro toallitas de laboratorio frente al estante para drenar la solución adicional rápidamente.</li>
	<li>Saque los portaobjetos del congelador de -80 °C sobre hielo seco. Descongelar un portaobjetos colocándolo en una palma enguantado. Elimine la mayor parte de la humedad y la condensación en el portaobjetos limpiándolo con una toallita de laboratorio, teniendo cuidado de no tocar las secciones. Coloque el portaobjetos en gel de sílice fresca desecante en una placa de Petri durante 30-40 segundos para secar completamente. Si la humedad del laboratorio es alta, se puede utilizar un tratamiento breve en un dessicador al vacío para secar el portaobjetos más rápidamente.</li>
	<li>Lavado y tinción.<ol>
<li>Sumerja el portaobjetos seco en el primer tubo de etanol al 70% libre de ARNasa. Remoje la diapositiva durante 30 segundos, luego lave la diapositiva para quitar la OCT sumergiéndola hacia arriba y hacia abajo durante 45-60 seg. Saque el portaobjetos de la solución y drene el exceso de líquido en las toallitas de laboratorio. Repita el mismo proceso sumergiendo el portaobjetos en el segundo tubo de etanol al 70%. Si la OCT alrededor de las secciones de la médula espinal no ha desaparecido por completo, repita el lavado en el tercer tubo.</li>
		<li>Después de drenar el exceso de líquido, sumerja el portaobjetos en una solución De Azure B al 70% en etanol libre de ARNasa al 70% durante 30-45 segundos. Drene el exceso de Azure B en una toallita de laboratorio; en este punto, toda la diapositiva será azul.</li>
		<li>Sumerja el portaobjetos en el siguiente tubo de etanol al 70%, y sumerja hacia arriba y hacia abajo rápidamente 3-4x para eliminar el exceso de tinte y hacer visible la tinción específica de la neurona motora. Si las secciones se ven muy oscuramente teñidas, repita el paso de detención en un tubo fresco de etanol al 70%. Si la tinción parece demasiado ligera, devuelva la diapositiva a la solución de Azure B durante otros 30 segundos y repita la detención. Limpie el exceso de etanol y seque al aire el portaobjetos durante ~ 40 segundos hasta que todo el líquido se haya ido. La materia gris será azul claro, mientras que las neuronas motoras se tiñerán de azul profundo, que es fácilmente visible. Comience la disección inmediatamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Microdisección de captura láser (LMD) (Figura 1B)
<ol><li>Encienda el microscopio y descargue el soporte del tubo para colocar la tapa de un tubo de microfugio de 0,6 ml para la recolección de muestras. Coloque un tampón de lisis de guanidina tiocianato de 30 μl en la tapa de un tubo de microfugio de 0,6 ml. Cubra la superficie de la tapa con líquido extendiendo la solución con una punta de pipeta. De esta manera, todas las neuronas recolectadas se disolverán en solución solubilizante a medida que se diseccionan. Alinee la tapa con el agujero y el objetivo con el software del microscopio. Mantenga la tapa en la posición cubierta hasta que comience la captura láser.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos secado al aire en el escenario del microscopio LMD boca abajo, de modo que la membrana del portaobjetos PEN se encarcete hacia abajo. La membrana con secciones debe enfrentarse al agujero, debajo del cual se encuentra el tubo de recolección.</li>
	<li>Encienda el láser 10 minutos antes de comenzar la preparación de la diapositiva. Concéntrese en una sección de la médula espinal con el objetivo 5X. Pasar al objetivo 20X para la disección.<ol>
<li>Marque una región "ficticia" con el lápiz de luz y permita que el láser la corte sin recogerla. Esto relaja la membrana pen y hace posible marcar y cortar múltiples regiones sucesivamente.</li>
		<li>Reenfoque e identifique las neuronas motoras en la región del cuerno ventral. Estas neuronas son reconocibles por su ubicación, su morfología piramidal, su gran tamaño y su color azul oscuro con Azure B (Figura 2).</li>
		<li>Usando el lápiz de luz, seleccione la herramienta de dibujo y marque a lo largo del borde de las neuronas motoras, haciendo un contorno completo. Trate de hacer el contorno lo más cerca posible de la neurona motora para evitar la contaminación de las células que no sean la neurona motora. (Pruebe algunas secciones de antemano para ver qué tan ancha es la línea de corte del láser y ajuste la holgura según sea necesario). Marcar varias células antes de cortar; el software recordará las posiciones.</li>
		<li>Traiga la tapa debajo de la posición de corte haciendo clic en la posición de la tapa. Haga clic en el botón de inicio para iniciar la disección de la neurona motora con el láser. Recoger todas las neuronas motoras de todas las secciones en una diapositiva en la tapa de un tubo de microfugio.</li>
		<li>Una vez completada la recolección, saque el tubo de microfuge del soporte descargando la bandeja y desalojando suavemente el tubo. Disuelva completamente las neuronas motoras en el tampón pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo. Mueva la solución al cuerpo del tubo centrifugándose a 14.000 x g durante 2 min a 4 °C. Congele la muestra inmediatamente en hielo seco y guárdela a -80 °C. Este proceso, desde la tinción de diapositivas hasta la recolección de neuronas motoras, debe realizarse dentro de los 30 minutos de un portaobjetos para minimizar la degradación del ARN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Preparación de ARN de las neuronas motoras
Descongelar todas las neuronas recolectadas de un animal y agruparlas para extraer ARN. Las muestras pueden verse de color azul pálido dependiendo del número de neuronas motoras (teñidas con Azure B) en ellas. Extraiga el ARN utilizando un kit adecuado de acuerdo con el protocolo previsto para el tejido LMD, eluting en el mínimo volumen posible. Tome 1 μl para comprobar la cantidad y la integridad de la muestra. Congele rápidamente el ARN restante en hielo seco y almacénelos a -80 °C.
6. Determinación de la calidad y cantidad de ARN
Determinar la calidad del ARN con la muestra de 1 μl en un chip de microfluídica de electroforesis capilar según el protocolo del fabricante. Las preparaciones totales del ARN con un número de la integridad del ARN (RIN) sobre 8,5 se pueden utilizar para el ARN-seq y el qRT-PCR. La salida de datos también suele incluir la concentración aproximada de la muestra.

