We would like to thank Prof David Walker for his technical advice and provision of equipment in the development of this technique. This work is supported by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program. This work was partly supported by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

NOTA: El siguiente procedimiento experimental es aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Monash y llevó a cabo de conformidad con el Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos (2006). HEMBRA ADULTA C57BL / 6 ratones utilizados para generar los resultados representativos se obtuvieron de los Servicios de Animales de Monash. Los ratones fueron alojados en una habitación específica libre de patógenos, temperatura y humedad controlada con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Estos ratones tenían acceso libre a comida y agua. 1. Configuración inicial <ol><li> Conecte el ordenador portátil / escritorio de la máquina de adquisición de datos para el registro a través de un cable USB. </li><li> Conecte el amplificador de puente de &#39;salida de 1 &quot;a la&quot; entrada 1&#39; de la máquina de adquisición de datos a través de un cable BNC. </li><li> Inserte el transductor de presión en &quot;canal 1&quot; del Octal Bridge Amp. Encienda la máquina de adquisición de datos y abra el software de análisis. El software debe autodetectar automáticamente la configuración del equipo (ver materiales y tabla de equipos). </li><li> Ajustes de canal abierto que se encuentran en la barra de herramientas de configuración del software. Cambiar el número de canales que se registró a 1. </li><li> Configure el barómetro para medir la presión de la sala y el aparato de la columna de agua para calibrar el amplificador de puente. El aparato de la columna de agua incluye dos pipetas de jeringa 5 ml serológicas conectados por un tubo de plástico. </li><li> Llenar las columnas con agua y asegúrese de que los niveles de agua están en equilibrio con una regla. Conecte un trozo de tubo de plástico a la parte superior de cada pipeta. Figura 2 muestra la columna de agua creada. </li></ol> 2. Puente Amplificador Calibración Nota: Para calibrar el amplificador de puente de una inyección de aire en la columna de agua se requiere para crear un 1 cm H 2 O de deflexión. Esto ocurrirá bajo un solo conjunto de condiciones y depende de aparato del usuario. Para aclarar estos pasos demonstrate cómo este laboratorio sería realizar la calibración. <ol><li> Retirar una jeringa de 1 ml a 300 l; conectar la jeringa a la llave de paso en el extremo de la tubería en el lado derecho de la columna de agua. NOTA: Asegúrese de que la llave de paso está abierto a la jeringa y la columna de agua, y cerrado al aire de la habitación. Si los niveles de agua no están equilibrados en este punto, gire la llave de paso de modo que está abierto al aire ambiente y la columna de agua, esto reequilibrar el agua. El tubo en el lado izquierdo de la columna de agua debe ser conectado al transductor de presión para medir el cambio en la presión inducida por el desplome de la jeringa. </li><li> Una el tubo de la columna de agua en el lado de mano izquierda para el conector en el transductor de presión (anillo superior del transductor). </li><li> Seleccione el menú de desplazamiento hacia abajo se encuentra junto al canal 1 en la pantalla principal en el lado derecho del software y seleccione &quot;amp Bridge&quot; (ver materiales y tabla de equipos). </li><li> Ingreselos ajustes a 5 mV, 20 Hz de paso bajo, marque la casilla &#39;invertido&#39; y haga clic en &quot;cero&quot;. Haga clic en &#39;cero&#39; para establecer la traza a ~ 0 mV. Reducir el tamaño de la ventana a 4: 1 para facilitar la visualización. </li><li> Con todo listo, presione la jeringa de 1 ml, dejándolo durante 3 segundos. Esto mostrará un aumento repentino en el software debido a que la presión ha cambiado. Cuando los 300 l se deprimieron la presión se moverá el agua en la columna de agua por 1 cm. Este valor conocido ayudará a calibrar el amplificador de puente. NOTA: El aumento de presión en la cámara debido a la depresión 300 l corresponde al valor P K usado para los cálculos posteriores. </li><li> Selecciona &quot;unidades de entrada&quot; que se encuentran en la esquina inferior izquierda de la ventana de Bridge Amp. </li><li> Resalta el &quot;rastro de fondo&quot; antes del pico conocido como la &#39;Región Cero&#39;. <ol><li> Haga clic en la flecha al lado de &quot;punto 1&quot; y esto producirá el background señal dentro del rango de -0,002 mV 0.002 mV (el valor nunca será exactamente a 0 mV). </li><li> Tipo &quot;0&quot; en la ventana al lado de la ventana de la señal de fondo. </li></ol></li><li> Resalta el &quot;aumento de la zona de presión de la gráfica&quot; desde que se presiona la jeringa. Haga clic en la flecha situada junto al punto 2 y el valor debe estar en el rango de 