DT fue apoyado por una beca postdoctoral del Le Fonds de recherche du Québec-Nature et Tecnologías (FQRNT) y un Elevate Estratégico Fellowship MITACS. CMC fue apoyado por una beca postdoctoral de Le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) y el Ernest y Margaret Ford cardiología dotado beca de investigación de la Universidad de Ottawa Heart Institute. EOB fue apoyada por subvenciones de funcionamiento MOP80204 del Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR) y T6335 de la Heart and Stroke Foundation de Ontario. El CIHR y Medtronic proporcionan colectivamente EOB con una Cátedra de investigación revisada por pares (URC # 57093). AEP es financiada por las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación (NSERC) Descubrimiento Grant, un Suplemento NSERC Discovery Accelerator y agradecidamente reconoce el apoyo de las Cátedras de Investigación de Canadá programa (CRC) y el Premio Investigador Temprana de la Provincia de Ontario.

1. Deformación mecánica de las células individuales <ol><li> La fabricación de un sustrato PDMS con bolas fluorescentes incrustados Antes de la fabricación del sustrato, microesferas fluorescentes en solución de agua se vuelven a suspender en isopropanol para mejorar la mezcla del grano en el PDMS debido a su naturaleza hidrofóbica. <ol><li> Pipetear 500 l de microesferas fluorescentes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 16.200 xg durante 10 min. </li><li> Desechar el sobrenadante y añadir 500 l de isopropanol siguieron con 5 min de vórtice. Ponga el vial a un lado toda la noche en la oscuridad con el fin de permitir que cualquier partícula grande de agregados al sedimento. </li><li> A la mañana siguiente, retire con cuidado el sobrenadante a un vial de microcentrífuga limpio. Esta solución de bolas se puede utilizar para fabricar más de 5 sustratos. NOTA: La solución del grano seguirá sedimentar durante los próximos 3 días. Tenga cuidado de evitar resuspensión del sedimento. </li><li> Vierta 0,5 g del agente de curado proporcionadocon el kit de PDMS en un vial de microcentrífuga de 1,5 ml usando un equilibrio científica. Por etapas sucesivas, añadir un total de 90 l de bolas (seis en 15 mu l adiciones), vortex durante 1 min entre cada adición. Ponga a un lado. </li><li> Pesar 10 g de PDMS y se mezcla durante al menos 12 min con la 0,5 g del agente de curado suplementado con perlas fluorescentes. </li><li> Fabrique un molde en forma de cruz SU-8 2050 usando técnicas de fotolitografía estándar siguiendo las instrucciones del fabricante. El molde utilizado tiene una altura de 320 micras y un área de 13,4 cm 2 (Figura 3). El molde puede contener 428 l ó 440 mg de PDMS. </li><li> Vierta 400 mg de los PDMS con cuentas en el molde en forma de cruz con una pipeta de transferencia y curar durante 2 horas a 80 ° C. Después del curado, retire el sustrato del molde (Figura 5). El sustrato se puede mantener en una placa de Petri a temperatura ambiente durante 2 semanas sin mostrar cambios significativos en sus propiedades mecánicas. </li&gt; <li> Vierta gotitas de PDMS (agente de curado: PDMS con una relación de 01:20) en una placa de Petri con un tamaño final de aproximadamente 4 mm de diámetro y curar boca abajo durante 2 horas a 80 ° C (Figura 5B). Estas características de anclaje se pueden mantener en una placa de Petri para la semana. NOTA: Mantener el plato boca abajo para evitar que las gotas de aplanamiento durante el proceso de curado. </li><li> Tratamiento de aire de plasma (30 seg a 30 W) el sustrato y 8 funciones de anclaje. Enlazar las características en cada extremo del sustrato a una distancia de 4 mm del guión de forma cuadrada presentes en el sustrato (Figura 5C). </li></ol></li><li> Montaje de la membrana de las abrazaderas <ol><li> Envuelva cada extremo del sustrato alrededor de la parte cilíndrica ranurada de las abrazaderas y seguro en su lugar con los tornillos de fijación 2 de la parte superior (Figura 2B y las figuras 5D-E). </li><li> Atornille las 4 abrazaderas en el soporte de sujeción y vierta PDMS (relación 01:20) usando un t desechableRANSFERENCIA pipeta en la interfase entre el sustrato y la parte cilíndrica ranurada de las abrazaderas. Corre el PDMS sin curar alrededor de la parte cilíndrica ranurada utilizando una llave hexagonal de 1,5 mm. </li><li> Vierta PDMS (1:20) en las ranuras hasta que esté completamente llena por acción capilar y curar el conjunto a 80 ° C durante 2 horas (Figura 5F). </li></ol></li><li> La siembra de células en la membrana <ol><li> Tratamiento de aire-plasma (30 segundos a 30 W) todo el conjunto para esterilizar y funcionalizar el sustrato para permitir que para el revestimiento de colágeno. </li><li> Funcionalizar el área del sustrato donde las células se sembraron con 1 ml de ácido acético 0,02 M suplementado con 16 g / ml de colágeno de cola de rata a temperatura ambiente durante 1 h. La densidad de colágeno final deseado es 5 g / cm 2. </li><li> Enjuagar el sustrato 3x con tampón fosfato y dejar secar a temperatura ambiente por lo menos durante 10 minutos. </li><li> Añadir 40 l de medio de cultivo suplementado con 10% Seru bovino fetalm y 1% de penicilina-estreptomicina que contenía 2000 células en la porción central del sustrato para cubrir un área de 1 cm 2 (densidad de células: 20 células / mm 2). La densidad celular puede ser alterado de acuerdo con los requisitos experimentales. </li><li> Ponga todo el conjunto en una incubadora de cultivo celular estándar con el sustrato hacia arriba con la gota de medio de cultivo que contiene las células en ella. NOTA: El montaje se debe mantener con el sustrato hacia arriba durante al menos 3 horas para permitir que las células se unan firmemente ella. Para evitar la evaporación, 30 l de medio de cultivo caliente se añade en la gota sobre el sustrato cada 45 min durante 3 horas. </li><li> Después de 3 h, dar la vuelta todo el conjunto en una placa de Petri llena de medio de cultivo