Este estudio fue apoyado por CCSRI # 700537 Grant y CIHR subvención n º 84535 de JDL y los NIH / NCI subvención # CA120711-01A1-01A1 y CA120711 a AZ. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con los reglamentos y directrices del animal de Atención Institucional y el empleo Comisión de la Universidad de California en San Diego, Cuidado de Animales y Uso de la Universidad de Western Ontario.

1. La inoculación del tumor en CAM de embriones aviar <ol><li> Prepare caparazón fecundado embriones de pollo como se describe 8. </li><li> El día 9 del desarrollo embrionario, montar una micro-inyección con una aguja de calibre 18 conectada a una jeringa de 1 ml. Corte un pedazo de 5.6 pulgadas de tubo Tygon (1 / 32 &quot;de diámetro interior de 3 / 32&quot; de diámetro exterior, 1 / 32 &quot;espesor de pared) e inserte con cuidado el bisel de la aguja en el tubo. Aproximadamente 5.4 pulgadas de la tubería debe se extienden desde la punta de la aguja (Figura 1a). </li><li> Llene la jeringa y el tubo con la suspensión celular. A continuación, insertar una aguja de vidrio microinyección en el extremo del tubo y retirar con cuidado las burbujas de aire. </li><li> Día 9 inyectar embriones (Figura 1b) con un alcance de disección con un iluminador con 10.000-100.000 células cancerosas como un bolo dentro de la CAM (Figura 1c). Inyecte lentamente y con cuidado las células asegurar que la aguja está en el lugar correcto para que las células para formar un bolo visible dentro de la CAM. Las células que caiga agua sobre la superficie de la CAM se pueden limpiar con aplicador Kimwipe u otros. </li><li> Volver a los embriones humidificado incubadora a 38 ° C a 60% de humedad y permitir que el tumor crezca y vascularizan (hasta 7 días). </li></ol> 2. Preparación de nanopartículas <ol><li> Para preparar la etiqueta fluorescente nanopartículas CPMV para la inyección en el embrión de pollo, diluir las nanopartículas viral (sintetizado como en 8 en PBS, pH 7,4, a una concentración de la mezcla de Vortex 100 ug / ml antes de usar y centrifugar durante un minuto para eliminar cualquier. agregados. sonicación también puede ser útil en función de los conjugados y el grado de agregación. Las existencias de CPMVs marcados con fluorescencia son estables durante al menos 1 año cuando se almacenan a 4 ° C en la oscuridad. Revise periódicamente las existencias por poner un par de gotas en un portaobjetos de vidrio y la comprobación de la fluorescencia. Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) también se puede utilizar para determinar si las partículas se mantuvo intacta después de la conjugación. </li><li> En pocas palabras, un microgramo de nanopartículas viral (en un volumen final de 2 l) se pueden agregar a las redes de cobre recubierto. A continuación, agregue un volumen igual de acetato de uranilo al 2% durante 1 minuto a microscopio electrónico (Philips EM 410). </li></ol> 3. La inyección intravenosa de fluorescencia marcado con nanopartículas viral <ol><li> El día 16, ensamblar micro-inyector como se describió anteriormente. Elaborar volumen deseado de nanopartículas viral a través de la tubería en la jeringa (&gt; 200 l). Retire con cuidado las burbujas de aire. Inserte la aguja de microinyección de vidrio en el extremo de la tubería. Asegúrese de que la aguja es tan larga y afilada como sea posible (Figura 2a). Si la aguja es demasiado contundente, que no será capaz de penetrar a través del ectodermo y no podrá penetrar en el buque. Si la aguja es demasiado fuerte, la punta se derrumbará al penetrar los tejidos. </li><li> Por vía intravenosa se inyectan 100 l de una dextrano mg / ml de fluoresceína (MW 70.000 Da, Invitrogen) en embriones portadores de tumores distales del sitio que se desea visualizar (Figura 3d). La canalización de la vena CAM éxito es evidente por la limpieza de sangre en el camino de la inyección en flujo (Figura 2b). Evaluar vascular fuga una hora después de la inyección. </li><li> Por vía intravenosa inyectar 50 l de 1 mg / ml de solución de CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV AF-647) o pegilado CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) en embriones que contienen los tumores con fuga vascular distal desde el sitio deseado ser visualizado. </li><li> Tumores de la imagen de inmediato y cada hora después de la inyección con un Zeiss examinador Z1 microscopio vertical equipado con un disco giratorio Yokogawa, Hamamatsu Imagen 9100-12 EM-CCD de la cámara. </li></ol> 4. En tiempo real intravital de imágenes <ol><li> Para montar la unidad de imagen embrión, aplique una fina capa de grasa de vacío alrededor de la circunferencia de la imagen del puerto en la parte inferior de la tapa de la unidad de imagen de embriones, y monte un cubreobjetos de 18 mm de vidrio en el puerto. </li><li> La posición del embrión de tal manera que el cubreobjetos se cubra el área deseada para la imagen. Baje lentamente la tapa hasta que el