Agradecemos ForteBio para proporcionar gráficos utilizados en la Figura 1. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención GM083088 a TMD

<html> 1. Programación del Instrumento de Ensayo BLI Encienda el instrumento por lo menos una hora de antelación para que la lámpara se caliente, lo que es necesario para minimizar el ruido y la deriva de la señal óptica durante el experimento. Ajuste la temperatura deseada a través de la pestaña instrumento para precalentar el soporte de la placa de la muestra. Entonces pongo el diseño experimental en el software de adquisición de datos. Seleccione &quot;Experimento Nueva Cinética&quot; en la ficha Asistente Experimento. Esto presenta un menú con pestañas con todos los pasos que se deben definir. 1.1. Placa Definición Definir las columnas para ser utilizado en la placa de muestra de 96 pocillos. Asignar columnas para contener tampón, proteína inmovilizada o pareja de unión. Para cada asociación bien, introduzca la concentración de la pareja de unión que se utilizará. Nota: la definición placa mostrada en la Figura 2 tiene opciones para ensayos distintos. 1.2. Ensayo Definición ONTENIDO &quot;&gt; Definir todos los pasos necesarios para el ensayo. Estos incluyen (i) Línea de base (varios), (ii) la carga, (iii) Asociación y (iv) La disociación de la pareja de unión. Entonces, tal como se describe a continuación, ligarse etapas de ensayo individuales con columnas de los pozos de la placa de la muestra mediante la selección de la etapa de ensayo y, a continuación, haga doble clic en la columna respectiva. Estos programas de los sensores que se mueven de una columna de pozos a otra durante el ensayo. <ol><li> Base Comenzar con un paso de línea de base breve (≥ 60 seg), con sensores en tampón de ensayo (Figura 2, columna 1), para establecer señales iniciales BLI en la placa de 96 pocillos. </li><li> Cargando (inmovilización de la proteína biotinilada en los sensores) Asignar los sensores a los pozos que van a contener la proteína biotinilada (Figura 2, columna 2). Utilice la función de umbral para alcanzar un nivel predeterminado de unión (véase la Introducción). Establezca la opción de umbral de modo que todos los sensores estarán movimientoD a la siguiente columna de pozos cuando uno cualquiera de los sensores alcanza el umbral. </li><li> Base Incluir un paso de línea de base en tampón (Figura 2, columna 3; típicamente&gt; 5 min) para lavar las proteínas biotiniladas no inmovilizado a partir de los sensores y establecer nuevos, señales de línea de base estable. Para los ensayos básicos de unión / de disociación sólo (como en la Figura 3), incluir un paso adicional de línea de base (60 seg) con sensores en nuevos pozos de tampón (Figura 2, columna 4) antes de la etapa de asociación. </li><li> Asociación (de la pareja de unión a la proteína inmovilizada) Para un ensayo básico de unión / disociación (como en la Figura 3), seleccionar un rango de concentraciones de pareja de unión que se utilizará para diferentes sensores / pozos (Figura 2, columna 5). Ajustar el tiempo de paso de manera que al menos una concentración de saturación de la pareja de unión debe enfoque de equilibrio señal de unión. Para unaensayo para probar los efectos alostéricos de pequeños ligandos sobre la disociación del complejo proteína-proteína (como en la Figura 5), seleccionar un único alta concentración de pareja de unión (~ 10 veces por encima de la estimación de K D) para su uso en todos los pocillos de asociación. </li><li> Disociación (de la pareja de unión) Para un ensayo básico de unión / disociación sólo (como en la Figura 3), designar los sensores para volver a la columna 4 (figura 2), los mismos pozos tampón tal como se utiliza para la línea de base extra antes de Asociación. Para un ensayo para probar los efectos alostéricos de pequeños ligandos, en lugar designar sensores para mover a la columna 6 (Figura 2), donde cada pocillo puede contener tampón más diferentes ligandos alostéricos. </li></ol> 1.3. Asignación de sensor Indique las ubicaciones en la bandeja de sensor que contendrá sensores prehumedecida para el ensayo. Identifique las posiciones vacías ya que el experimento será FAIl si hay sensores son recogidos. 