Este trabajo fue apoyado en parte por el NIH / NCI Subvenciones Número 1R01CA158372-01 (Qi) y Nueva Estado clave de Drogas Proyecto Subvención Número 009ZX09102-205 (Qi). Asistencia escritura fue proporcionado por el Dr. Judy Racadio, y fue financiado por la Universidad de Cincinnati Departamento de Hematología y Oncología. Vontz Core Imaging Lab (VCIL) en la Facultad de Medicina de la Universidad de Cincinnati.

Declaración ética del uso de animales. Todos los estudios con animales fueron aprobadas por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Universidad de Cincinnati (Número de Protocolo IACUC: 11-05-05-02) y la Fundación de Investigación del Hospital de Niños de Cincinnati (Bienestar Animal Número Aseguramiento A3108-01). Todos los experimentos con ratones siguen las pautas de cuidado de animales de la Universidad de Cincinnati y la Fundación de Investigación del Hospital de Niños de Cincinnati. 1. Preparar Modelos Animales Nota: Tres modelos animales diferentes se describen a continuación se han utilizado en nuestros estudios previos: <ol><li> Ortotópico ratón tumor cerebral: Utilice nu / nu ratones hembra atímicos que han sido intracraneal inyectado con células U87-ΔEGFR-Luc humanos. Estos ratones desarrollan un tumor agresivo que muestra las características típicas de glioblastoma humano. </li><li> Modelos de ratones genéticamente modificados tumor cerebral 13: Breed Mut3 (GFA-cre; Nf1loxP / +; Trp53-/ +) ratones machos con Trp53loxP/loxP; Hembras PtenloxP / loxP para generar ratones mut6 (GFAP-cre; Nf1loxP / +; Trp53-/loxP; PtenloxP / +). Mantener los ratones MUT3 en B6CBAF1 / J cepa criando ratones machos MUT3 con B6CBAF1 hembra / J ratones. Genotipo los ratones entre P9 y P12 y confirmar los genotipos después de cosechar sus tejidos. </li><li> K / BxN artritis: ratones Uso C57Bl/6J que han sido administrados por vía intraperitoneal con 150 l sueros de KRN x NOD ratones F1. Estos ratones desarrollan artritis de 24 a 48 horas después de la inyección sueros. Imágenes de los ratones artríticos se lleva a cabo en el día 7 después de la administración de sueros, un punto de tiempo en el que ratones muestran artritis macroscópica manifiesta. Los ratones deben ser evaluadas según los criterios descritos en el siguiente paso. <ol><li> Evaluación de los ratones para la artritis macroscópica utilizando un índice sistema de puntuación macroscópica artrítica de la siguiente manera: 0 = sin artritis detectable, 1 = hinchazón y / o enrojecimiento de la pata o un dígito, 2 = dos articulaciones involucradas, 3 = tres articulaciones INVOLVed, y 4 = artritis severa de toda la pata y dígitos. El sistema de puntuación artrítica se utiliza para determinar el número de articulaciones afectadas y la gravedad de la artritis en las patas de ratones. Incluso los ratones con la puntuación más alta posible artritis rara vez muestran signos de inmovilidad. Sin embargo, la artritis es 3x/semana supervisado y ratones en dolor excesivo (como la inmovilidad severa de las patas hinchadas que inhibe la alimentación y el consumo de agua) son sacrificados. </li><li> Nota: los fluidos inyectados IV en la vena de la cola de ratón han esterilidad mantenido durante todo el experimento. Jeringas limpias, estériles, desechables y viales se utilizan para la preparación y administración de la solución de estudio. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de marcado con fluorescencia SAPC-DOPS nanovesículas <ol><li> SAPC producción de proteínas: proteína recombinante SAPC con exacta secuencia SAPC humana fue producida en E. células de E. coli como se describió previamente con modificaciones 4.SAPC se precipitó con etanol seguido de alto rendimiento purificaciones cromatografía líquida. Después de la liofilización, SAPC seco se utiliza y su concentración se determinó por su peso. </li><li> Mezcle proteína SAPC como se describió previamente 7,10,11. Mezcla DOPS (0,18 mg) y CVM (0,03 mg) en un tubo de vidrio y el uso de gas nitrógeno para evaporar disolventes de lípidos. </li><li> Añadir SAPC proteína en polvo (0,32 mg) a la mezcla, suspender la mezcla seca en 1 ml de tampón PBS y se somete a ultrasonidos de baño durante aproximadamente 15 min, como se ha descrito previamente 7,10,11. A continuación, pasar la suspensión a través de una columna de Sephadex G25 (PD-10) para eliminar tinte CVM libre. La excitación y la emisión máxima del producto final, es decir, nanovesículas SAPC-DOPS-CVM, son 653 nm y 677 nm, respectivamente. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Utilice tumor cerebral y modelos de artritis de ratón (descrito anteriormente en el paso 1) para probar el sistema de Maroi. Anestesie ratones para efectuar con 2% de isoflurano. 1-2% de isoflurano es maintaINED para la duración del procedimiento de formación de imágenes. El aire caliente se suministra de forma continua y suavemente a la cámara de formación de imágenes durante la duración de formación de imágenes. Una pequeña gota de ungüento lágrimas artificiales estéril se aplica a cada ojo del ratón con el fin de cubrir y lubricar el ojo. Coloque los ratones en el sistema MARS mediante la colocación de los ratones en una posición supina con su columna vertebral dirigido inicialmente hacia la cámara (Figura 1). Calibrar la película de soporte ° 380 MARS y situar el ratón usando el software de rotación en la pestaña protocolo Bruker MI. Obtener imágenes de línea de base de los ratones antes de la administración SAPC-DOPS-CVM en la manera descrita a continuación. </li><li> Inyectar 200 l de SAPC-DOPS-CVM por vía intravenosa en la vena de la cola del ratón. Administrar a los ratones de control y ratones portadores de tumores cerebrales o artríticas. </li><li> Imagen 24 ratones después de la inyección hr y de nuevo en 7-9 días después de la inyección mediante la adopción de fluorescencia (25 seg de tiempo de exposición) y de rayos X (10 seg tiempo de exposición) imagos en incrementos de 10 ° más de un curso de 380 °, creando un ligero solapamiento para garantizar que no haya lagunas en el conjunto de datos de rotación. Uso de software de Bruker MI, superponer fluorescente en las imágenes de rayos X para la localización anatómica. </li></ol> 4. Análisis de Imágenes <ol><li> Dibujar un ROI rectangular que abarca la anchura del campo de visión (FOV) de la sitio de la enfermedad (tumor y la artritis). El retorno de la inversión debe ser lo suficientemente grande como para mantener la característica de la enfermedad dentro del campo de visión como el animal se mueve en el curso de la rotación de 380 °. Para los ratones con tumores cerebrales (modelos ortotópico y transgénicos), utilice el mismo ROI rectangular en cada modelo de tumor y sus (3) tres ratones de control respectivo para todos los puntos de tiempo (línea de base, 24 h, y 9 días). El posicionamiento de la ROI rectangular para cada ratón se conserva en todos los puntos de tiempo mediante la utilización de puntos de referencia anatómicos en correspondientes imágenes de rayos X de cada animal. El punto de referencia (s) anatómica identificado en el modelo de tumor también se debe utilizar para place ROIs rectangulares idénticas en los respectivos controles de cada modelo. Puntos de referencia anatómicos identificados en las imágenes de rayos X que permiten la colocación de retorno de la inversión consistente incluyen la base del cráneo y la cara posterior del arco cigomático. Ellos se visualizan a la derecha y la izquierda lateral de cráneo en la imagen posterior-anterior (PA). </li><li> Después de la sustracción automática de fondo, determinar la intensidad media de fluorescencia para cada imagen. Convertir las imágenes de fluorescencia de fotones / s / mm 2, utilizando el software de imágenes Bruker MI. Grafica los valores de fluorescencia en función de los ángulos de imagen, y aplicar en forma de barras de error la desviación estándar de los valores de fluorescencia promediados obtenidos de ratones de control que utilizan Excel u otro software de gráficos. </li></ol>