cubre sólo se pone en contacto con el embrión, y luego el tornillo de la tapa sobre la unidad para mantenerla en su lugar (figura 2c). </li><li> Agregar agua caliente a 37 ° C en la unidad de imagen embrión fuera de la cápsula que contiene el embrión, y luego poner el equipo completo en el escenario de un microscopio confocal en posición vertical con la cámara en el interior del medio ambiente equilibrado a 37 ° C. </li><li> La posición de la unidad de imagen que contiene el embrión con el microscopio de fluorescencia confocal de disco giratorio (Figura 2e). La unidad de imagen tendrá el embrión en su lugar y mantener el campo de vista fijo, mientras que la captura de imágenes, teniendo en cuenta tanto en tres dimensiones pilas Z y las imágenes con lapso de tiempo para ser capturado. Nos adquirir y analizar en tres dimensiones del tiempo-lapso imágenes utilizando Perkin Elmer (antes Improvisación) paquete de software Volocity (Figura 3a). Adquirir una alta resolución en tres dimensiones de la pila de tumor y los vasos sanguíneos circundantes para visualizar detailed análisis estructurales en determinados puntos de tiempo. Adquirir en tres dimensiones las pilas a intervalos regulares de tiempo a los puntos de mapa detallado los cambios estructurales en la vasculatura tumoral. Imágenes de tumores cada hora después de la inyección. </li><li> Cuantificar la absorción de las nanopartículas viral mediante el cálculo de la media Alexa Fluor (AF) 647 de la señal dentro de las regiones seleccionadas en el tumor o en el estroma (tejido no tumoral del área) utilizando software de cuantificación de imágenes como Volocity (Perkin Elmer). El tumor de estroma relación se calcula dividiendo la media de la señal AF 647 en el tumor durante la media de la señal de AF 647 en el estroma. Una relación tumor / estroma superior a 1 indica que las nanopartículas se está tomando por el tumor. </li></ol> 5. Los resultados representativos: En el ejemplo descrito aquí, se inyectó células HT-29 de cáncer de colon para formar un bolo de aproximadamente 1 mm de tamaño dentro de la CAM de embriones de pollo 9 días (Figura 1b). Después de la inoculación, los embriones se cultivaron durante 7 días en un incubador humidificado para permitir el crecimiento del tumor y la vascularización suficiente (Figura 1c). Los embriones fueron inyectados por vía intravenosa con un dextrano de bajo peso molecular para confirmar la vascularización del tumor, y los tumores se visualizaron con un microscopio Zeiss AxioExaminer Z1 en posición vertical (Figura 2d). Tras la administración intravenosa de CPMV AF-647 o CPMV-PEG-AF nanopartículas 647 (Figura 3a yb), de alta resolución en tiempo real microscopía confocal (Figura 2e) reveló que los dos CPMV y PEG-CPMV nanopartículas rápidamente la etiqueta de la vasculatura todo, pero la captación de CPMV-PEG por el tumor fue de aproximadamente 3 veces mayor que CPMV después de 12 horas (Figura 3a). La captación del tumor en relación de las nanopartículas se determinó utilizando el software de análisis de imagen (Volocity de Perkin Elmer). Las regiones de interés fueron seleccionados dentro y fuera del tumor (en el compartimiento del estroma) y la media de intensidad de fluorescencia de cada determinó. Los datos se expresan como la relación tumor / estroma. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Microinyección de los tumores en la CAM de un embrión aviar. (A) El aparato de microinyección se ensambla a partir de los componentes como se indica. (B) embriones de aves en el día 9 están listos para ser inoculados con el tumor cuando la CAM se ha extendido para cubrir toda la superficie. (C) En el día 16, el tumor ha crecido a un máximo de 1 cm de diámetro (línea discontinua) y está listo para la inyección de nanopartículas. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Inyección de nanopartículas y de imagen intravital. Inyección debajo de un microscopio de disección que muestran (a) la punta de la aguja microinyector lista para ser inyectada en la vena CAM y (b) la aguja microinyector inserta en la vena (indicado por la flecha) y nanopartículas inyectadas en el flujo de sangre (se observa en la limpieza de de la sangre). (C) Unidad de imagen que contiene embrión aviar con el cubreobjetos interconectados directamente con la CAM. (D) Antes de la inyección de nanopartículas, la vascularización del tumor se evaluó a través de imágenes intravital después de la inyección de fluoresceína dextrano. (E) Unidad de imagen que contiene el embrión situado en la platina de un microscopio confocal en posición vertical dentro de una temperatura regulada conjunto recinto a 37 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Intravital visualización de la absorción de nanopartículas en los tumores humanos. Los tumores se visualizan siete horas después de la inyección de (a) CPMV-AF647 y (b) CPMV-PEG-AF647. d) Escisión de tumor de embrión aviar para su posterior análisis.

