La interacción proteína-proteína en la transcripción se ha estudiado tradicionalmente mediante diálisis por porción. Sin embargo, la diálisis por porción es puramente cuantitativa. Usamos interferometría de biocapa, o BLI, para superar este problema.
En comparación con Por dan, BLI detecta la asociación y la disociación en tiempo real entre socios de unión. También genera parámetros cinéticos cuantitativos, que son indicativos de mecanismos de interacción. La tecnología BLI puede sonar intimidante, pero no es difícil aprender Al utilizar esta tecnología, uno tiene que tener el acceso a un instrumento BLI y el software asociado.
Este vídeo le permitirá adaptarse fácilmente a la tecnología BLI. Aproximadamente 10 minutos antes del inicio de un ensayo, pipetear 200 microlitros del tampón BLI en un tubo PCR. Retire un biosensor NTA de níquel del embalaje original sosteniendo la parte ancha del biosensor con una mano enguancha.
Coloque el biosensor sobre el tubo PCR de forma que solo la punta de vidrio del biosensor esté sumergida en el búfer BLI. Mantenga la punta del biosensor sumergida durante al menos 10 minutos para garantizar una hidratación completa. Encienda la máquina Blitz.
Asegúrese de que el equipo esté conectado al ordenador a través de un puerto de salida de datos USB en la parte posterior del equipo. En el ordenador, abra el software asociado y haga clic en Advanced Kinetics en el lado izquierdo de la pantalla. En el software, escriba toda la información apropiada sobre el experimento en cada encabezado respectivo.
Haga clic en Tipo de biosensor y elija Nickel NTA en el menú desplegable. La duración de cada paso se puede cambiar de forma predeterminada según sea necesario. Para obtener resultados óptimos, utilice un mínimo de 30 segundos para la línea de base inicial y la línea de base y 120 segundos para la asociación y la disociación.
Retire el biosensor NTA de níquel hidratado del tubo PCR y colóquelo en el soporte del biosensor de la máquina deslizando la parte ancha del biosensor en el soporte. Coloque un tubo de microcentrífuga negra de 0,5 mililitros en el soporte del tubo de la máquina y pipetee 400 microlitros de tampón BLI en ella. Cierre la cubierta de la máquina de forma que la punta del biosensor se sumerja en el búfer del tubo de microcentrífuga.
Haga clic en Siguiente en el software para comenzar a grabar la línea base inicial. Una vez que el paso inicial de línea base haya terminado de grabar, abra la cubierta de la máquina. Mueva el control deslizante hacia la derecha, de forma que el soporte de colocación esté situado delante de la flecha negra.
Pipetear cuatro microlitros de un ligando con etiqueta su dializada en el soporte de caída y cerrar la cubierta de la máquina, que comenzará automáticamente a grabar el paso de carga. Una vez que el paso de carga haya terminado de grabar, abra la cubierta de la máquina. Mueva el control deslizante hacia la izquierda, de forma que el soporte del tubo se vuelva a colocar delante de la flecha negra.
Cierre la tapa de la máquina y asegúrese de que la punta del biosensor esté sumergida en el tampón BLI del tubo en el soporte del tubo. La máquina y el software comenzarán automáticamente a grabar el paso de línea base. Una vez que el paso de línea base haya terminado de grabar, abra la cubierta de la máquina.
Retire el soporte para gotas y límpielo pipeteando cualquier proteína y enjuagando con agua desionizada doble durante un total de cinco veces. Use una toallita de papel para limpiar la superficie del soporte para gotas después del último lavado. Vuelva a colocar el soporte de gota en la máquina.
Mueva el control deslizante de la máquina hacia la derecha, de forma que el soporte de colocación se coloque una vez más delante de la flecha negra. Pipetear cuatro microlitros de un analito dializado en el soporte de caída y cerrar la cubierta de la máquina, que comenzará automáticamente a grabar el paso de asociación. Una vez que el paso de asociación haya terminado de grabar, abra la cubierta de la máquina.
Mueva el control deslizante de la máquina hacia la derecha, de modo que el soporte del tubo se situe una vez más delante de la flecha negra y cierre la cubierta de la máquina, que comenzará automáticamente a grabar el paso de disociación. Una vez que el paso de disociación haya terminado de grabar, abra la cubierta de la máquina y retire el soporte de gota y el soporte del tubo. Enjuague bien ambos con agua desionizada doble para lavar cualquier proteína.
Retire el biosensor y deséchelo de forma segura. Repita estos pasos para el mismo par de analitos de ligando utilizando diferentes concentraciones de analitos. Una vez que todas las ejecuciones hayan terminado, guarde los datos en el software haciendo clic en Archivo y Guardar experimento como en el lado izquierdo de la pantalla.
En el encabezado Ejecutar datos, seleccione Corrección de pasos y Ajuste de uno a uno y haga clic en Analizar para generar datos cinéticos. Para extraer los datos cuantitativos en una hoja de trabajo y generar gráficos, haga clic en Exportar a CSV y guarde los datos grabados como un archivo CSV. Abra el archivo CSV con un software de hoja de cálculo.
GrgA de longitud completa está hecho de 288 aminoácidos. Como se muestra aquí, una región media de 28 aminoácidos se une directamente a Sigma 28. Aquí la región central etiquetada con un terminal final His-tag fue utilizado como el ligando, que primero fue inmovilizado a la punta de un biosensor NTA de níquel.
Se muestran las grabaciones de experimentos con tres concentraciones de analito diferentes, cada una a partir de 30 segundos antes de la unión del ligando y terminando dos minutos después del comienzo del último lavado. La visualización mejorada de la asociación y disociación del analito ligando se muestra después de la eliminación de valores en las dos primeras etapas y el restablecimiento de la línea de base. Después de lavar sin ataduras y terminal Su-etiquetado GrgA 138 a 165 fuera del biosensor, se registró la asociación en tiempo real con el analito después de la adición de Sigma 28.
Finalmente, la disociación en tiempo real se registró después del lavado. Antes de los ensayos de BLI, el glicerol se elimina de ligandos y analitos. Recomendamos que BLI se realice poco después de la diálisis como se describe en el texto.
Después de caracterizar las interacciones proteína-proteína en la transcripción con BLI, se puede investigar cómo la interacción afecta la iniciación de la transcripción, el alargamiento y la terminación.