fresco para sumergir el sustrato y se incuba durante la noche para permitir que las células proliferen. </li><li> El día siguiente, preparar la solución salina tamponada con HEPES (HBSS; 20 mM de Hepes, 120 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl, 0,8 mM de MgSO4, 1,8 mM de CaCl2, y 11,1 mM de dextrose). Ajustar el pH a 7,4. NOTA: La solución HBSS tiene que estar preparado todos los días y se mantiene a 37 ° C durante los experimentos. Esta solución fisiológica se utiliza para mantener las células en la platina del microscopio mediante la imitación de las condiciones del tejido / normal de la sangre. </li><li> Monte la puesta a punto de contraste de fase invertida o un microscopio fluorescente Monte el conjunto de la abrazadera del sustrato en la plataforma y motores BAXS. Llene la caja de Petri en el interior del calentador de placa de Petri con tampón HEPES (Figura 2D). </li></ol></li></ol> 2. Rigidez medición de los buques de pequeño calibre <ol><li> Preparación <ol><li> Krebs solución fisiológica: Prepare una solución de NaCl 118,1 mM, 11,1 mM D-glucosa, 25 mM NaHCO 3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4 y 2,5 mM CaCl 2. Ajustar el pH a 7,4 y oxigenar la solución con gas médico carbógeno (95% O 2/5% CO 2) durante 30 min. NOTA: El soluti Krebsel tiene que estar preparado todos los días y se mantiene a 37 ° C durante los experimentos. Esta solución fisiológica se utiliza para mantener los tejidos vivos al imitar las condiciones del tejido / sangre normal. </li><li> Reúna la instrumentación para la disección y la evaluación mecánica de los vasos aórticos: tijeras quirúrgicas, pinzas dobladas, micro-tijeras, microscopio de disección quirúrgica, 50 ml tubos de centrífuga de polipropileno y 10 ml pipetas serológicas. El procedimiento quirúrgico y el experimento no requiere condiciones estériles. Montar las abrazaderas de la plataforma BAXS junto con la célula de carga de antemano. </li></ol></li><li> Aislamiento de tejido y disección Todos los procedimientos experimentales con animales de laboratorio tienen que ser aprobados por el Comité de los usuarios de Cuidado de Animales y Uso &#39;institución, que cumple con la Guía de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los usuarios&#39; país. <ol><li> Lleve a cabo la eutanasia de ratón con la inhalación de 99% de CO 2 (7 psi)en una cámara de Plexiglas (Figura 6A). </li><li> Abdomen abierto ratón y cortar la aorta torácica a sangrar el ratón. </li><li> Retire el diafragma, la caja torácica y los lóbulos pulmonares (Figura 6B). NOTA: Para reducir al mínimo el riesgo de dañar el tejido, mantener el corazón conectado a la aorta y evitar tocar el recipiente directamente, sino manipularla usando el corazón. </li><li> Quite el corazón, la raíz aórtica y de la aorta torácica cortando suavemente entre el buque y la columna vertebral. NOTA: No provocar ningún alargamiento en el recipiente durante la escisión de mantener la estructura interna del tejido intacto (Figura 6C). </li><li> Inmediatamente sumerja y mantener el corazón y la aorta en solución de Krebs. </li><li> Cortar y lavar cuidadosamente la aorta en solución de Krebs para eliminar cualquier coágulo de sangre. Quitar el tejido conectivo usando micro-tijeras, pinzas y microscopio de disección quirúrgica (Figura 6D-E). NOTA: Mantenga toda la eslora del buque y el uso de la aorraíz de tic para determinar la orientación del vaso. </li></ol></li><li> Vessel Determinación de dimensiones y montaje Para determinar la rigidez del recipiente, se requiere que las dimensiones de la embarcación sin carga y se pueden determinar con un microscopio calibrado. <ol><li> Cortar un anillo aórtico de aproximadamente 2 mm de longitud y medir con precisión su longitud utilizando un ajuste (Figuras 6F-G) microscopio calibrado. Ponga a un lado este segmento en solución de Krebs. </li><li> Corte otro anillo aórtico tan pequeño como sea posible entre cada uno de los segmentos 2 mm (Figura 6F). Añadir este pequeño segmento en un portaobjetos de vidrio de microscopio con el lumen hacia arriba y medir el espesor de la pared usando un ajuste de microscopio calibrado (Figura 6H). </li><li> Llene la caja de Petri en la plataforma BAXS con solución Krebs e inserte el segmento de anillo aorta 2 mm en los pernos de tracción (recuadro en la Figura 4C). </li></ol></li></ol> ge = &quot;always&quot;&gt; <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Fabricación sustrato de PDMS y de montaje. A) Después del curado, el sustrato es cuidadosamente pelado fuera de la 2050 molde SU-8 y dejar de lado en una placa de Petri. B) Anclaje características hechas de PDMS y ayudan a asegurar el sustrato en la abrazaderas. C) sustrato con características de anclaje listo para el montaje. D) El sustrato se monta en las abrazaderas 4, que se montan entonces en el soporte de la abrazadera (véase el recuadro). E) Imagen detallada del sustrato montado en las abrazaderas 4. F ) Procedimiento de colada de PDMS en la ranura debajo de la del sustrato. La flecha muestra el PDMS de llenado lentamente la ranura por capilaridad. 454fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 6. Preparación y aislamiento de la aorta torácica. A) preparar instrumentos quirúrgicos y el ratón sacrificado. B) A través de una incisión abdominal longitudinal, se retiran de la jaula torácica y globos de pulmón. C) La aorta se retira cuidadosamente usando el corazón para manipular el tejido. D) El corazón y la aorta se ponen en solución fisiológica de Krebs. La aorta se limpia mediante la eliminación de todos los tejidos conectivos. E) imagen detallada que muestra el. F) segmento de la aorta del corazón y la aorta utilizado para la evaluación de rigidez a lo largo con pequeños segmentos utilizados para la medición de espesor. GH) La longitud precisa (G) y el espesor (H) de cada uno de los segmentos de buques se evalúan usando un microscopio inverso y un programa de análisis.