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La membrana corioalantoidea (CAM) del embrión aviar es un modelo útil para evaluar la dinámica vascular y la farmacocinética de los tumores humanos. La estructura y la posición de la CAM permite la adquisición de imágenes de alta calidad y capacidad de muchos tipos de xenoinjertos de cáncer, sin procedimientos quirúrgicos invasivos. Por otra parte, xenoinjertos de cáncer de tumor implantado en la membrana corioalantoidea ser vascularizado dentro de 7 días, que ofrece un medio rápido, barato y semi-alto rendimiento-para evaluar la acumulación de nanopartículas en el tejido tumoral. Desde xenoinjertos de cáncer de implantado en el CAM de embriones de pollo sin caparazón se puede acceder a la óptica de alta resolución de un microscopio de epifluorescencia vertical o confocal, la información contextual y temporal en relación con la absorción de nanopartículas en los vasos sanguíneos del tumor se pueden obtener fácilmente. Xenoinjertos de cáncer en este modelo tienden a crecer lateralmente a través de la CAM, dando lugar a tumores que son grandes sin dejar de ser menos de 200 m de profundidad. Esto los hace especialmente adecuado para la imagen intravital porque estándar de los microscopios de epifluorescencia efectivamente puede penetrar en la masa tumoral completa. Por el contrario, los tumores implantados en cualquiera de los sitios superficiales o ortotópico en el ratón proliferan en tres dimensiones, lo que hace difícil localizar con precisión las nanopartículas en lo profundo de estos tumores por técnicas no invasivas. Hemos utilizado este modelo para evaluar la absorción de los puntos cuánticos, liposomas, nanopartículas de óxido de hierro y en una serie de xenoinjertos de tumores humanos, destacando el potencial de este modelo es adecuado para el análisis in vivo de una amplia gama de formulaciones de nanopartículas.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo Nombre / Equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Fecundado los huevos Leghorn </td><td> Criadero de Frey `s, St. Jacobs </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Herramienta rotativa Dremel </td><td> Dremel </td><td></td><td> Se puede usar cualquier modelo </td></tr><tr><td> Dremel ruedas de corte no. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Deportista nacedora </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td></td></tr><tr><td> Deportista incubadora </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td></td><td></td><td> 70% (vol / vol) </td></tr><tr><td> Poliestireno pesan barcos </td><td> VWR </td><td> 12577-01 </td><td></td></tr><tr><td> Plaza de Petri </td><td> Simport, VWR </td><td> 25378-115 </td><td></td></tr><tr><td> Rubbermaid un recipiente con tapa de goma </td><td> Guillevin </td><td> RH3-228-00-BLU </td><td> agujeros perforados en los lados </td></tr><tr><td> Vertical tirador de la pipeta </td><td> David Kopf Instruments </td><td> modelo 720 </td><td> Ajustes: 16,3 (calefacción) y 2.3 (solenoide) </td></tr><tr><td> Borosilicato de sodio tubos capilares </td><td> Sutter Instrumento </td><td> BF100-58-10 </td><td> (OD, 1,0 mm; ID 0,58 mm, 10 cm de longitud) </td></tr><tr><td> 1X Dulbecco Eagle modificado (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> De buffer fosfato salino (D-PBS) (1X), líquido </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tripsina, 0,05% (1X) con EDTA 4NA, líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 12483-020 </td><td> El calor inactiva </td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> Hausser Científico, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífugo </td><td> Eppendorf modelo 5810R </td><td> 5811 000.010 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas de punta fina </td><td> VWR </td><td> 25607-856 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon R-3603 tubos </td><td> VWR </td><td> 63009-983 </td><td> (50 pies de diámetro 1/32-inch interior, diámetro exterior 3/32-inch, espesor de la pared 1/32-inch </td></tr><tr><td> Agujas hipodérmicas para