<ol>
	<li>Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+proteomic+profiling+of+frozen+pancreatic+CD24++adenocarcinoma+tissues+by+immuno-laser+capture+microdissection+and+nano-LC-MS/MS.">Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS.</a> J. Proteome. Res. , (2013).</li><li>Bandyopadhyay, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+profiling+of+spinal+cord+motor+neurons+from+a+presymptomatic+SOD1+ALS+mouse..">RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse..</a> PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).</li><li>Shea, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+cytophotometric+estimation+of+absolute+amount+of+ribonucleic+acid+using+azure+B1.">A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1.</a> J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol. Biol. 7, (2006).</li><li>Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+RNA+in+Pick's+and+Alzheimer's+diseases.+Comparison+of+disease-susceptible+and+disease-resistant+cortical+areas.">Neuronal RNA in Pick's and Alzheimer's diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas.</a> Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).</li><li>Lobsiger, C. S., Boill&#233;e, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+from+different+SOD1+mutants+dysregulates+the+complement+system+and+the+neuronal+regenerative+response+in+ALS+motor+neurons.">Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).</li><li>Ferraiuolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+cellular+pathways+involved+in+the+adaptation+to+and+progression+of+motor+neuron+injury+in+the+SOD1+G93A+mouse+model+of+familial+ALS.">Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS.</a> J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).</li><li>Sturm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+laser+microdissection+of+human+pancreatic+islets+from+surgical+specimens.">Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens.</a> J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).</li><li>Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+immunolabeled+astrocytes+allows+quantification+of+astrocytic+gene+expression.">Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression.</a> J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+aggregation+despite+chaperone+associations+of+a+mutant+SOD1-YFP+in+transgenic+mice+that+develop+ALS.">Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La medida más significativa de éxito de este protocolo para la producción de ARN total por microdisección láser de rodajas de la médula espinal es el valor de RIN5. Para las muestras de ARN de eucariotas superiores, los valores superiores a 8,5 producen regularmente datos de secuenciación de alta calidad y qRT-PCR. Si el rendimiento es bajo pero la calidad es alta, repita la preparación. Sin embargo, si la integridad es menor (incluso 7.5-8), es mejor encontrar el origen del problema e intentarlo de nuevo. Hay muchos pasos en los que algo puede salir mal, pero en realidad sólo dos fuentes del problema - contaminación endógena por ARNasa o contaminación por ARNasa exógena. El primero se puede abordar mediante la práctica, de modo que se minimice el tiempo desde el sacrificio del ratón hasta la congelación de su cable integrado O.C.T. El otro punto en el protocolo donde la ARNasa endógena puede contribuir a un resultado pobre es durante la preparación de las rebanadas. Cada rebanada debe adherirse a un portaobjetos PEN a temperatura ambiente rápidamente, pero se derretirá (el O.C.T se vuelve claro). Cuanto más rápido se pueda volver a congelar la rebanada, mejor. El criostato que utilizamos tiene superficies planas dentro de la cámara que están a -20 °C, que utilizamos para volver a congelar rápidamente la rebanada. Encuentre un lugar similar en el criostato utilizado y asegúrese de que la rebanada vuelva a ser opaca rápidamente.
Rastrear las fuentes de ARNasa exógena puede ser difícil, porque hay muchas posibilidades. Los únicos reactivos usados que no están expresamente libres de RNase son O.C.T. y Azure B. Si el Azure B ha funcionado satisfactoriamente antes, pruebe una botella fresca de O.C.T., aunque este reactivo nunca ha sido un problema. Los reactivos libres de ARNasa también pueden ser reemplazados, incluso de un proveedor diferente. Una fuente mucho más probable es el investigador. Además de una limpieza exhaustiva del área de trabajo, a menudo es útil que otro miembro del laboratorio siga y observe todos los pasos del procedimiento. Incluso si se trata de alguien que no realiza rutinariamente este procedimiento, un nuevo conjunto de ojos puede recoger una fuente de contaminación que de otra manera pasaría desapercibida.
Extender este protocolo a la recuperación de ARN de otras células de la médula espinal, de células de la médula espinal de otras especies, o de tipos específicos de células en otros órganos requerirá modificaciones en varias áreas dirigidas a lograr una identificación clara de las células de interés, evitando, o al menos minimizando, el impacto de la ARNasa endógena. En el protocolo aquí, la rápida eliminación y congelación del cable, junto con la tinción de Azure B en etanol al 70%, permitió tanto la minimización de la degradación del ARN como la fácil identificación de los cuerpos celulares de las neuronas motoras. Azure B es una mancha histoquímica bien establecida para neuronas que parece unirse al ARN3 y se ha utilizado para evaluar el contenido de ARN de las neuronas en muestras de autopsia de tejido cerebral de pacientes con enfermedad neurodegenerativa6. En particular, la tinción de Azure B no afectó a la integridad del ARN purificado ni a su capacidad para transcribirse y analizarse inversamente. Otros tintes, como la violeta cresil7 y el azul toluidina8 se han utilizado en protocolos lmd similares. La recolección de los cuerpos celulares directamente en la solución de tiocianato de guanidina a medida que se diseccionaban proporcionó el paso final que resultó en la recuperación rutinaria de ARN intacto.
Acercamientos similares se pueden prever para otras células y órganos, reconociendo que la identificación de las células del interés mientras que minimiza o, preferiblemente, previene la degradación del ARN por RNases endógenos es el requisito crítico para el análisis acertado. En tejidos que tienen altos niveles de ARNasa, como el páncreas, el manejo rápido y la baja temperatura se han combinado para permitir la recuperación del ARN de las células β, aprovechando su autofluorescencia natural para la visualización9. Los procedimientos que utilizan la coloración del anticuerpo para la identificación también se han divulgado10,pero no han sido completamente acertados en nuestras manos. Finalmente, hay muchos modelos de ratón disponibles que expresan proteínas de fusión fluorescentes(es decir, GFP, YFP, RFP) en células de interés, que podrían usarse para identificarlas en secciones de tejido en el microscopio LMD. De hecho, las cepas de ratón que hemos analizado con este protocolo expresan una proteína de fusión entre SOD1 y YFP11,y sus neuronas motoras de la médula espinal son altamente fluorescentes. No pudimos, sin embargo, encontrar un conjunto de lavados de etanol y / o condiciones de deshidratación que eliminarían simultáneamente el O.C.T., inhibirían la actividad de la ARNasa y mantendrían consistentemente suficiente fluorescencia de YFP para permitir la visualización de las neuronas motoras y su recuperación por LMD. Tal vez una nueva proteína fluorescente o una variante de las disponibles que mantiene la fluorescencia en disolventes orgánicos se puede encontrar para superar esta limitación.