1.4. Experimento Comentario Visualice todas las medidas planificadas para verificar si hay errores y volver a corregirlos. 1.5. Ejecutar Experimento Introduzca los datos necesarios, incluyendo la ubicación de los archivos de datos. Introduzca la temperatura deseada para el experimento. Si los sensores todavía requieren prehumectación, seleccione la opción de aplazar el inicio del experimento. Por último, una vez que toda la preparación de la muestra es completa (paso 2) y tanto la placa de la muestra y la bandeja de sensor se cargan en el instrumento, haga clic en el botón Continuar para realizar el ensayo. 2. Preparación de la muestra <ol><li> Preparar un tampón de ensayo adecuado. Tampón utilizado para los experimentos mostrados en las Figuras 3 y 5: 20 mM de MOPS (3 - (N-morfolino) propanosulfónico), Tris (Tris (hidroximetil) amino-metano) (añadido para ajustar el pH a 8,0), 50 mM de KCl. Incluya BSA (albúmina de suero bovino, libre de ácidos grasos, 0.5mg / ml final) en el tampón para todas las etapas del ensayo y para todas las diluciones de la proteína biotinilada o pareja de unión para minimizar la unión no específica de proteínas a los sensores. </li><li> Diluir la proteína biotinilada (ε) en tampón de ensayo a una concentración apropiada (véase la introducción). </li><li> Preparar diluciones de la pareja de unión (F 1 (-ε)) en tampón de ensayo (véase la discusión para el rango de concentraciones para usar). </li><li> Prehumedecido los sensores recubiertas de estreptavidina durante al menos 10 minutos para eliminar el recubrimiento de sacarosa protector. Retire el bastidor que contiene el sensor-de la bandeja de sensor y insertar una placa de 96 pocillos en la parte inferior de la bandeja, deslizando una esquina de la placa en la muesca de orientación en la bandeja. Para la columna de sensores para ser utilizado, añadir 200 l de tampón de ensayo por pocillo en que la columna de la placa de 96 pocillos. Devuelva el estante de los sensores a la bandeja con la orientación correcta (con pestañas en las ranuras). </li><li> Como asignado durante la programación en el paso 1, llenar los pozos of la placa de muestra con tampón de ensayo o las diluciones de proteínas apropiadas, como en la Figura 2. Evitar la introducción de burbujas, ya que pueden causar ruido en la señal óptica. Incluir uno o más pocillos de referencia que omiten o bien (i) la proteína biotinilada o (ii) la pareja de unión. </li><li> Abra la puerta del aparato e inserte la bandeja de sensor en la etapa (a la izquierda), con las lengüetas de la bandeja se insertan en las ranuras de la etapa. Introduzca la placa de la muestra en el soporte de la placa (a la derecha), asegúrese de que la placa está sentado plana y en la orientación correcta, tal como se indica en el soporte de la placa. Cierre la puerta y comience el análisis del programa de adquisición de datos (paso 1.5). </li></ol> 3. Proceso de datos <ol><li> Después de que el ensayo se ha ejecutado, abre el software de análisis de datos y la carga de la carpeta que contiene los datos. Haga clic en la pestaña de &quot;elaboración&quot;, para ver un menú por pasos de procesamiento (a la izquierda) y los datos cinéticos primas, con cada sensor (AH) asignado un color diferente (verLa Figura 3). </li><li> Bajo &quot;Selección de datos&quot;, haga clic en el botón &quot;Selección del sensor&quot;. En el &quot;Mapa Sample Plate&quot;, designar a los pozos para 1 o 2 sensores de control (G, H en el ensayo de la Figura 3) como pozos de referencia. En el menú Procesamiento, marque la casilla &quot;Resta&quot; y seleccione &quot;Referencia Wells&quot; para restar la señal de referencia (simple o promedio) de la señal de cualquier otro sensor. </li><li> Alinear todos los rastros que Y = 0 utilizando el paso &quot;Alinear eje Y&quot;. Seleccione &quot;Línea Base&quot; como el paso de alineación (que es la última línea de base antes de la etapa de Asociación). Para el &quot;Intervalo de tiempo&quot;, introduzca los últimos 10 seg de que la línea de base (es decir, 50 a 60 segundos para una línea de base de 60 segundos, como en la figura 3). </li><li> Marque la casilla &quot;Inter-paso de corrección&quot; para reducir al mínimo los cambios de señal entre los pasos de asociación y disociación. Seleccione alinear a línea de base o disociación. </li><li> Seleccionar la función de filtrado Savitzky-Golay en la mayoría de los casos y haga clic en &quot;Proceso de datos!