las inyecciones de calibre 18 agujas </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td> Caja de 100 </td></tr><tr><td> Jeringas de 1 ml para inyección </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> Caja de 100 </td></tr><tr><td> De fibra óptica de microscopio iluminador </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> VWR </td><td> 10805-905 </td><td></td></tr><tr><td> V. unguiculata semillas (California negro de ojos no. 5) </td><td> Burpee </td><td> 51771A </td><td></td></tr><tr><td> Las luces interiores del crecimiento </td><td> SunLite, suministro del jardinero </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metil-éster-NHS PEO4 </td><td> Atravesar </td><td> PI22341 </td><td></td></tr><tr><td> mPEG-NHS, el PEG succinimidil éster, 2000 MW </td><td> NANOCS </td><td> PEG1-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 carboxílico (succinimidil éster) </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 éster de succinimidilo * 6-isómero * </td><td> Invitrogen </td><td> O-6149 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Dibásico monohidrógeno fosfato </td><td> Sigma </td><td> 379980 </td><td> K2HPO4 (para el tampón phopshate) </td></tr><tr><td> Monobásico dihidrogenofosfato </td><td></td><td> P5655 </td><td> KH2PO4 (para el tampón phopshate) </td></tr><tr><td> Superose 6 columna de exclusión por tamaño </td><td> GE Healthcare ciencias de la vida </td><td> 17-0673-01 </td><td></td></tr><tr><td> ÄKTA Explorer 100 cromatógrafo </td><td> GE Amersham Pharmacia </td><td> WS-AKTA100 </td><td></td></tr><tr><td> ÄKTA kit de alto flujo </td><td> GE Healthcare ciencias de la vida </td><td> 18-1154-85 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrífuga </td&gt; <td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SW 28 Ti rotor </td><td> Beckman </td><td> 342204 </td><td> Basculantes </td></tr><tr><td> 50.2 Ti rotor </td><td> Beckman </td><td> 337901 </td><td> Ángulo fijo </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 unidades de filtración centrífuga </td><td> Millipore </td><td> UFC910008 </td><td> 100 kDa cortar </td></tr><tr><td> Gradiente de ex </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> dextrano, fluoresceína, 70.000 MW, aniónicos </td><td> Invitrogen </td><td> D1823 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning microscopio de fluorescencia confocal de disco </td><td> Quórum, Yokogawa CSU 10, Yokogawa </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Epifluorescencia amplio campo del microscopio </td><td> Quórum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu Imagen 9100-12 EM-CCD de la cámara </td><td> Quórum; Hamamatsu </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura de la unidad de caja microscopio </td><td> Plásticos de precisión </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Grasa de vacío </td><td> VWR </td><td> 59344-055 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos de vidrio circular no. 1 (18 mm) </td><td> VWR </td><td> 16004-300 </td><td></td></tr><tr><td> Volocity software </td><td> Perkin Elmer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polluelo recinto embrión </td><td></td><td> fabricados a medida </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras delicadas </td><td> VWR </td><td> 25608-203 </td><td></td></tr><tr><td> Formalina </td><td> Bioshop </td><td> FOR201.500 </td><td> Su uso en fumehood </td></tr><tr><td> De corte óptimo </td><td> Fisher, Tissue Tek </td><td> 1437365 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura (OCT) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Moldes de plástico </td><td> Pescador </td><td> 22-038217 </td><td></td></tr><tr><td> VWR VistaVision HistoBond adhesivo Diapositivas </td><td> VWR </td><td> 16004-406 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar oro con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cuchillas desechables de criostato </td><td> Pescador </td><td> 12-634-2 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica CM 3050 S </td><td> 14047033518 </td><td></td></tr></table>