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+stretch+and+reorientation+modulates+mesenchymal+stem+cell+morphology+and+fibrous+gene+expression+on+oriented+nanofibrous+microenvironments.">Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments.</a> Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).</li><li>Zdero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+and+torsional+mechanical+characteristics+of+intact+and+reconstructed+scapholunate+ligaments.">Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments.</a> J Biomech Eng. 131, (2009).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La plataforma BAXS presentado aquí facilita numerosos experimentos en el estudio de mecanobiología, de las investigaciones de las células individuales a los tejidos enteros. Además, la plataforma es altamente flexible y configurable, permitiendo numerosos experimentos de estimulación mecánicas y de ensayo de tracción multiaxial. La plataforma también permite el mantenimiento de células y tejidos en condiciones fisiológicas y permite para microscopía simultánea durante los experimentos de estiramiento. Los do...

El microambiente mecánica juega un papel importante en muchas funciones celulares tales como proliferación, migración, y diferenciación, que tienen un impacto profundo en el desarrollo y la homeostasis de los tejidos y también en enfermedades 1-6. A través de los años, una multitud de herramientas experimentales se han utilizado para estimular mecánicamente las células o tejidos y medir las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos con el objetivo de aumentar la comprensión de mecanobiología básica y el estudio de la aparición y progresión de enfermedades de 6-17. Sin embargo, hay que a menudo se basan en varios dispositivos experimentales diferentes con el fin de lograr los objetivos de un estudio en particular. En este artículo se presenta un solo biaxial plataforma, multi-funcional, que se extiende (BAXS) que permite que los estudios que investigan el papel que las propiedades mecánicas y las fuerzas mecánicas juegan en biología en la sub-celular a escalas de longitud tejido enteros. La plataforma BAXS no sólo permite la quantification de las propiedades mecánicas de los tejidos aislados, sino que también facilita la capacidad de aplicar campos de deformación simples, complejos, y dinámicas a las células vivas a fin de comprender sus respuestas al estiramiento que se produce in vivo. La plataforma BAXS también mantiene la capacidad de realizar la microscopía de células vivas durante las pruebas mecánicas y perturbaciones en las células y tejidos. La plataforma BAXS es un aparato construido a la medida que se puede utilizar para investigar el efecto de la deformación del sustrato a nivel celular y realizar ensayos de tracción sobre los tejidos biológicos (Figura 1A). Un calentador de aluminio se fabricó para dar cabida a un plato estándar de 10 cm de Petri y mantener las soluciones fisiológicas a 37 ° C usando un controlador de temperatura y calentadores de Kapton (Figura 1B). Esta plataforma BAXS se puede integrar en un contraste de fase invertida y / o un microscopio de fluorescencia y permite la formación de imágenes simultánea (Figura 1C).En breve, la plataforma BAXS consta de cuatro motores de bobina de voz lineales de los cuales las partes móviles están montados en miniatura de bolas de movimiento lineal diapositivas del rodamiento orientadas a lo largo de dos ejes perpendiculares (Figura 1D). Una etapa de posicionamiento lineal está montado en cada uno de los cuatro motores para permitir el movimiento vertical del sistema de sujeción que se utilizará (Figura 1E). La posición de cada motor se controla mediante un codificador óptico con una resolución de 500 nm (Figura 1F). Los cuatro motores son controlados de manera independiente con un controlador de movimiento que emplea realimentación del codificador óptico para comandos de movimiento (Figura 1G) de ejecutar. Una interfaz de LabVIEW proporciona un control total sobre la magnitud de desplazamiento, velocidad y aceleración de cada motor con el fin de generar la deformación completamente personalizable, estático y dinámico, de las células o muestras de tejido. La técnica utilizada para inducir una deformación en las células se consigue simplemente allowing de células se adhieran firmemente a un sustrato flexible y transparente y luego se extiende este sustrato utilizando los cuatro motores de la plataforma BAXS. La plataforma BAXS permite el montaje de cualquier conjunto de diseño personalizado de pinzas para sujetar el sustrato en los motores de bobina de voz. Para este fin, se diseñó un conjunto de abrazaderas a la que un sustrato flexible y transparente, hecha de polidimetilsiloxano (PDMS), puede ser conectado al mismo (Figuras 2A-C y la Figura 3). Como las abrazaderas estarán expuestos a soluciones fisiológicas, todas las partes se mecanizan a partir de acero inoxidable para permitir la esterilización. Estas abrazaderas han sido cuidadosamente diseñados para llevar el sustrato lo más cerca posible al objetivo del microscopio para mejorar la calidad de imagen al tiempo que minimiza la presión sobre el sustrato durante el estiramiento (Figura 2D). La misma plataforma BAXS también se puede utilizar para cuantificar la rigidez de pequeñas muestras de tejido, utilizando un conjunto