En tejidos de mamíferos compuestos por múltiples tipos de células diferentes, el advenimiento de la instrumentación de microdisección de captura láser (LMD) ha brindado la posibilidad de seleccionar un tipo de célula específica para su análisis a nivel de ARN o proteína. En la actualidad, la amplificación y las técnicas de secuenciación de próxima generación permiten el uso de una reserva de ARN total de unos pocos miles de células para obtener un inventario relativamente completo del transcriptoma, incluida la evaluación de los niveles relativos de ARN y la identificación de varias formas empalmadas. Hasta la fecha, los análisis proteómicos de unos pocos miles de células llegarán a través de especies más abundantes. Por ejemplo, hemos identificado <1,000 de las proteínas más abundantes de 3,000-4,000 cuerpos celulares de neuronas motoras (no mostradas), y Zhu y sus compañeros de trabajo han reportado recientemente la identificación de 2,665 proteínas de ~ 15,000 células tumorales1. Sin embargo, con nuevos desarrollos de la espectrometría de masas, es probable que tales análisis se extiendan a una profundidad mucho mayor.
Aquí, presentamos un protocolo específico utilizado para LMD de cuerpos celulares de neuronas motoras de la médula espinal de ratones, seguido de la preparación de ARN. Este protocolo se utilizó en el contexto de la comparación de ARN de neuronas motoras de ratones mutantes transgénicos presintomáticos de superóxido dismutasa (SOD)1 de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) con ARN preparados a partir de una cepa transgénica de tipo salvaje SOD1 por validación de ARN-seq y qRT-PCR2. En particular, las neuronas motoras, en el cuerno anterior de la materia gris en la médula espinal, comprenden <10% de la población celular total, rodeadas por un mar de astrocitos, y como tal, su perfil transcripcional no puede ser fácilmente desconvolucionado de los estudios de toda la cuerda. Un acercamiento de la captura del laser es así ideal para analizar la expresión del ARN en estas células, con la fisiología preservada excising y congelando rápidamente la cuerda que sigue la breve perfusión salina intracardiaca. Los somata de la neurona de motor son grandes y son así fácilmente perceptibles, aquí usando un tinte que tenga afinidad fuerte para las neuronas3. Además, con tal tamaño, estas células proporcionan una cantidad relativamente grande de ARN por célula capturada. El procedimiento utilizado, como se detalla a continuación, podría ajustarse fácilmente para obtener otros tipos de células neuronales, así como potencialmente otros tipos de células, identificados específicamente por técnicas de tinción de tintes o por tinción de anticuerpos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Ketamine</td>
			<td style="width:195px;">Webster Veterinary</td>
			<td style="width:155px;">26637041101</td>
			<td style="width:339px;">Any source approved by the institutional veterinary service</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Dissection tools (scissors, forceps,&#160;etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Any convenient source of high-quality dissection instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryostat&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td style="width:339px;">Other cryostats should be suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">LMD6000 B</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Other LMD systems have not been tested</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase-free PEN-membrane 2 &#956;m slides&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>11505189</td>
			<td style="width:339px;">Other slide types have been tested and do not perform well</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:268px;">RNeasy Micro kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td style="width:339px;">Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Agilent 2100 BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939A</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Azure B Certified&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190520</td>
			<td style="width:339px;">Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">PBS</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>D8537</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source of RNase-free PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB04010-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02128-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase AWAY</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>10328-011</td>
			<td style="width:339px;">Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">2-Methylbutane&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td style="width:339px;">Any source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen&#160;</td>
			<td>311-03-051 &#38; 311-09-051</td>
			<td style="width:339px;">Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer&#39;s products before using</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">O.C.T. Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryomold Intermediate Size</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Lab wipes (Kimwipes)</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>34155</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of rna for transcriptomic analysis from mouse spinal cord motor neuron cell bodies by laser capture microdissection