0,9 a 1,2 mV. <ol><li> Tipo &quot;1&quot; en la ventana al lado de la ventana &quot;aumento de la presión&quot;. Para una aclaración visual sobre las medidas 2.7 y 2.8 se refieren a la figura 3. Valores que se encuentran fuera de los rangos especificados puede indicar daño al Octal Bridge Amp. </li></ol></li><li> Ir a &quot;definir las unidades &#39;que se encuentra en la esquina superior derecha de la ventana y seleccione&quot; cmH 2 O &quot;. Si esta opción no está disponible, se puede introducir manualmente. Haga clic en Aceptar. </li><li> Volver al menú de la &#39;Bridge Amp&#39; (véase el apartado 2.1). Seleccione 1 mV y establecer amplificador a &#39;cero&#39;;. Esto completará la calibración y la columna de agua de forma segura se puede eliminar. </li></ol> Función 3. grabación de pulmón <ol><li> Pesar el ratón (g). NOTA: Una semana antes de la evaluación fisiológica introducir el ratón para el ambiente de la cámara pletismografía. Esto ayudará en la aclimatación y reducir el estrés cuando se lleva a cabo este procedimiento en una fecha posterior. Para un esquema general que demuestra la configuración UWBP, por favor refiérase a la Figura 4. </li><li> Medir la temperatura corporal con un termómetro rectal. Lubricar el termómetro con vaselina antes de la inserción. Registre la lectura de la temperatura y limpiar el lubricante con 80% (v / v) de etanol. Si el uso de animales muy pequeños, tales como crías de ratón neonatales, el valor medio de la temperatura corporal se puede determinar con un termómetro de infrarrojos en su lugar. </li><li> Coloque la sonda de humedad / temperatura relativa en el extremo de un agujero de la cámara de pletismografía. Registre la temperatura, la humedad y barometric presión dentro de la cámara pletismografía antes de colocar el ratón dentro. </li><li> Coloque el ratón en la cámara de pletismografía, tapar el extremo abierto ligeramente. Esto permite que el ratón para aclimatarse. Cerrar la cámara. </li><li> Con la sonda de temperatura / humedad insertado en el lado de la cámara de pletismografía con un agujero, ahora insertar el transductor y la jeringa en el otro lado con los dos agujeros. </li><li> Pulse &#39;Start&#39; en el programa de software y récord de aproximadamente 15 a 45 seg. Record 5.10 seg de datos donde el animal no se mueve. Movimiento alterará la fisiología respiratoria basal del animal y proporcionar resultados pobres. La respiración debe oscilar en un trayecto lineal en el programa. Estos son datos utilizables. Nota: la micción o la defecación puede conducir a un aumento en la temperatura y la humedad dentro de la cámara de pletismografía. Esto oscurecer los resultados durante el análisis. En el caso de la micción o la defecación, detenga la grabación inmediatamente y limpiar la plethysmography cámara con 80% (v / v) de etanol. Consulte la Figura 6 para una representación visual de los resultados subóptimos, donde deben ser rechazadas de datos. </li><li> Después de grabar durante 45 segundos, pulse &quot;Stop&quot; en el software (ver tabla de materiales y equipos) del programa. Retire el ratón desde la cámara de pletismografía y registrar inmediatamente la temperatura de la cámara y de la humedad. No grabe continuamente durante más de 45 segundos, ya que esto puede estresar al animal. </li><li> Devuelva el ratón a su jaula, spray y limpie la cámara con un 80% (v / v) de etanol. </li><li> Permitir que la cámara se seque y vuelva a la temperatura de referencia y la humedad antes de proceder a la siguiente ratón. Repita los pasos 3.1 a 3.9 para los animales posteriores. Nota: Si se están estudiando varios animales, asegúrese de que la temperatura de la cámara y el retorno a los valores basales de humedad cerca antes de cada nuevo animal se pone en la cámara. </li></ol> 4. Análisis pletismografía Note: Para calcular los parámetros respiratorios tales como el volumen corriente (V T) y el volumen de minutos las siguientes variables deben ser medidos: la frecuencia respiratoria (respiraciones / min), el tiempo total de ciclo de respiración (seg), la inspiración / tiempo de expiración (Ti / Te, segundos) y el cambio de presión debido a cada volumen corriente (P T). Figura 1 ilustra las variables que se pueden medir de una traza. Los siguientes pasos utilizan un software (ver materiales y equipos de la tabla) para medir estas variables. Al analizar, evitar las regiones de la traza que contiene la inhalación o el movimiento. Para obtener resultados reproducibles, se requiere por lo menos de 5 segundos de buena traza respiración. Para un ejemplo de diferentes huellas de respiración consulte la Figura 5 y 6. <ol><li> Abra la pantalla a pantalla completa, vista establecido en 1: 1 y seleccione 5 seg de datos utilizables. Una instantánea representativa de esto se muestra en la Figura 5. </li><li> Abra la ventana de mini pad de datos que se encuentra en la parte superior de la