&quot; para proceder. Inspeccione visualmentelos datos finales procesados ​​(panel inferior derecho). Con ensayos destinados para el análisis global de datos (como en la Figura 4), ​​si trazas de señal muestran un cambio significativo entre la Asociación y pasos de disociación, cambiar la selección de la disociación o de línea de base para la &quot;Corrección Inter-paso&quot; y volver a procesar los datos antes de proceder a los datos Análisis. </li></ol> 4. Análisis de Datos Haga clic en la pestaña &quot;Análisis&quot; en el análisis de datos para comenzar. Nota: el ejemplo de los pasos a continuación son para el análisis global de múltiples curvas de unión / disociación (como en la Figura 3). <ol><li> Por &quot;paso a Analizar&quot;, elija asociación y disociación. Para el &quot;Modelo&quot;, seleccione 1:01. Nota: Las demás opciones disponibles son limitados. </li><li> Para el &quot;montaje&quot;, elija Global (Full). Para &quot;Agrupar por&quot; seleccione Color (como en el gráfico). Seleccione &quot;R max UNLINKED Por Sensor&quot; para permitir la instalación independiente de R max (respuesta de la señal máxima a saturar la unión del partner a la proteína inmovilizada). Nota: hacemos esto para la mayoría de los ensayos, como los sensores varían ligeramente en la cantidad de proteína inmovilizada (véase la Figura 3, cargando). </li><li> En la tabla que se muestra, asegúrese de que todos los rastros de los sensores para ser analizados tienen el mismo color, por lo que serán analizados como un conjunto global. Si es necesario, seleccione uno o más sensores traza omitir de ajuste mundial: en la columna &quot;Incluir&quot;, haga clic en la posición del sensor deseado y seleccione &quot;Excluir Wells&quot;. </li><li> Haga clic en &quot;ajuste de curvas!&quot; para iniciar el análisis de regresión no lineal. Examine los resultados apropiados, que incluyen (i) superposición de las curvas de regresión con los rastros de datos del sensor (como en la figura 4), ​​(ii) los gráficos de residuos de ajuste, y (iii) una tabla con valores de los parámetros determinados (constantes de velocidad, R max, K D) y la estadística (errores estándar de los parámetros, Chi-cuadrado, R2). </li><li> En la sección &quot;Exportación de datos&quot;, guardar los resultados de ajuste haciendo clic en &quot;Exportar tabla a. Csv Archivo&quot;. Para graphing o más análisis de datos / curvas ajustadas con otro software, haga clic en &quot;Exportar resultados apropiados&quot; para guardar los datos de cada sensor y curva ajustada en un archivo de texto. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific,+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli.">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li><li>Dayne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioLayer+Interferometry+(BLI)+-+How+Does+it+Work?.">BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?.</a> Fort&#233;Bio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).</li><li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Instrumentos disponibles en la actualidad para BLI permiten el rendimiento y una flexibilidad significativa en los ensayos para las interacciones biomoleculares. Varias muestras de solución se dispensan en los pocillos de una placa de microtitulación de negro, y un conjunto de sensores de BLI paralelas están programadas para moverse adelante y atrás entre las columnas de pozos en la placa. Las muestras se agitan por agitación orbital durante todo el ensayo. El sistema utilizado aquí tiene 8 sensores y utiliza una ...