<ol>
	<li>Pizzonia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodality+animal+rotation+imaging+system+(Mars)+for+in+vivo+detection+of+intraperitoneal+tumors.">Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors.</a> Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).</li><li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+depth+of+cellular+imaging+in+the+intact+lung+using+far-red+and+near-infrared+fluorescent+probes.">Increased depth of cellular imaging in the intact lung using far-red and near-infrared fluorescent probes.</a> Int J Biomed Imaging. , (2006).</li><li>Gertner-Dardenne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+saposins+expressed+in+Escherichia+coli.+Evidence+for+binding+and+activation+properties+of+saposins+C+with+acid+beta-glucosidase.">Functional human saposins expressed in Escherichia coli. 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Arch Biochem Biophys. 424, 210-218 (2004).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-selective+targeting+and+cytotoxicity+by+liposomal-coupled+lysosomal+saposin+C+protein.">Cancer-selective targeting and cytotoxicity by liposomal-coupled lysosomal saposin C protein.</a> Clin Cancer Res. 15, 5840-5851 (2009).</li><li>Kaimal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saposin+C+coupled+lipid+nanovesicles+enable+cancer-selective+optical+and+magnetic+resonance+imaging.">Saposin C coupled lipid nanovesicles enable cancer-selective optical and magnetic resonance imaging.</a> Mol Imaging Biol. 13, 886-897 (2011).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4+can+recognize+SapC-DOPS+to+stimulate+macrophages+to+express+several+cytokines.">Toll-like receptor 4 can recognize SapC-DOPS to stimulate macrophages to express several cytokines.</a> Inflamm Res. 60, 153-161 (2011).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saposin+C+coupled+lipid+nanovesicles+specifically+target+arthritic+mouse+joints+for+optical+imaging+of+disease+severity.">Saposin C coupled lipid nanovesicles specifically target arthritic mouse joints for optical imaging of disease severity.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Abu-Baker, S., Chu, Z., Stevens, A. M., Li, J., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+selectivity+in+skin+cancer+by+SapC-DOPS+nanovesicles.">Cytotoxicity and selectivity in skin cancer by SapC-DOPS nanovesicles.</a> Journal of Cancer Therapy. 3, 321-326 (2012).</li><li>Wojton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+SapC-DOPS+has+antiangiogenic+and+antitumor+effects+against+glioblastoma.">Systemic delivery of SapC-DOPS has antiangiogenic and antitumor effects against glioblastoma.</a> Mol Ther. 21, 1517-1525 (2013).</li><li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+haploinsufficiency+accelerates+formation+of+high-grade+astrocytomas.">Pten haploinsufficiency accelerates formation of high-grade astrocytomas.</a> Cancer Res. 68, 3286-3294 (2008).</li></ol>

No hay nada que revelar.