programo en la pestaña cuaderno de datos. Seleccione el canal 1 y seleccione &#39;mediciones de ciclo &quot;en la columna de la izquierda y&quot; altura cíclica media&#39; en la columna de la derecha. <ol><li> Seleccione &quot;Opción&quot; y establecer la escala para la detección de pico mínimo de 1 (ms). Esto permitirá la detección de todos los valores de pico y se vuelve muy importante cuando se utilizan pequeños animales que producen pequeñas oscilaciones. </li><li> Haga clic en &#39;Aceptar&#39;. Esto presentará «deformación de presión debida a cada volumen corriente &#39;(P T) de medición. </li></ol></li><li> En el mini cojín de datos, seleccione «mediciones del ciclo &#39;seguido de&#39; recuento de eventos &#39;y haga clic en&#39; Aceptar &#39;. Esto presentará la &quot;frecuencia&quot; (f) la medición. <ol><li> Frecuencia necesita ser convertida a respiraciones / min. Esto se hace multiplicando el valor por 60 seg y dividiendo el resultado por el tiempo total de la grabación (min). </li></ol></li><li> En el mini cojín de datos, seleccione cy &#39;mediciones cle &#39;seguido de&#39; periodo &#39;y haga clic en &quot;Aceptar&quot;. Esto presentará el &#39;tiempo total de ciclo de la respiración&#39; (T tot, sec) de medición. </li><li> Los siguientes pasos se utilizan para crear una macroinstrucción para generar valores de tiempo de inspiración y espiración pico. Asegúrese de que el cursor se encuentra directamente sobre el máximo del pico / valle y añadir un comentario en 9 picos secuenciales y valles. Comience con el pico de la oscilación, como se muestra en la Figura 5. </li><li> Posteriormente, seleccione la ventana: pista y la columna 1 En la ventana que aparece, haga clic en &#39;información de selección &quot;en la columna de la izquierda,&#39; duración &#39;en la columna de la derecha y haga clic en&#39; OK &#39;de datos. </li><li> Seleccione la macro que se encuentra en la parte superior del programa y luego inicie la grabación. Ahora seleccione comandos: &#39;Encontrar&#39;, &#39;Go&#39;, &#39;inicio del archivo &quot;y haga clic en&#39; Buscar &#39;. </li><li> Seleccionar comandos: &#39;Buscar&#39; y &#39;Encuentra comentarios&#39;. Escriba la misma frase escrita en el cuadro de comentario en el cuadro &#39;contiene&#39; proporcionado. Seleccione la pestaña &#39;Seleccionar al punto anterior&#39; y &#39;Buscar&#39;. </li><li> Seleccionar comandos: &#39;Añadir a la tableta de datos&#39;. A continuación, seleccione macro: comandos de macro y comenzar a repetir. La ventana cuenta de repetición que aparece debe fijarse en 9. </li><li> Comando Seleccionar: &#39;Buscar siguiente&#39;. Seleccione el comando: &#39;Añadir a la tableta de datos&#39;. Finalmente seleccionar comandos de macro y repetir final. <ol><li> Ahora seleccione la macro y detener la grabación. Guardar y nombrar la macro después de que el número de animales. NOTA: La creación de la macro para cada animal permite que la macro se utiliza para los estudios longitudinales y ahorra tiempo. </li></ol></li><li> La macro se puede ejecutar para obtener la inspiración (Ti) y vencimiento (T e) tiempo entre cada comentario. Los datos aparecerán en el canal 1 del cuaderno de datos. Expiración y la inspiración se produce consecutivamente y aparecerán los datos en este orden. <ol><li> Los datos deben ser dividir manualmente en valores de inspiración y espiración. La media de los cuatro valores de datos de cada parámetro para obtener la media T i y T e. </li></ol></li><li> Una vez que los valores primarios se han derivado el volumen tidal (V T, ml) se puede calcular. Para obtener el volumen tidal se utiliza la ecuación de Drorbaugh y Fenn 8: V T (ml) = (P T / P K) x (V K) x ((T SUBYACENTE (P B - P C)) / (T SUBYACENTE (P B - P C) - T C (P B - P CORE))) Dónde V T: Volumen corriente P k: la desviación de presión debida a cada inyección de 1 ml (Consulte el paso 2.5) Camiseta básica: La temperatura central de cada animal P C: presión de vapor de agua en la cámara de temperatura X Humedad relativa en chambre T C: la temperatura en la cámara de animales P núcleo: Presión a temperatura corporal (presión de vapor del agua a la temperatura corporal x 1,0) P t: desviación de presión debida a cada volumen corriente V k: la inyección de volumen para la calibración P B: presión barométrica </li><li> Una vez que el volumen tidal se ha calculado los siguientes parámetros también se pueden determinar: <ul><li> Volumen por minuto (ml / min) = V T xf </li><li> Volumen por minuto (ml / min / kg) = (V T xf) / peso corporal (kg) </li><li> V T (ml / kg) = V T (ml) / peso corporal (kg) </li><li> Ciclo de trabajo inspiratorio (%) = T i / T tot </li><li> Inspiratoria Caudal (ml / seg) = V T / T i </li><li> Proporción de tiempo de inspiración a tiempo de expiración = T i / T e </li><li> Tiempo total de ciclo (sec) = Tiempo de inspiración (s) + tiempo de expiración (seg) </li></ul></li></ol>