evaluation of nanoparticle uptake in tumors in real time using intravital imaging

Las tecnologías actuales para obtener imágenes de tumores, tales como ultrasonido, resonancia magnética, PET y la TC, no son capaces de producir imágenes de alta resolución para la evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores a nivel microscópico 1,2,3, destacando la utilidad de un modelo de xenoinjerto adecuado en el que llevar a cabo análisis detallados de la absorción. Aquí, nosotros usamos imágenes de alta resolución intravital para evaluar la absorción de nanopartículas en xenoinjertos de tumores humanos en una versión modificada, el modelo de embrión de pollo sin caparazón. El modelo de embrión de pollo es particularmente adecuado para estos análisis in vivo, ya que favorece el crecimiento de tumores humanos, es relativamente barato y no requiere anestesia o cirugía 4,5. Las células tumorales forma totalmente xenoinjertos vascularizados plazo de 7 días cuando se implanta en la membrana corioalantoidea (CAM) 6. Los tumores resultantes se visualizan imágenes no invasivo en tiempo real de alta resolución que puede mantenerse hasta por 72 horas con poco impacto en el host o sistemas de tumor. Las nanopartículas con una amplia gama de tamaños y formulaciones administradas distal al tumor se pueden visualizar y cuantificar, ya que el flujo a través del torrente sanguíneo, extravasación de la vasculatura del tumor con goteras, y se acumulan en el sitio del tumor. Se describe aquí el análisis de las nanopartículas derivadas de virus del mosaico del caupí (CPMV), decorado con el infrarrojo cercano tintes fluorescentes y / o polímeros de polietilenglicol (PEG) 7, 8, 9,10,11. Tras la administración intravenosa, estas nanopartículas virales son rápidamente internalizados por las células endoteliales, lo que resulta en el etiquetado global de la vasculatura, tanto fuera como dentro del tumor 7,12. PEGilación de las nanopartículas viral aumenta su vida media en plasma, extiende su tiempo en la circulación, y en última instancia, aumenta su acumulación en los tumores a través del aumento de la permeabilidad y retención (EPR) Efecto 7, 10,11. La velocidad y el grado de acumulación de nanopartículas en un tumor se mide con el tiempo el uso de software de análisis de imagen. Esta técnica proporciona un método para visualizar y cuantificar tanto la dinámica de las nanopartículas en los tumores humanos.

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Se presenta un nuevo enfoque para cuantificar la localización de las nanopartículas en los vasos sanguíneos de los tumores humanos transplantados con dinámica y en tiempo real de imágenes intravital en un modelo de embrión aviar.

Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

18.1K vistas.  University of Western Ontario. Se presenta un nuevo enfoque para cuantificar la localización de las nanopartículas en los vasos sanguíneos de los tumores humanos transplantados con dinámica y en tiempo real de imágenes intravital en un modelo de embrión aviar.

Video: Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical excision of the tumor with a full lymphadenectomy in the drainage area of the tumor. However, removal of lymph nodes is associated with increased morbidity due to infection, wound breakdown and lymphedema.4,5 As an alternative, the sentinel lymph node procedure (SLN) was developed several decades ago to detect the first draining lymph node from the tumor.6 In case of lymphogenic dissemination, the SLN is the first lymph node that is affected (Figure 1). Hence, if the SLN does not contain metastases, downstream lymph nodes will also be free from tumor metastases and need not to be removed. The SLN procedure is part of the treatment for many tumor types, like breast cancer and melanoma, but also for cancer of the vulva and cervix.7 The current standard methodology for SLN-detection is by peritumoral injection of radiocolloid one day prior to surgery, and a colored dye intraoperatively. Disadvantages of the procedure in cervical and vulvar cancer are multiple injections in the genital area, leading to increased psychological distress for the patient, and the use of radioactive colloid.
Multispectral fluorescence imaging is an emerging imaging modality that can be applied intraoperatively without the need for injection of radiocolloid. For intraoperative fluorescence imaging, two components are needed: a fluorescent agent and a quantitative optical system for intraoperative imaging. As a fluorophore we have used indocyanine green (ICG). ICG has been used for many decades to assess cardiac function, cerebral perfusion and liver perfusion.8 It is an inert drug with a safe pharmaco-biological profile. When excited at around 750 nm, it emits light in the near-infrared spectrum around 800 nm. A custom-made multispectral fluorescence imaging camera system was used.9.
The aim of this video article is to demonstrate the detection of the SLN using intraoperative fluorescence imaging in patients with cervical and vulvar cancer. Fluorescence imaging is used in conjunction with the standard procedure, consisting of radiocolloid and a blue dye. In the future, intraoperative fluorescence imaging might replace the current method and is also easily transferable to other indications like breast cancer and melanoma.

Fluorescence imaging is a promising innovative modality for image-guided surgery in surgical oncology. In this video we describe the technical procedure for detection of the sentinel lymph node using fluorescence imaging as showcased in gynecologic oncologicy. A multispectral fluorescence camera system, together with the fluorescent agent indocyanine green, is applied.

Multiespectrales en tiempo real imágenes de fluorescencia para la detección intraoperatoria del ganglio centinela en Oncología Ginecológica

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

Investigación

Medicina

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Detección de microARN en tumores de próstata por el cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular patterns responsible for governing the movement performance. This motor learning can be enhanced through a number of methods that are utilized in research and clinical settings alike. In general, verbal feedback of performance in real-time or knowledge of results following movement is commonly used clinically as a preliminary means of instilling motor learning. Depending on patient preference and learning style, visual feedback (e.g. through use of a mirror or different types of video) or proprioceptive guidance utilizing therapist touch, are used to supplement verbal instructions from the therapist. Indeed, a combination of these forms of feedback is commonplace in the clinical setting to facilitate motor learning and optimize outcomes.
Laboratory-based, quantitative motion analysis has been a mainstay in research settings to provide accurate and objective analysis of a variety of movements in healthy and injured populations. While the actual mechanisms of capturing the movements may differ, all current motion analysis systems rely on the ability to track the movement of body segments and joints and to use established equations of motion to quantify key movement patterns. Due to limitations in acquisition and processing speed, analysis and description of the movements has traditionally occurred offline after completion of a given testing session.
This paper will highlight a new supplement to standard motion analysis techniques that relies on the near instantaneous assessment and quantification of movement patterns and the display of specific movement characteristics to the patient during a movement analysis session. As a result, this novel technique can provide a new method of feedback delivery that has advantages over currently used feedback methods.