La determinación precisa de la ubicación y la magnitud de los tumores sólidos y focos inflamatorios en enfermedades reumáticas es crítica para poner en práctica un tratamiento adecuado y el seguimiento de la progresión de la enfermedad o la remisión. Mientras valiosas estrategias actuales de imagenología (rayos X, resonancia magnética, ecografía, tomografía computarizada de rayos X) proporcionan evaluaciones incompletas de estado de la enfermedad. Por ejemplo, los daños en las articulaciones artríticas es comúnmente evaluada por los rayos X, que proporciona información sobre la estructura de los huesos, pero no en la inflamación de los tejidos blandos y la destrucción, característico de las primeras etapas de la enfermedad. El método que aquí se presenta Maroi combina las ventajas de ambos rayos X y sofisticadas modalidades de imágenes de tejidos blandos (por ejemplo, resonancia magnética o ecografía) en una plataforma integrada, no invasivo y más simple que también permite un mapeo completo 3D y la reconstrucción del tejido u órgano enfermo en animales pequeños tales como ratones. Este método se aprovecha de la afinidad selectiva Of SAPC-DOPS nanovesículas para los residuos de fosfatidilserina expuestos, que son abundantes en las membranas de cáncer y células inflamatorias. El determinante de esta unión es SAPC, una proteína lisosómica fusogénico con una fuerte afinidad por los fosfolípidos aniónicos, tales como fosfatidilserina 7,10,11. Cuando conjugado con una sonda fluorescente (CVM), inyectada sistémicamente SAPC-DOPS se puede remontar al tumor y sitios artríticas por imágenes de fluorescencia. Las limitaciones de este método están relacionadas con su sensibilidad, que en la actualidad limita su uso a las imágenes de los animales pequeños como ratones. Al igual que con otros métodos de imagen, señal fluorescente óptimo a ruido está limitado por el tamaño del tumor o de la medida de la artritis, y puede verse comprometida cuando formación de imágenes tejidos u órganos con alto fondo (autofluorescencia) tales como los oídos (de imágenes del cerebro), los intestinos / heces (imagenología abdominal) y patas (imágenes de las extremidades posteriores). A este respecto, se encontró que un colorante rojo lejano como CVM Proproporciona una mejor separación espectral y la resolución en el ajuste en vivo que otras sondas fluorescentes en el rango visible. Otros peligros incluyen el potencial movimiento del animal durante la exploración, tanto durante la anestesia y post mortem (rigor mortis). Posicionamiento de la extremidad posterior, en particular, es a menudo difícil de estabilizar para evitar el movimiento durante la rotación. En su estado actual de la técnica es también consume mucho tiempo, con los tiempos de exploración mientras 60 min necesarios para completar una rotación completa y adquirir imágenes de alta calidad. El método de Maroi presenta un número de ventajas sobre otras modalidades de imágenes. La capacidad de la imagen el tejido enfermo de 38 (o más) diferentes ángulos permite la visualización de la fluorescencia que puede ser obstaculizada cuando se evalúa desde un solo plano; Esto es valioso en estudios con animales, ya que puede ayudar a minimizar el número de falsos negativos que resultan de la formación de imágenes en ángulos inapropiados. Por overlde rayos X Ying y las imágenes de fluorescencia, una localización anatómica precisa del sitio enfermo se puede determinar. Por último, la posibilidad de imágenes en vivo (en vivo) permite que se realicen los estudios longitudinales.

De imágenes de animales conjunto se ha convertido en una poderosa herramienta en el estudio de la fisiopatología animal. Entre los sistemas de imágenes actuales, el MS PRO FX permite a los investigadores etiquetados correctamente a visualizar con fluorescencia (o luminiscentes) compuestos y / o tejidos en ratones vivos, y al mismo tiempo obtener imágenes de rayos-X. Con el sistema multimodal recientemente introducido la rotación de los animales (MARS) se logra una rotación completa y automatizada del ratón con el fin de captar tanto fluorescente / luminiscentes y las imágenes de rayos X en ángulos específicos 1. La adquisición de imágenes se puede programar de tal manera que la serie de imágenes secuenciales se puede capturar a, ángulos incrementales específicos tan pequeñas como 1 °. Esto permite una para identificar la orientación óptima del animal, es decir. aquel en el que la distancia entre la señal fluorescente / luminiscente generada internamente y dispositivo de detección del sistema es el más corto. Esto, a su vez, facilita el reposicionamiento preciso del animal para formación de imágenes posterior SEssions durante los estudios longitudinales. En este reporte se describe la implementación de un sistema de multi-ángulo de imagen óptica de rotación (Maroi) para la cuantificación in vivo de la intensidad marcador fluorescente. Análisis de la curva de la señal de Maroi se puede utilizar en estudios longitudinales para la correlación directa de la distribución de la señal fluorescente para mapear con precisión los sitios enfermos o procesos biológicos de interés. Este sistema se utiliza para controlar la absorción de la etiqueta fluorescente nanovesículas SAPC-DOPS por tumores ortotópico y espontáneas, así como por focos artrítica, en ratones vivos; proporcionó conjuntos de datos multiespectrales y multimodales derivados de cobertura de rotación completa de los animales. Entre las numerosas sondas fluorescentes disponibles para imágenes in vivo, las que emiten en las regiones espectrales del infrarrojo cercano y rojo lejano confieren la menor interferencia con la piel y los tejidos, y proporcionar los más altos de penetración e imagen reslución. Utilizamos CellVue Granate (CVM) 2,3, un enlazador de células fluorescentes rojo lejano (Ex 647/Em 667), para etiquetar SAPC-DOPS (SAPC-DOPS-CVM) 4-12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1246">
	<colgroup>
		<col /> 
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td style="width:423px;">Gibco (Grand Island, NY)</td>
			<td style="width:307px;">11965</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:423px;">Gibco (Grand Island, NY)</td>
			<td style="width:307px;">16000077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:423px;">Hyclone (Logan, Utah)</td>
			<td style="width:307px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Dioleoylphosphatidylserine</td>
			<td style="width:423px;">Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)</td>
			<td style="width:307px;">840035C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CellVue Maroon</td>
			<td style="width:423px;">Molecular Targeting Technologies, Inc. (Exton, PA)</td>
			<td style="width:307px;">C-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sephadex G25 column PD-10</td>
			<td style="width:423px;">Amersham Pharmacia Biotech, (Piscataway, NJ)</td>
			<td style="width:307px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:351px;">New Standard Stereotaxic for Rats and Mice</td>
			<td style="width:423px;">Harvard Apparatus (Holliston, MA)</td>
			<td style="width:307px;">726335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Bransonic Ultrasonic Cleaners Model 1510</td>
			<td style="width:423px;">Branson Ultrasonics (Danbury,CT)</td>
			<td style="width:307px;">CPN-952-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Multi-spectral FX system</td>
			<td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td>
			<td style="width:307px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-angle Rotational Optical Imaging Device</td>
			<td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td>
			<td style="width:307px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optical imaging of brain tumors and arthritis using fluorescent sapc-dops nanovesicles