adecuado de abrazaderas con ADAPTed soportes para las muestras de tejido y una célula de carga para monitorizar fuerzas. Varios enfoques pueden ser tomados para montar un tejido a los motores de la plataforma BAXS; en este caso los minutiens de insectos de acero inoxidable pines pueden conectar a través de la apertura de los tejidos vasculares con el fin de realizar ensayos de tracción (Figuras 4A-B). Alternativamente, para tejidos gruesos sin una abertura natural, bordes de tejido puede ser celebrada en su posición con las abrazaderas unidas a los motores de bobina de voz o pegados a las pequeñas placas de vidrio con pegamento biológico y unidos a los motores con las abrazaderas. Con el fin de realizar las pruebas de tracción se requiere una célula de carga en miniatura y se puede incorporar fácilmente en los motores de la plataforma BAXS y se utiliza para medir la fuerza que actúa sobre el tejido durante un ciclo de estiramiento (Figura 4C). Como la plataforma BAXS se compone de cuatro motores, la introducción de una segunda célula de carga permite a uno realizar ensayos de tracción a lo largo de dos direcciones ortogonales. Esta capacidad permite a uno quantify la rigidez mecánica de un solo tejido a lo largo de dos direcciones perpendiculares durante el mismo experimento. Es importante destacar que, en todas las configuraciones, las células o muestras de tejido de interés se mantienen siempre en un baño de temperatura controlada que es accesible para el usuario. Esta capacidad permite la introducción de agentes farmacológicos durante el estiramiento de la muestra con el fin de examinar la respuesta temporal de la muestra. Además, como el eje óptico del microscopio invertido permanece sin obstrucciones, todas las formas de microscopía están todavía disponibles para el usuario. Por último, como todos los cuatro motores de la plataforma BAXS son independientes, es posible aplicar campos de deformación altamente configurables para la muestra de interés. In vivo células y tejidos están expuestos a complejo y anisotrópico de estiramiento que puede ser imitado más apropiadamente en esta plataforma en oposición al tradicional estirado uniaxial 7,13,15,18,19 plataforma. Además, las características físicasdel campo de deformación se puede cambiar sobre la marcha durante un experimento. Estas capacidades permiten al usuario examinar la respuesta celular y el nivel de tejido a una amplia serie de altamente complejo, anisotrópico, temporalmente, y campos de deformación espacialmente diferentes. En este artículo se describen las ventajas y limitaciones de la plataforma BAXS así como su diseño, principios de funcionamiento, y los detalles experimentales para una sola célula y los experimentos de todo el tejido. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Visión general de la plataforma BAXS. A) Vista superior de la plataforma BAXS mostrando los cuatro motores de bobina de voz. B) Cuadro detallado del calentador de placa de Petri se utiliza para mantener las células y los tejidos a 37 º C. C) La plataforma se puede montar en un microscopio invertido para tocar en vivo- imágenes de células durante los experimentos de estiramiento.D) Cuadro detallado del motor de bobina de voz; la parte móvil de la plataforma. E) Cuadro detallado de la etapa de posicionamiento lineal que permite el desplazamiento vertical de los sistemas de sujeción. F) Cuadro detallado del codificador óptico que proporciona la posición en tiempo real del motor para el controlador de movimiento. G) Cuadro detallado del controlador de movimiento que muestra las cuatro entradas de encoder ópticos y salidas de potencia a los cuatro motores de bobina de voz. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Sistema de sujeción para los experimentos de células de estiramiento. AB) imágenes que muestran los detalles de las abrazaderas utilizadas para unir el sustrato de PDMS a los motores de bobina de voz para el estiramiento. C) El sustrato se envuelve alrededor de la parte cilíndrica de la abrazadera con su Featur anclajees que se sienta en la ranura en la parte superior. A continuación, el sustrato se fija con los tornillos que empujan el sustrato / anclaje características en la ranura superior. D) Ilustración de la plataforma BAXS con las abrazaderas que sostiene el sustrato en su lugar. El recuadro muestra una vista detallada del sustrato con las células unidas a él sentado justo por encima de una hoja de cubierta y el objetivo del microscopio. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Lista de materiales de la membrana y su sistema de sujeción. Dibujos que muestran las dimensiones de las partes principales integrados a la plataforma de dos ejes para llevar a cabo experimentos de células de estiramiento. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Explo de un sistema de sujeción para la evaluación de la rigidez de los vasos de pequeño calibre. AB) imágenes detalladas del sistema de sujeción se utiliza para inducir la deformación en un 1 mm de diámetro de la aorta del ratón. Pasadores de acero inoxidable fueron cuidadosamente en forma en triángulos abiertos para permitir que el buque se deslice en ambas clavijas. C) Ilustración de la plataforma BAXS con las abrazaderas de la celebración de la embarcación y una célula de carga conectada entre el motor fijo y la pinza izquierda. El recuadro muestra una vista superior detallada del buque montado en las patillas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">PDMS</td>