La preparación de ARN de alta calidad a partir de células de interés es fundamental para el análisis preciso y significativo de las diferencias transcripcionales entre los tipos celulares o entre el mismo tipo de célula en la salud y la enfermedad o después de tratamientos farmacológicos. En la médula espinal, tal preparación de las neuronas motoras, el objetivo de interés en muchas enfermedades neurológicas y neurodegenerativas, se complica por el hecho de que las neuronas motoras representan <10% de la población celular total. La microdisección de captura láser (LMD) se ha desarrollado para abordar este problema. Aquí, se describe un protocolo para recuperar rápidamente, congelar, y la sección de la médula espinal del ratón para evitar el daño del ARN por RNasas endógenas y exógenas, seguido de tinción con Azure B en etanol al 70% para identificar las neuronas motoras mientras se mantiene la ARNasa endógena inhibida. LMD se utiliza entonces para capturar las neuronas teñidas directamente en el almacenador intermediario de la lisis del tiocianato de guanidina, manteniendo integridad del ARN. Se utilizan técnicas estándar para recuperar el ARN total y medir su integridad. Este material se puede entonces utilizar para el análisis rio abajo de las transcripciones por RNA-seq y qRT-PCR.

El protocolo descrito anteriormente y en la Figura 1 debe producir 50 ng o más de ARN total con un RIN de >8.5 de 3,000-4,000 cuerpos celulares de la neurona motora de la médula espinal disecados de las rebanadas de 9-10 20 μm en aproximadamente 20 diapositivas PEN. Debido a que este número de diapositivas representa menos del 10% de un bloque incrustado en O.C.T. de la médula espinal de un ratón, es posible volver al bloque, que se ha almacenado a -80 ° C, y cortar más rebanadas para pasar por otra ronda de preparación de ARN. Si se necesitan mayores cantidades de ARN para un análisis, es mejor hacer solo el número de diapositivas(por ejemplo, 20) a la vez que se pueden procesar a través de la disección y la preparación de ARN en unos pocos días, luego hacer más diapositivas para una segunda ronda y combinar los productos. Asegúrese de revisar primero el RIN de cada preparación para evitar combinar una buena con una mala. Los métodos de ARN-seq son cada vez más sensibles y las nuevas tecnologías de PCR prometen una sensibilidad más alta que las actuales. Por lo tanto, se requerirá menos ARN de menos cuerpos celulares neuronales, lo que permitirá una mayor profundidad de secuenciación y una validación más completa de los aciertos interesantes. Por otro lado, la plena adhesión a las recomendaciones del MIQE para el análisis y validación de qRT-PCR4 puede requerir cantidades mayores para permitir las reacciones de control necesarias para los RNAs de baja abundancia.
La Figura 2 muestra una serie típica de imágenes de una porción de una sección del cuerno ventral de la médula espinal después de la tinción y disección de Azure B. En el panel A, los cuerpos celulares grandes y oscuramente teñidos son neuronas motoras, confirmadas por la tinción de anticuerpos anti-Chat2,y se diferencian fácilmente de las células vecinas más pequeñas. El panel B muestra la misma región con cuerpos celulares individuales delineados con la pluma de luz y numerados por el software del microscopio. Los contornos siguen de cerca los márgenes de los cuerpos celulares, con una pequeña asignación para el ancho de corte del láser. Este espaciamiento tiene que ser determinado para cada ajuste de potencia láser para minimizar la inclusión de material extraño evitando al mismo tiempo la pérdida de citosol de la neurona motora. Los paneles C y D muestran la sección después de que el láser ha cortado y los cuerpos celulares individuales han caído en la tapa de la colección. Observe que el margen de corte no sigue exactamente el contorno de la pluma de luz en el panel C, pero en gran medida permanece fuera de él. Esta irregularidad es evidente en el panel D, al igual que el área oscureceda alrededor de cada corte, que refleja el daño térmico al tejido causado por el láser. Debido a esto, si dos cuerpos celulares están muy cerca el uno del otro, es mejor delinearlos para un solo corte, en lugar de tratar de cortarlos por separado y perder algo de ARN por daño térmico en su región de contacto cercano.