Se describe un multi-ángulo de rotación del sistema de formación de imágenes ópticas (Maroi) para el seguimiento in vivo de procesos fisiopatológicos marcados con un marcador fluorescente. Se utilizaron modelos de ratón (tumores cerebrales y artritis) para evaluar la utilidad de este método. Saposina C (SAPC)-dioleoilfosfatidilserina (DOPS) nanovesículas etiquetados con CellVue Granate (CVM) fluoróforo se administraron por vía intravenosa. Los animales se colocaron a continuación en el soporte de rotación (MARS) del sistema de imágenes in vivo en. Las imágenes fueron adquiridas en pasos de 10 º sobre 380 °. Una región rectangular de interés (ROI) se coloca a través de la anchura de la imagen completa en el sitio de la enfermedad modelo. En el retorno de la inversión, y por cada imagen, la intensidad media de fluorescencia se calculó después de la sustracción del fondo. En los modelos de ratones estudiados, los nanovesículas marcadas se recogieron en ambos los tumores cerebrales ortotópico y transgénicos, y en los sitios artríticos (dedos de los pies y los tobillos). El análisis de la curva del ángulo de varios image ROI determina el ángulo con la señal más alta. Por lo tanto, se caracterizó el ángulo óptimo para obtener imágenes de cada sitio de la enfermedad. El método de Maroi aplicado a las imágenes de los compuestos fluorescentes es una herramienta no invasiva, económico, y precisa in vivo para el análisis cuantitativo de los estados de enfermedad en los modelos de ratón descritos.