			<td style="width:155px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:255px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td style="width:167px;">The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">FluoSpheres fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">F8810</td>
			<td>Keep away from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Linear voice coil</td>
			<td style="width:155px;">Moticont</td>
			<td style="width:255px;">LVCM-051-051-01</td>
			<td>The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Ball bearing slide</td>
			<td style="width:155px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:255px;">NT37-360</td>
			<td>Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">linear positioning stage</td>
			<td style="width:155px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:255px;">38-960</td>
			<td>Center Drive 1.25&#34; Square Linear Translation Stages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">optical encoder</td>
			<td style="width:155px;">GSI microE systems</td>
			<td style="width:255px;">Mercury II 1600S - 0.5um resolution</td>
			<td>reflective incremental encoder.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">motion controller</td>
			<td style="width:155px;">Galil</td>
			<td style="width:255px;">DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440</td>
			<td>4 axis controller with a 4 axis amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">load cell&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Honeywell</td>
			<td style="width:255px;">31 low</td>
			<td>miniature load cell with a range of 0-150 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Insect minutiens pins (0,20mm)</td>
			<td style="width:155px;">Pin Service Austerlitz Insect pins</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td>Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SU-8 2050</td>
			<td style="width:155px;">Micro Chem</td>
			<td style="width:255px;">SU-8 2050</td>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Air-plasma treatment system</td>
			<td style="width:155px;">Glowresearch</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td>Autoglow Oxygen Plasma System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Rat-tail collagen</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">A10483-01</td>
			<td>Collagen I, Rat Tail 5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">R37605</td>
			<td>DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters</td>
			<td style="width:155px;">omega.ca</td>
			<td style="width:255px;">KHLV-0504/(10)-P</td>
			<td>28V flexible heaters; can be supplied with a 24V</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers</td>
			<td style="width:155px;">omega.ca</td>
			<td style="width:255px;">CN63200-R1-LV</td>
			<td>Temperature controller; supply 24 V.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">DMEM culture medium</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3024301</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SV30010</td>
			<td>Keep stock frozen. Keep working solution at 4 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3039603C</td>
			<td>Keep frozen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Trypsin 0,05%</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH30236,02</td>
			<td>Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Hepes</td>
			<td style="width:155px;">Wisent Inc</td>
			<td style="width:255px;">330-050-EL</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP358-1</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">KCl</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP366-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">MgSO4</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">M65-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">CaCl2</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">C614-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Dextrose</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP220-1</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP328-1</td>
			<td>Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP362-500</td>
			<td>Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">Carbogen 95% O2/ 5% CO2</td>
			<td style="width:155px;">Lindle</td>
			<td style="width:255px;">DIN:02154749</td>
			<td>Krebs physiological solution oxygenation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">M1404</td>
			<td>Microtubules depolymerization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cytochalasin-D</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">C8273</td>
			<td>Actin filaments depolymerization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Anti-&#945;-SMA-FITC</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">F3777</td>
			<td>Used to stain and quantify smooth muscle cells content</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Picrosirius red stain</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td style="width:255px;">43665</td>
			<td>Used to stain and quantify collagen content</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel stretching platform for applications in cell and tissue mechanobiology