La Figura 3 muestra los resultados típicos de un análisis electroforético de la integridad del ARN de una muestra de ARN preparada a partir de ~4.000 cuerpos celulares de neuronas motoras de ratón recogidos por LMD. El panel superior es el electroferograma producido por 1 μl del ARN total; el recuadro de la derecha es una imagen del gel. En ambos, tenga en cuenta los picos de ARN ribosómico prominentes. El panel inferior es el electroferograma del carril que contiene los estándares de tamaño de ARN. El software de análisis calculó un RIN de 9,8 para esta muestra, con una concentración de 4,9 ng/μl. Un total de 13 μl de esta solución estuvo disponible después del análisis, proporcionando 64 ng de ARN para la validación de qRT-PCR aguas abajo de las cantidades de transcripción. Para un análisis típico de qRT-PCR de transcripciones moderadamente abundantes, 0,15-0,20 ng de ARN total es suficiente para producir una cuantificación precisa2,por lo que la cantidad de ARN disponible a partir de esta preparación es suficiente para validar un número de transcripciones con múltiples conjuntos de cebadores, como se recomienda4. Por supuesto, se pueden utilizar cantidades más grandes de ARN de entrada para permitir la validación de transcripciones raras. Esta cantidad también es más que suficiente para permitir la preparación de bibliotecas y la próxima generación de ARN-seq.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1.jpg"> Figura 1. Descripción de la producción de la rebanada de la médula espinal y del microdissection de la captura del laser de los cuerpos celulares de la neurona de motor de la médula espinal. A)Pasos importantes en la producción y tinción de rodajas. B)Vista caricaturesca de la sección de la médula espinal y la disección láser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2.jpg"> Figura 2. Antes-y-después de imágenes de una disección del laser del azur B manchó cuerpos de la célula de la neurona de motor. A)Una porción del cuerno ventral de una sección manchada. Tenga en cuenta las cuatro células grandes, teñidas de oscuro. También hay algunas células ligeramente teñidas y algo más pequeñas, que no son neuronas motoras (confirmadas por la tinción de anticuerpos anti-Chat; no se muestran, pero ver Bandyopadhyay2) y que no serán seleccionadas para la disección. Las muchas manchas pequeñas y oscuras son probablemente procesos neuronales (dendritas y axones), pero esto no se ha confirmado. B)Los cuatro cuerpos celulares delineados con la pluma de luz. Tenga en cuenta que los contornos siguen de cerca los márgenes de las celdas, con una distancia mínima entre ellos. Este espaciamiento debe establecerse empíricamente para cada microscopio y láser. El software numera las neuronas individuales, lo que simplifica el seguimiento de cuántas se han recopilado. C y D) Después de que el láser ha cortado y las piezas que contienen los cuerpos celulares han caído en la tapa de la colección. Tenga en cuenta que el agujero dejado atrás es algo más grande que el contorno y es irregular. Esto refleja el ancho del rayo láser y su eficiencia de corte ligeramente variable dependiendo de la composición local del tejido. También es evidente el borde del tejido oscurecido que rodea cada agujero debido al daño de calentamiento local causado por el láser. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3.jpg"> Figura 3. Análisis electroforético de la integridad del ARN preparado a partir de muestras de LMD. A)Una alícuota de 1 μl del ARN preparado a partir de ~4.000 cuerpos celulares de neuronas motoras por el protocolo anterior se analizó por electroforesis microcapilar en un chip de microfluídica. Se muestra el electroferograma, con picos de ARN ribosómico prominentes. A la derecha hay una imagen del gel en sí. B)Se muestra el electroferograma de las normas de talla, con el carril de gel correspondiente a la derecha. El software del instrumento calculó un RIN de 9,8 para esta muestra y una concentración de 4,9 ng/μl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una imagen más grande.</a>