Retraining abnormal movement patterns following injury or disease is a key component of physical rehabilitation. Recent advances in technology have permitted accurate assessment of movement during a variety of tasks, with near instantaneous quantification of results. This provides new opportunities for modification of faulty movement patterns in real time.

Movimiento de Reconversión utilizando información en tiempo real del rendimiento

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

En vivo de imágenes óptico de tumores del cerebro y la artritis Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an increased risk of vascular morbidity.&#160;Yet, albeit&#160;the mounting clinical evidence, there is a paucity of clear studies of vascular toxicity and therefore the etiology of a heterogeneous group of vascular/cardiovascular disorders remains to be elucidated. Moreover, the mechanism that may underlie vascular toxicity can completely differ from the principles of chemotherapy-induced cardiotoxicity, which is related to direct myocyte injury. We have established a real-time, in vivo molecular imaging platform&#160;to evaluate&#160;the potential&#160;acute&#160;vascular toxicity of anti-cancer therapies.
We have set up a platform of in vivo, high-resolution molecular imaging&#160;in mice,&#160;suitable for visualizing vasculature within confined organs and reference blood vessels within the same individuals whereas each individual serve as its own control. Blood vessel walls were impaired after doxorubicin administration, representing a unique mechanism of vascular toxicity that may be the early event in end-organ injury. Herein, the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging is described, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

We herein describe the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Inducida por la quimioterapia Vascular Toxicidad - En tiempo real<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen de Deterioro del buque

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting and sustaining this phenotype is critically important in normal alveolar growth and gas exchange throughout life. Several in vitro studies have characterized the role of key regulatory proteins, signaling molecules, and steroid hormones that can influence the rate of lung fluid clearance. However, in vivo examinations must be performed to evaluate whether these regulatory factors play important physiological roles in regulating perinatal lung liquid absorption. As such, the utilization of real time X-ray imaging to determine perinatal lung fluid clearance, or pulmonary edema, represents a technological advancement in the field. Herein, we explain and illustrate an approach to assess the rate of alveolar lung fluid clearance and alveolar flooding in C57BL/6 mice at post natal day 10 using X-ray imaging and analysis. Successful implementation of this protocol requires prior approval from institutional animal care and use committees (IACUC), an in vivo small animal X-ray imaging system, and compatible molecular imaging software.

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

En tiempo real de imágenes de rayos X de los pulmones de volúmenes de líquido en pulmón de ratón neonatal

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Evaluación de pulmón metástasis en el ratón mamarias modelos tumorales mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Prolongado lapso de tiempo intravital de imágenes de tiempo real multicelular Dinámica en el microambiente tumoral

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

Cuantitativo [18F]-Naf-PET-MRI Análisis para la evaluación de la rotación ósea dinámica en un paciente con dolor de espalda baja facetogénico

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still in need. In recent years, mass spectrometry has become a method of choice for untargeted profiling of discriminatory compound as potential biomarkers of a disease. Biofluids are generally considered as preferable matrices given their accessibility and easier sample processing while direct tissue profiling provides more selective information about a given cancer. Preparation of tissues for the analysis via traditional methods is much more complex and time-consuming, and, therefore, not suitable for fast on-site analysis. The current work presents a protocol combining sample preparation and extraction of small molecules on-site, immediately after tumor resection. The sampling device, which is of the size of an acupuncture needle, can be inserted directly into the tissue and then transported to the nearby laboratory for instrumental analysis. The results of metabolomics and lipidomics analyses demonstrate the capability of the approach for the establishment of phenotypes of tumors related to the histological origin of the tumor, malignancy, and genetic mutations, as well as for the selection of discriminating compounds or potential biomarkers. The non-destructive nature of the technique permits subsequent performance of routinely used tests e.g., histological tests, on the same samples used for SPME analysis, thus enabling attainment of more comprehensive information to support personalized diagnostics.

The manuscript presents on-site sampling of human brain tumors with solid phase microextraction followed by their biochemical profiling towards the discovery of biomarkers.

Muestreo y extracción in situ de tumores cerebrales para el análisis de metabolómica y lipidómica

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...