Interacciones proteína-proteína son importantes para muchos procesos biológicos, y los métodos ópticos de etiqueta libre como resonancia de plasmón superficial (SPR) se han utilizado in vitro para estudiar la cinética de la unión y la disociación 1. La mayoría de los métodos de etiquetado libre inmovilizar una biomolécula en una superficie del sensor y el uso de una señal óptica para detectar una pareja de unión de la solución, ya que se asocia con la biomolécula inmovilizada 1. Mientras SPR es un método altamente sensible, es propenso a la interferencia debido a los cambios en el índice de refracción de la solución que fluye sobre el sensor 2. Aunque no es tan sensible como la SPR, Bio-capa de Interferometría (BLI) se ve menos afectada por cambios en la composición de la muestra 1,3. BLI utiliza biosensores de fibra óptica que tienen un recubrimiento biocompatible patentada en la punta. El sistema utilizado aquí (Octeto-RED96) contiene ocho espectrofotómetros. La luz blanca se canaliza a una fila de sondas que se mueven en un brazo robótico. Los sensores de fibra óptica are recogido por las sondas y se trasladó a una placa de 96 pocillos que contenía las muestras. Una de las moléculas diana se inmoviliza sobre la superficie del biosensor. Entonces sensores se mueven a los pocillos que contienen la pareja de unión en solución. BLI supervisa asociación de la pareja de unión con la molécula inmovilizada y, a continuación, controla la disociación después de mover los sensores a la solución sin la pareja de unión. La unión de moléculas a la superficie del biosensor conduce a cambios en la interferencia óptica entre las ondas de luz que reflejan de nuevo a los espectrofotómetros de una superficie interna y desde la interfaz externa entre el sensor y la solución. Estos cambios en la interferencia pueden ser cuantificados y se utilizan para determinar las constantes de transferencia de la unión y la disociación, que se resumen en la animación de la figura 1. Hemos aplicado BLI para medir las interacciones entre el complejo catalítico de la ATP sintasa bacteriana y su subunidad ε, que puede auto-inhiben la enzima. Sy ATPnthase es un nanomotor rotatorio membrana embebido que cataliza la síntesis y la hidrólisis de ATP 4. El complejo catalítico (F 1) se puede aislar en una forma soluble que funciona como una ATPasa. Ε Subunidad tiene dos dominios: el dominio N-terminal (NTD) es necesario para el montaje correcto y el acoplamiento funcional de la enzima pero no interactuar directamente con las subunidades catalíticas, el dominio C-terminal (CTD) puede inhibir la enzima mediante la interacción con múltiples subunidades catalíticas 5,6. Esta regulación ε-mediada es específico de ATP sintasas bacterianas y no se observa en el homólogo mitocondrial. ATP sintasa se ​​ha convertido en un objetivo para los fármacos antibacterianos, como lo demuestra la reciente aprobación de la FDA de bedaquiline para tratar la tuberculosis resistente a los medicamentos 7. Por lo tanto, la orientación papel inhibidor de ε para el descubrimiento de fármacos podría producir antibacterianos que no inhiben la ATP sintasa mitocondrial. Con el complejo catalítico aislada (F 1), εse convierte en una subunidad disociable. Sin embargo, con ε unida a F 1, la εCTD puede sufrir un cambio conformacional dramática, parcialmente insertar en la cavidad central de la enzima y la formación de un estado de inhibición que es poco probable que se disocian directamente 6,8. Utilizamos BLI para medir la cinética de F 1 / ε de unión y de disociación, e indirectamente, para examinar los efectos alostéricos de sitio catalítico de ligandos sobre la conformación de ε. En nuestro sistema, ε fue elegido para la inmovilización en la superficie del sensor ya que la señal de BLI (como SPR) es sensible a la masa de las moléculas de unión en la superficie. La subunidad ε es pequeño (~ 15 kDa) en relación con el principal complejo de F 1 (~ 347 kDa). Por lo tanto, una señal de BLI más grande será el resultado de la unión de F 1 a ε inmovilizada. Con el fin de supervisar F 1 disociación, que puede ser muy lento, ε deben estar fuertemente inmovilizado. Por lo tanto se optó por biotinilar; E inmovilizarlo sobre biosensores recubiertas con estreptavidina. Las proteínas pueden ser biotinilados por (i) modificación aleatoria de lisinas superficiales 9, (ii) reacción de una cisteína nativo o de ingeniería único con un reactivo de maleimida-biotina 10 o (iii) añadir genéticamente un péptido específico de biotina-aceptor que está biotinilado durante enzimáticamente la expresión in vivo de la proteína marcada 11. En nuestro sistema, ε está biotinilado utilizando el método (iii) 8. Una vez ε-biotina marcado se inmoviliza sobre sensores de estreptavidina, BLI puede medir la unión y la disociación de F 1 que ha sido empobrecido de la subunidad ε (F 1 (-ε)). Para los experimentos descritos aquí, los ensayos preliminares se han realizado para determinar una cantidad razonable de la proteína biotinilada para inmovilizar en los sensores. Esto puede variar, dependiendo del peso molecular de la proteína y su pareja de unión, pero el objetivo es determinar una cantidad mínima de proteína A inmovilizada tsombrero proporciona (i) aceptable señal-a-ruido para la cinética de unión con una baja concentración de la pareja de unión (por debajo de K D) y (ii) una distorsión mínima de la cinética de unión con la concentración cerca de la saturación de la pareja de unión. También, estequiometría de biotinilación puede variar (pero evite&gt; 1 mol biotina / mol de proteína), por lo que puede ser necesario algún ensayo inicial para cada nuevo lote de proteína biotinilada para confirmar que una señal de BLI consistente se puede lograr durante la inmovilización en el recubiertas con estreptavidina sensores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Octet-RED96</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">30-5048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6003-10G</td>
			<td>Fatty Acid free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosensor/Streptavidin</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">18-5019</td>
			<td>Tray of 96 sensors</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">655209</td>
			<td>Black, Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Acquisition software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Analysis software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects

Se describe el uso de la interferometría Bio-capa para estudiar las interacciones inhibidoras de ε subunidad con el complejo catalítico de Escherichia coli ATP sintasa. Bacteriana de tipo F ATP sintasa es el objetivo de un nuevo antibiótico, aprobado por la FDA para combatir la tuberculosis resistente a los medicamentos. La comprensión de bacterias específicas auto-inhibición de la ATP sintasa por el dominio C-terminal de la subunidad ε podría proporcionar un nuevo medio para orientar la enzima para el descubrimiento de fármacos antibacterianos. El dominio C-terminal de ε sufre un cambio conformacional dramática cuando las transiciones de la enzima entre los estados activos e inactivos, y ligandos de sitio catalítico pueden influir en cuál de conformaciones de ε es predominante. El ensayo mide la cinética de unión / disociación de ε con el complejo catalítico, e indirectamente meaSures el cambio de ε unido a la enzima hacia y desde la conformación inhibidor aparentemente nondissociable. La señal de interferometría Bio-capa no es excesivamente sensible a la composición de la solución, por lo que también se puede utilizar para vigilar los efectos alostéricos de ligandos de sitio catalítico sobre los cambios conformacionales de ε.

De unión en tiempo real y la cinética de disociación BLI se muestra en la Figura 3. Este experimento se realizó con tampón de ensayo en asociación y disociación. Este experimento se inició con una etapa de línea de base 10 minutos ya que los sensores se han prehumedecido sólo brevemente. Siguiente, ε biotinilado se cargó en los sensores. No disociación detectable de ε se produjo a lo largo de todos los pasos restantes como se ve desde la curva de referencia (G), que no tenía pareja de uni...

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Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

Los protocolos siguientes describen ensayos cinéticos de las interacciones proteína-proteína con Interferometría Bio-capa. F-tipo ATP sintasa, que está implicado en el metabolismo de la energía celular, puede ser inhibida por su subunidad ε en bacterias. Hemos adaptado Interferometría Bio-capa para estudiar las interacciones del complejo catalítico con el dominio del ε inhibidora C-terminal.

Interferometría Bio-capa para Cinética de interacciones proteína-proteína y alostéricos Efectos ligando medición

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

bio-layer-interferometry-for-measuring-kinetics-protein-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

28.7K vistas.  SUNY Upstate Medical University.  Los protocolos siguientes describen ensayos cinéticos de las interacciones proteína-proteína con Interferometría Bio-capa. F-tipo ATP sintasa, que está implicado en el metabolismo de la energía celular, puede ser inhibida por su subunidad ε en bacterias. Hemos adaptado Interferometría Bio-capa para estudiar las interacciones del complejo catalítico con el dominio del ε inhibidora C-terminal. 

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A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

Un simple y protocolo Rapid para Medir lípidos neutros en las células de algas Utilizando Fluorescencia

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Investigación

Química

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

El examen cuantitativo y cualitativo de las interacciones entre partículas Uso coloidal Sonda Nanoscopia

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.

The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.