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The authors declare that they have no competing interests. The authors have no conflicts to disclose.

La técnica descrita aquí es un método no invasivo para la evaluación de los parámetros respiratorios de ratones sin restricciones y sin anestesiar. Los puntos fuertes de este protocolo son su simplicidad y precisión para medir la función pulmonar longitudinalmente con artefactos mínimos. Hay, sin embargo, algunas limitaciones y pasos críticos que se observaron sobre el procedimiento. En primer lugar y lo más importante, el ratón debe mantener la calma dentro de la cámara durante un mínimo de cinco segundos....

Disfunción de pulmón es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. La condición se caracteriza por el intercambio de oxígeno insuficiente, sinónimo de tos, dolores en el pecho y la disnea. La enfermedad respiratoria para ~ 10% de la mortalidad en todo el mundo 1. Según la Organización Mundial de la Salud, las tasas de mortalidad se prevé un aumento a causa del tabaquismo persistente, la contaminación y los irritantes ocupacionales. UWBP es una adición útil para el estudio de la fisiología pulmonar, que complementa fuertemente bioquímica tradicional y análisis histológicos 2. Otros procedimientos utilizados para la evaluación de pulmón no ofrecen las mismas ventajas que UWBP. Pletismografía invasiva es una técnica de uso común que requiere que el animal sea anestesiado 3,4 y por lo tanto, las mediciones respiratorias resultantes no son necesariamente un reflejo de un estado natural. Además, el requisito de ventilación y químicas desafíos mecánicos excluye futuras mediciones 3,4.Otro método de recogida de datos respiratoria es por oscilación forzada, que es más sensible a cambios en los parámetros más finas respiratorias en comparación con UWBP 5. Oscilación forzada es, sin embargo, una técnica invasiva y requiere la terminación de animales para la recogida de datos 5-7. UWBP consiste en colocar un animal dentro de una cámara especializada. Durante la inspiración, el aire se calienta de marea y humidificado dentro de los pulmones aumento de presión de vapor de agua y provoca la expansión térmica de gas 8. Este efecto provoca un cambio neto en el volumen de aire de la creación de un aumento de la presión dentro de la cámara 8 pletismógrafo. Lo contrario ocurre durante la espiración la creación de una forma de onda respiratoria del animal. Análisis de forma de onda se utiliza para medir desde la traza respiratoria: frecuencia respiratoria (respiraciones / min), el tiempo total del ciclo respiratorio (seg), la inspiración / tiempo de expiración (Ti / Te, seg) y cambios en la presión debido a cada volumen corriente (P T). <strong&gt; Figura 1 ilustra cada origen mediciones de una traza respiratorio. Estas mediciones son simples y múltiples para calcular los parámetros respiratorios se pueden derivar de estas mediciones. Estos parámetros incluyen: El volumen corriente (volumen de aire movido entre la inhalación y la exhalación normales), el volumen minuto (volumen de gas inhalado desde los pulmones por minuto), ciclo de trabajo de inspiración (el porcentaje de tiempo de inspiración a la duración total del ciclo de respiración) y velocidad de flujo inspiratorio (la cantidad de aire inspirado en un tiempo dado). UWBP proporciona un análisis cuantitativo preciso, no invasivo, de la fisiología respiratoria en modelos animales y se puede utilizar para medir la progresión de la enfermedad respiratoria y la función pulmonar 6,9. Contrariamente a otras técnicas de pletismografía, UWBP evita el uso de la anestesia, las restricciones y las manipulaciones invasivas que producen artefactos y la variabilidad experimental 6,9. La anestesia puede suprimir la respiración,alterar el ritmo cardíaco y puede ser un reto para regular 10. Las restricciones inducen un aumento en la respiración debido a la tensión adicional a través de la corticosterona y la epinefrina liberan 11,13. La característica clave de UWBP se repite evaluación