Las herramientas que permiten la aplicación de fuerzas mecánicas a las células y tejidos o que pueden cuantificar las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos han contribuido de manera espectacular a la comprensión de mecanobiología básica. Estas técnicas se han utilizado ampliamente para demostrar cómo el inicio y la progresión de diversas enfermedades están muy influenciados por las señales mecánicas. Este artículo presenta un estiramiento biaxial (BAXS) plataforma multifuncional que puede estimular mecánicamente las células individuales o cuantificar la rigidez mecánica de los tejidos. La plataforma BAXS consta de cuatro motores de bobina de voz que pueden ser controlados de forma independiente. Única células pueden ser cultivadas en un sustrato flexible que se puede acoplar a los motores que permiten una para exponer las células a campos de tensiones complejas, dinámicas y espacialmente variables. Por el contrario, mediante la incorporación de una célula de carga de fuerza, se puede cuantificar también las propiedades mecánicas de los tejidos primarios como los que están expuestos a los ciclos de deformación.En ambos casos, un conjunto adecuado de abrazaderas debe ser diseñado y montado en los motores de la plataforma BAXS con el fin de sostener firmemente el sustrato flexible o el tejido de interés. La plataforma BAXS se puede montar en un microscopio invertido para llevar a cabo simultánea luz transmitida y / o imágenes de fluorescencia para examinar la respuesta estructural o bioquímica de la muestra durante los experimentos de estiramiento. Este artículo proporciona detalles experimentales del diseño y el uso de la plataforma BAXS y presenta los resultados de una sola célula y estudios de todo el tejido. La plataforma BAXS se utilizó para medir la deformación de los núcleos en células individuales de mioblastos de ratón en respuesta al sustrato cepa y para medir la rigidez de las aortas aisladas de ratón. La plataforma BAXS es ​​una herramienta versátil que se puede combinar con diversos microscopías óptica con el fin de proporcionar nuevos conocimientos mecanobiológicos en los niveles de tejido sub-celulares, celular y conjunto.