Se demuestra aquí que nanovesículas SAPC-DOPS marcado con un colorante rojo lejano (CVM) se acumulan específicamente en los tumores de cerebro de ratón ortotópico y espontáneas, así como en las articulaciones artríticas de los ratones K / BxN. Imágenes / fluorescencia de rayos X de serie adquiridos a partir de un retorno de la inversión se coloca sobre cada sitio de la enfermedad durante las rotaciones completas de los ratones se sometieron a análisis de la curva de Maroi, que reveló el ángulo de proyección de imagen óptima con la mayor intensidad de la fluorescencia. El propósito principal para usar el sistema MARS es para determinar el ángulo óptimo de la fluorescencia de modo que las mediciones más precisas se pueden tomar. Se muestran resultados representativos de tres experimentos con ratones con tumores cerebrales o la artritis. Uso de SAPC-DOPS-CVM y el sistema MARS (Figura 1), el mejor ángulo de imagen posible para observar el tumor o inflamación debido a la artritis se determinó. Las imágenes de fluorescencia, seguido de una adquisición de rayos X, se adquirieron cada 10 °durante una rotación de 380 º del ratón. Imágenes de fluorescencia se superpone a las imágenes de rayos X correspondientes para visualización de imágenes y la generación de película de rotación. Los resultados del modelo ortotópico tumor cerebral se demuestra en la Figura 2. La imagen de fluorescencia de un ortotópico de ratón portador de tumor representante (Ortho1) se muestra en la Figura 2A. El ángulo de imagen óptima para este animal es 10 °, la posición en la que la intensidad de fotones de fluorescencia es la más grande (Figura 2B). Las mediciones se realizaron antes de la inyección con SAPC-DOPS-CVM (línea de base) y 24 horas después de la inyección. Los ratones de control (sin tumor) recibieron un tratamiento similar. La Figura 3 muestra los datos comparables del modelo de ratón tumor cerebral mediante ingeniería genética. Las imágenes de fluorescencia y mediciones de fotones se tomaron antes de la inyección con SAPC-DOPS-CVM (línea de base) y 24 h (Figuras 3A y &lt;strong&gt; 3B) y 9 días (Figura 3C) después de la inyección. Estos gráficos muestran que el ángulo de imagen óptima en el animal con tumor (Tumor Mut49) es de 20 ° 24 h después de la inyección, pero los cambios en 10 de inyección ° 9 días después. Esto sugiere que la alteración de la señal de fluorescencia se correlacionó con cambios morfológicos, probablemente reflejando el crecimiento del tumor. Como se muestra en la Tabla 1, el método de Maroi demuestra claramente que la señal fluorescente disminuye para las proyecciones en el aumento de la rotación de distancia desde el ángulo de formación de imágenes óptima. En los tumores cerebrales, se obtuvo una disminución promedio de 7% en la señal fluorescente si la orientación física del animal fue de ± 10 desplazamiento desde el ángulo de proyección de imagen óptima °. Una disminución promedio del 21% en la señal fluorescente se midió a ± 20 °. Por lo tanto relativamente pequeños desplazamientos desde el ángulo óptimo puede dar lugar a la atenuación de la señal significativa. Utilizando la técnica de Maroi de posicionamiento de imagen permitirá investigators para producir datos más consistentes y fiables. El método de Maroi finalmente se utiliza para evaluar la focalización de las articulaciones artríticas por SAPC-DOPS-CVM 24 horas después de la inyección SAPC-DOPS-CVM. Este animal anotó 3 con tres articulaciones artríticas. Las imágenes de fluorescencia de dedo del pie y el tobillo del ratón artrítico se muestran en las Figuras 4A y 4B. Mediciones de fotones correspondientes de los intervalos de rotación de 10 ° se representan gráficamente en las figuras 4C y 4D. Los ángulos de imagen óptimos encontrados para el dedo del pie y el tobillo son 140 ° y 120 °, respectivamente. En resumen, la combinación del sistema de Maroi con fluorescentes nanovesículas SAPC-DOPS representa una estrategia no invasiva, precisa y altamente sensible para la formación de imágenes en vivo, lo que permite estudios cuantitativos de tumor y la progresión de la artritis en animales pequeños. La posibilidad de adquirir un conjunto de datos de imagen multimodal ° 360 improvisación considerablementeanálisis de los datos es Contacto e interpretación, en comparación con lo que se puede lograr mediante técnicas de imagen de ángulo individuales. <img alt="Tabla 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187table1.jpg" width="600px" /> Tabla 1. Ángulos de imagen óptima para cada modelo de ratón. Las diferencias entre el ángulo de la fluorescencia máxima de fotones (FLR ángulo óptimo) y el ángulo anatómica estándar (rayos X) se pueden ver. Cuando estos dos ángulos se vuelven cada vez más diferente, la señal medida cambia significativamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1.jpg" width="600px"/&gt; Figura 1. Multi-ángulo de rotación del dispositivo de imagen óptica (Maroi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Fluorescencia señal en función del ángulo de imagen en un modelo de ratón ortotópico tumor cerebral. (A). Imagen de la cresta de la señal fluorescente en el ángulo de imagen óptima de 10 °. La caja azul muestra el retorno de la inversión utilizada para cuantificar los fotones emitidos. (B). Gráfico del ángulo de imagen en comparación con la emisión de fotones. El ortotópico ratón portador de tumor representativo (Ortho1) se grafica contra los valores de fluorescencia promediados desde ROIs idénticos en tres ratones no tumoral. Las mediciones se realizaron al inicio del estudio (antes de la inyección) y post 24 hr injection. Las barras de error representan la desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3. Señal de fluorescencia en función del ángulo de imagen en un tumor cerebral espontánea de un modelo de ratón genéticamente modificado. (A). Imagen de la señal fluorescente pico del retorno de la inversión 1 (caja y tapa azul) con el ángulo de imagen óptima de 20 °. (B) y (C). Gráficos de el ángulo de la imagen frente a la emisión de fotones de retorno de la inversión 1. Valores de un representante cerebral espontánea ratón portador de tumor, tumor-Mut 49, se grafican contra los valores promediados de tres ratones no tumorales. Las mediciones se tomaron al inicio del estudio (antes de la inyección) y la inyección de 24 horas (B) y 9 días (C) mensaje. Error b<html> ars representan la desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Fluorescencia señal en función del ángulo de imagen en un ratón con artritis en el dedo del pie y tobillos. (A) y (B). Imágenes que muestran el pico de la señal fluorescente para los dedos del pie (A) y las articulaciones del tobillo (B), dentro de las regiones de interés se muestran en el cuadro rojo. (C). Gráfica de ángulo frente significan emisión de fotones para el dedo del pie. Emisión de fotón pico se puede ver en un ángulo de 140 ° (D) Gráfico de ángulo frente significa la emisión de fotones para el tobillo..; intensidad máxima se produce en un ángulo de 120 °.target = &quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