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Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

El ARN total de alta calidad se ha preparado a partir de cuerpos celulares de neuronas motoras de la médula espinal de ratón mediante microdisección de captura láser después de manchar secciones de la médula espinal con Azure B en etanol al 70%. Suficiente ARN (~ 40-60 ng) se recupera de 3.000-4.000 neuronas motoras para permitir el análisis de ARN aguas abajo por RNA-seq y qRT-PCR.

Producción De ARN Para El Análisis Transcriptómico De Los Cuerpos Celulares De La Neurona Motora De La Médula Espinal De Ratón Por Microdisección De Captura Láser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K vistas.  Yale School of Medicine. El ARN total de alta calidad se ha preparado a partir de cuerpos celulares de neuronas motoras de la médula espinal de ratón mediante microdisección de captura láser después de manchar secciones de la médula espinal con Azure B en etanol al 70%. Suficiente ARN (~ 40-60 ng) se recupera de 3.000-4.000 neuronas motoras para permitir el análisis de ARN aguas abajo por RNA-seq y qRT-PCR.

Video: Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Láser microdisección de captura de Drosophila Neuronas periféricas

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Investigación

Neurociencias

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Microdisección de captura por láser de neuronas a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas en cultivo

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq Análisis de Expresión diferencial de genes en electroporación de embriones de pollo de la médula espinal

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Microdisección de captura láser Atlas estereotáctico de regiones del cerebro afectadas por la lesión traumática

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Optimización del Microdissection de la captura de láser para el aislamiento de los ganglios entéricos de tejido humano fresco congelado

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Comprensión de las respuestas de las neuronas motoras a la estimulación de la médula espinal

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

Autor destacado: Avance de la estimulación de la médula espinal: exploración de las respuestas celulares de las neuronas motoras a través de la electrofisiología de patch-clamp 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

La preparación ex vivo del corte de la médula espinal para el registro de patch-clamp de células enteras en neuronas motoras durante la estimulación de la médula espinal

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...