Celular Estiramiento La plataforma BAXS se utilizó para investigar la respuesta mecánica del núcleo en las células individuales de mioblastos de ratón (C2C12) expuesta a una deformación del sustrato de 25%. Células mioblastos se encuentran en el tejido muscular y están constantemente expuestos a estiramiento mecánico y de compresión in vivo. Las propiedades de forma y mecánicas del núcleo de la célula han demostrado que desempeñan un papel importante e...

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A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Se presenta en este artículo una plataforma novela de estiramiento que se puede utilizar para investigar las respuestas de células individuales a complejo deformación mecánica biaxial anisotrópico y cuantificar las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos.

Una Plataforma Novela Estiramiento para Aplicaciones en Celular y Tisular Mecanobiología

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

a-novel-stretching-platform-for-applications-cell-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.6K vistas.  University of Ottawa.  Se presenta en este artículo una plataforma novela de estiramiento que se puede utilizar para investigar las respuestas de células individuales a complejo deformación mecánica biaxial anisotrópico y cuantificar las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos. 

Video: A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Investigación

Bioingeniería

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microentornos-Sandwich como para aprovechar Celulares / Materiales Interacciones

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Escritura de Electrospinning de andamios Poly(ε-caprolactone) tridimensional con morfologías controlables para aplicaciones de ingeniería de tejidos del derretimiento

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Una plataforma de ultra rendimiento microfluidos para la secuenciación del genoma de unicelular

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Una nueva técnica de sutura de tenorrafia con injerto de colágeno de ingeniería tisular para reparar defectos grandes del tendón

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Una plataforma microfluídica para estimular los condrocitos con compresión dinámica

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Desarrollo de tejido cardíaco humano organizado en 3D dentro de una plataforma microfluídica

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...