fisiológica por lo que es susceptible de estudios longitudinales. UWBP es muy recomendable para la evaluación longitudinal de la fisiología pulmonar y ofrece una habilidad valiosa para la futura evaluación de drogas respiratoria. Bleomicina, ovoalbúmina, y la hipoxia se han utilizado para inducir desafíos respiratorios en varios estudios y UWBP ha medido correctamente pulmón precisa evaluación fisiológica 7,9,13-16. El protocolo descrito está diseñado para ratones de laboratorio estándar adulto. Sin embargo, UWBP ha sido adaptado a otros animales tales como ratas, cobayas, y primates no humanos 17-20. UWBP no se limita únicamente a la evaluación de la disfunción pulmonar, pero también se ha utilizado para la evaluación de la maduración pulmonar 3.La versatilidad, la sencillez y reproducibilidad de UWBP han establecido una técnica excelente para la evaluación de la función pulmonar en los animales. Varios software (ver materiales y equipos de la tabla) se requerirá seguir este procedimiento. Un científico experimentado sería capaz de realizar este protocolo con un ratón dentro de 1 hr.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1031">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:263px;">LabChart 7 software (for Macintosh)</td>
			<td style="width:139px;">ADINSTRUMENTS</td>
			<td style="width:155px;">MLU60/7</td>
			<td style="width:475px;">used in protocol step 4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PowerLab 8/30 (model ML870)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td>PL3508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Octal Bridge Amp (model ML228)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td>FE228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Black BNC to BNC cable (1m)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td style="width:155px;">MLAC01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Macintosh OS&#160;</td>
			<td>Apple Inc.&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:475px;">Mac OS X 10.4 or later</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Surgipack Digital Rectal Thermometer&#160;</td>
			<td>Vega Technologies</td>
			<td>MT-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Grass volumeteric pressure transducer PT5A</td>
			<td>Grass Instruments Co.</td>
			<td style="width:155px;">Model number PT5A; serial No. L302P4.</td>
			<td style="width:475px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1ml Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:263px;">5ml serological syringe pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606160</td>
			<td style="width:475px;">Connected via plastic tubing</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Balance/Scales</td>
			<td>VWR International, Pty Ltd</td>
			<td>SHIMAUW220D</td>
			<td style="width:475px;">Any weighing balance with of 0.1 gram resolution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">HM40 Humidity &#38; temperature meter&#160;</td>
			<td>Vaisala&#160;</td>
			<td>HM40A1AB</td>
			<td style="width:475px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Barometer</td>
			<td>Barometer World</td>
			<td>1586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">Laboratory tubing</td>
			<td>Dow Corning&#160;</td>
			<td>508-101</td>
			<td style="width:475px;">Used to connect water column to the syringe and pressure transducer</td>
		</tr>
		<tr height="136">
			<td height="136" style="height:136px;width:263px;">Cylindrical Perspex Chamber</td>
			<td>Dynalab Corp.</td>
			<td></td>
			<td style="width:475px;">Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50mm(w) x 1500mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80mm(l) x 80mm(w). Each lid has a 60mm wide circular hole cut on the face of the lid 50mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25mm in diameter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">80% Ethanol (4L)</td>
			<td>VWR International, Pty Ltd</td>
			<td>BDH1162-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography

La disfunción respiratoria es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo y las tasas de mortalidad siguen aumentando. La evaluación cuantitativa de la función pulmonar en modelos de roedores es una herramienta importante en el desarrollo de futuras terapias. Comúnmente utilizado técnicas para la evaluación de la función respiratoria incluyendo pletismografía invasiva y oscilación forzada. Si bien estas técnicas proporcionan información valiosa, la recopilación de datos puede estar lleno de artefactos y la variabilidad experimental debido a la necesidad de anestesia y / o instrumentación invasiva del animal. En contraste, sin restricciones pletismografía de cuerpo entero (UWBP) ofrece una manera precisa, no invasiva, por el cual cuantitativa para analizar los parámetros respiratorios. Esta técnica evita el uso de anestesia y restricciones, que es común a las técnicas tradicionales de pletismografía. Este video demostrará el procedimiento UWBP incluido el equipo instalado, calibrado y pulmón grabación función. Esexplicará la forma de analizar los datos recogidos, así como identificar valores atípicos experimentales y artefactos que resulta de la circulación de animales. Los parámetros respiratorios obtenidos utilizando esta técnica incluyen el volumen corriente, el volumen minuto, ciclo de trabajo inspiratorio, velocidad de flujo inspiratorio y la proporción de tiempo de inspiración a tiempo de caducidad. UWBP no se basa en conocimientos especializados y es de bajo costo para llevar a cabo. Una característica clave de UWBP, y más atractivo para los usuarios potenciales, es la capacidad de realizar mediciones repetidas de la función pulmonar en el mismo animal.

Cuando este procedimiento se ha seguido correctamente, un rastro de oscilación constante se crea en el software de análisis de datos. El procedimiento proporciona una traza respiratoria dentro de unos pocos minutos después de la configuración con los cálculos informáticos sencillos para determinar los parámetros respiratorios enumerados. Figura 5 representa una traza de respiración adecuado a partir de un ratón de control (sanos). Datos oscilante adecuado se produce cuando el animal no se mueve...

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Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

La evaluación de la fisiología respiratoria se ha basado tradicionalmente en las técnicas, que requieran inmovilización o sedación de los animales. Unrestrained pletismografía de cuerpo entero, sin embargo, proporciona un análisis cuantitativo preciso, no invasivo, de la fisiología respiratoria en modelos animales. Además, la técnica permite repitió evaluación respiratorio de los ratones que permiten estudios longitudinales.