Se describe un multi-ángulo de rotación del sistema de formación de imágenes ópticas (Maroi) para la cuantificación in vivo de un marcador fluorescente emitido por saposina C (SAPC)-dioleilfosfatidil serina (DOPS) nanovesículas. El empleo de modelos de ratón de cáncer y la artritis, demostramos cómo el análisis de la curva de la señal de Maroi se puede utilizar para la cartografía precisa y caracterización biológica de los procesos de enfermedad.

En vivo de imágenes óptico de tumores del cerebro y la artritis Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

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Research

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Medicine

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

11.2K vistas.  University of Cincinnati College of Medicine.  Se describe un multi-ángulo de rotación del sistema de formación de imágenes ópticas (Maroi) para la cuantificación in vivo de un marcador fluorescente emitido por saposina C (SAPC)-dioleilfosfatidil serina (DOPS) nanovesículas. El empleo de modelos de ratón de cáncer y la artritis, demostramos cómo el análisis de la curva de la señal de Maroi se puede utilizar para la cartografía precisa y caracterización biológica de los procesos de enfermedad. ...

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Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

La medición precisa y simple de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β mediante un análisis de sangre entera estimulación

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Investigación

Medicina

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Probing the Brain in Autism Using fMRI and Diffusion Tensor Imaging

Newly emerging theories suggest that the brain does not function as a cohesive unit in autism, and this discordance is reflected in the behavioral symptoms displayed by individuals with autism. While structural neuroimaging findings have provided some insights into brain abnormalities in autism, the consistency of such findings is questionable. Functional neuroimaging, on the other hand, has been more fruitful in this regard because autism is a disorder of dynamic processing and allows examination of communication between cortical networks, which appears to be where the underlying problem occurs in autism. Functional connectivity is defined as the temporal correlation of spatially separate neurological events1. Findings from a number of recent fMRI studies have supported the idea that there is weaker coordination between different parts of the brain that should be working together to accomplish complex social or language problems2,3,4,5,6. One of the mysteries of autism is the coexistence of deficits in several domains along with relatively intact, sometimes enhanced, abilities. Such complex manifestation of autism calls for a global and comprehensive examination of the disorder at the neural level. A compelling recent account of the brain functioning in autism, the cortical underconnectivity theory,2,7 provides an integrating framework for the neurobiological bases of autism. The cortical underconnectivity theory of autism suggests that any language, social, or psychological function that is dependent on the integration of multiple brain regions is susceptible to disruption as the processing demand increases. In autism, the underfunctioning of integrative circuitry in the brain may cause widespread underconnectivity. In other words, people with autism may interpret information in a piecemeal fashion at the expense of the whole. Since cortical underconnectivity among brain regions, especially the frontal cortex and more posterior areas 3,6, has now been relatively well established, we can begin to further understand brain connectivity as a critical component of autism symptomatology.
A logical next step in this direction is to examine the anatomical connections that may mediate the functional connections mentioned above. Diffusion Tensor Imaging (DTI) is a relatively novel neuroimaging technique that helps probe the diffusion of water in the brain to infer the integrity of white matter fibers. In this technique, water diffusion in the brain is examined in several directions using diffusion gradients. While functional connectivity provides information about the synchronization of brain activation across different brain areas during a task or during rest, DTI helps in understanding the underlying axonal organization which may facilitate the cross-talk among brain areas. This paper will describe these techniques as valuable tools in understanding the brain in autism and the challenges involved in this line of research.