Un ELISA basado Encuadernación y método Competencia determinación rápida interacciones ligando-receptor

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Synthesis of Ligand-free CdS Nanoparticles within a Sulfur Copolymer Matrix

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature solvents. These coordinating ligands help solubilize and stabilize the nanoparticles while in solution, and can influence the resulting size and reactivity of the nanoparticles during their formation. Despite the ubiquity of using ligands during synthesis, the presence of aliphatic ligands on the nanoparticle surface can result in a number of problems during the end use of the nanoparticles, necessitating further ligand stripping or ligand exchange procedures. We have developed a way to synthesize cadmium sulfide (CdS) nanoparticles using a unique sulfur copolymer. This sulfur copolymer is primarily composed of elemental sulfur, which is a cheap and abundant material. The sulfur copolymer has the advantages of operating both as a high temperature solvent and as a sulfur source, which can react with a cadmium precursor during nanoparticle synthesis, resulting in the generation of ligand free CdS. During the reaction, only some of the copolymer is consumed to produce CdS, while the rest remains in the polymeric state, thereby producing a nanocomposite material. Once the reaction is finished, the copolymer stabilizes the nanoparticles within a solid polymeric matrix. The copolymer can then be removed before the nanoparticles are used, which produces nanoparticles that do not have organic coordinating ligands. This nascent synthesis technique presents a method to produce metal-sulfide nanoparticles for a wide variety of applications where the presence of organic ligands is not desired.

Herein we present a method to synthesize ligand-free cadmium sulfide (CdS) nanoparticles based on a unique sulfur copolymer. The sulfur copolymer operates as a high temperature solvent and a sulfur source during the nanoparticle synthesis and stabilizes the nanoparticles after the reaction.

Síntesis del ligando libre de CdS nanopartículas dentro de una matriz de copolímero de azufre

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Sitio Dirigida Etiquetado vuelta y EPR estudios espectroscópicos de Canales pentamérica por ligando de iones

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, 1,4-benzene-bis(iminoguanidinium) (BBIG), is demonstrated. The ligand is synthesized as the chloride salt (BBIG-Cl) by in situ imine condensation of terephthalaldehyde with aminoguanidinium chloride in water, followed by crystallization as the sulfate salt (BBIG-SO4). Alternatively, BBIG-Cl is synthesized ex situ in larger scale from ethanol. The sulfate separation ability of the BBIG ligand is demonstrated by selective and quantitative crystallization of sulfate from seawater. The ligand can be recycled by neutralization of BBIG-SO4 with aqueous NaOH and crystallization of the neutral bis-iminoguanidine, which can be converted back into BBIG-Cl with aqueous HCl and reused in another separation cycle. Finally, 35S-labeled sulfate and &#946; liquid scintillation counting are employed for monitoring the sulfate concentration in solution. Overall, this protocol will instruct the user in the necessary skills to synthesize a ligand, employ it in the selective crystallization of sulfate from aqueous solutions, and quantify the separation efficiency.

A protocol for in situ aqueous synthesis of a bis(iminoguanidinium) ligand and its utilization in selective separation of sulfate is presented.

La separación por cristalización selectiva sulfato con un ligando bis-iminoguanidinium

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Miradas en torno a las interacciones de los aminoácidos y péptidos con materiales inorgánicos Uso de una sola molécula de la Fuerza Espectroscopia

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Accessing Valuable Ligand Supports for Transition Metals: A Modified, Intermediate Scale Preparation of 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that derive from initial 2-bromo-2-butene lithiation followed by acid mediated dienol cyclization. The revised synthesis and purification of the ligand avoids the use of mechanical stirring while still permitting access to significant quantities (39 g) of Cp*H in good yield (58%). The procedure offers other additional benefits, including a more controlled quench of excess lithium during the production of the intermediate heptadienols and a simplified isolation of Cp*H of sufficient purity for metallation with transition metals. The ligand was subsequently used to synthesize [Cp*MCl2]2 complexes of both iridium and ruthenium to demonstrate the utility of the Cp*H prepared and purified by our method. The procedure outlined herein affords substantial quantities of a ubiquitous ancillary ligand support used in organometallic chemistry while minimizing the need for specialized laboratory equipment, thus providing a simpler and more accessible entry point into the chemistry of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene.

Reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented. The revised protocol for the synthesis and purification of the ligand minimizes the need for specialized laboratory equipment while simplifying reaction workups and product purification. Use of Cp*H in the synthesis of [Cp*MCl2]2 complexes (M = Ru, Ir) is also described.

El acceso a valiosa ligando Soportes para metales de transición: Una modificación, escala intermedia Preparación de 1,2,3,4,5-pentametilciclopentadieno

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

Mediada por el ligando de la nucleación y crecimiento de nanopartículas de Metal de paladio

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.