Neuroimaging techniques, such as functional MRI and Diffusion Tensor Imaging have become increasingly useful in characterizing the cognitive and neural deficits in autism. An examination of brain connectivity in autism at a network level along with adaptations for scanning children with developmental disabilities is presented.

Sondas en el cerebro en el autismo y el uso de resonancia magnética funcional de imágenes por tensor de difusión

Newly emerging theories suggest that the brain does not function as a cohesive unit in autism, and this discordance is reflected in the behavioral ...

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

No invasiva de medición óptica del metabolismo cerebral en lactantes y Hemodinámica

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

In vivo Macrophage Imaging Using MR Targeted Contrast Agent for Longitudinal Evaluation of Septic Arthritis

Macrophages are key-cells in the initiation, the development and the regulation of the inflammatory response to bacterial infection. Macrophages are intensively and increasingly recruited in septic joints from the early phases of infection and the infiltration is supposed to regress once efficient removal of the pathogens is obtained. The ability to identify in vivo macrophage activity in an infected joint can therefore provide two main applications: early detection of acute synovitis and monitoring of therapy.
In vivo noninvasive detection of macrophages can be performed with magnetic resonance imaging using iron nanoparticles such as ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO). After intravascular or intraarticular administration, USPIO are specifically phagocytized by activated macrophages, and, due to their magnetic properties, induce signal changes in tissues presenting macrophage infiltration. A quantitative evaluation of the infiltrate is feasible, as the area with signal loss (number of dark pixels) observed on gradient echo MR images after particles injection is correlated with the amount of iron within the tissue and therefore reflects the number of USPIO-loaded cells.
We present here a protocol to perform macrophage imaging using USPIO-enhanced MR imaging in an animal model of septic arthritis, allowing an initial and longitudinal in vivo noninvasive evaluation of macrophages infiltration and an assessment of therapy action.

In vivo Macrophage Imaging Using MR Targeted Contrast Agent for Longitudinal Evaluation of Septic Arthritis

We demonstrate how to perform macrophage MR imaging using ultrasmall superparamagnetic contrast agent (USPIO) in septic arthritis, allowing an initial and longitudinal in vivo non-invasive evaluation of macrophages infiltration and an assessment of therapy efficacy.

En vivo los macrófagos de imágenes utilizando MR Agente de contraste dirigida para la Evaluación Longitudinal de Artritis séptica

Macrophages are key-cells in the initiation, the development and the regulation of the inflammatory response to bacterial infection. Macrophages are ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &amp;#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

Combinado<em&gt; En vivo</em&gt; Óptica y μCT imágenes para vigilar la infección, inflamación y Hueso anatomía en una infección de implantes ortopédicos en ratones

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Crear anatómicamente exactos y reproducibles intracraneal xenoinjertos de tumores cerebrales humanos

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rosa de Bengala Photothrombosis por imagen óptica confocal<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un modelo de solo recipiente Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

El agotamiento de las células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos mejora significativamente análisis de aguas abajo de las células diana

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

En Vivo Proyección de imagen de ratones de reportero Cx3cr1gfp/gfp con tomografía de coherencia óptica de dominio espectral y exploración oftalmoscopia de láser

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...