Medición de la función respiratoria en ratones usando irrestricta pletismografía corporal total

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative ...

measuring-respiratory-function-mice-using-unrestrained-whole-body

Research

JoVE Journal

Biology

30.0K vistas.  Monash Institute of Medical Research.  La evaluación de la fisiología respiratoria se ha basado tradicionalmente en las técnicas, que requieran inmovilización o sedación de los animales. Unrestrained pletismografía de cuerpo entero, sin embargo, proporciona un análisis cuantitativo preciso, no invasivo, de la fisiología respiratoria en modelos animales. Además, la técnica permite repitió evaluación respiratorio de los ratones que permiten estudios longitudinales. 

Video: Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

La medición de la exocitosis en las neuronas de un etiquetado FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Investigación

Biología

Measuring Blood Pressure in Mice using Volume Pressure Recording, a Tail-cuff Method

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. The CODA tail-cuff system uses Volume Pressure Recording (VPR) to measure the blood pressure by determining the tail blood volume. A specially designed differential pressure transducer and an occlusion tail-cuff measure the total blood volume in the tail without the need to obtain the individual pulse signal. Special attention is afforded to the length of the occlusion cuff in order to derive the most accurate blood pressure readings. VPR can easily obtain readings on dark-skinned rodents, such as C57BL6 mice and is MRI compatible. The CODA system provides you with measurements of six (6) different blood pressure parameters; systolic and diastolic blood pressure, heart rate, mean blood pressure, tail blood flow, and tail blood volume. Measurements can be made on either awake or anesthetized mice or rats. The CODA system includes a controller, laptop computer, software, cuffs, animal holders, infrared warming pads, and an infrared thermometer. There are seven different holder sizes for mice as small as 8 grams to rats as large as 900 grams.

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. This tail-cuff system uses Volume Pressure Recording (VPR) to measure the blood pressure by determining the tail blood volume.

Medición de la presión arterial en ratones con registro del volumen de presión, un método de la cola del manguito

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. The CODA ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

La visualización de la función respiratoria mitocondrial utilizando citocromo C Oxidasa / Succinato Deshidrogenasa (COX / SDH) de doble etiquetado Histoquímica

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Evaluación de la mecánica del sistema respiratorio en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle inhalation toxicology studies, the aerosols in a chamber housing the experimental animals must have: 1) a steady concentration maintained at a desired level for the entire exposure period; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable size distribution with a geometric mean diameter &lt; 200 nm and a geometric standard deviation &sigma;g &lt; 2.5 5. The generation of aerosols containing nanoparticles is quite challenging because nanoparticles easily agglomerate. This is largely due to very strong inter-particle forces and the formation of large fractal structures in tens or hundreds of microns in size 6, which are difficult to be broken up. Several common aerosol generators, including nebulizers, fluidized beds, Venturi aspirators and the Wright dust feed, were tested; however, none were able to produce nanoparticle aerosols which satisfy all criteria 5.
A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure system was fabricated, validated and utilized for nano-TiO2 inhalation toxicology studies. Critical components: 1) novel nano-TiO2 aerosol generator; 2) 0.5 m3 whole-body inhalation exposure chamber; and 3) monitor and control system. Nano-TiO2 aerosols generated from bulk dry nano-TiO2 powders (primary diameter of 21 nm, bulk density of 3.8 g/cm3) were delivered into the exposure chamber at a flow rate of 90 LPM (10.8 air changes/hr). Particle size distribution and mass concentration profiles were measured continuously with a scanning mobility particle sizer (SMPS), and an electric low pressure impactor (ELPI). The aerosol mass concentration (C) was verified gravimetrically (mg/m3). The mass (M) of the collected particles was determined as M = (Mpost-Mpre), where Mpre and Mpost are masses of the filter before and after sampling (mg). The mass concentration was calculated as C = M/(Q*t), where Q is sampling flowrate (m3/min), and t is the sampling time (minute). The chamber pressure, temperature, relative humidity (RH), O2 and CO2 concentrations were monitored and controlled continuously. Nano-TiO2 aerosols collected on Nuclepore filters were analyzed with a scanning electron microscope (SEM) and energy dispersive X-ray (EDX) analysis.
In summary, we report that the nano-particle aerosols generated and delivered to our exposure chamber have: 1) steady mass concentration; 2) homogenous composition free of contaminants; 3) stable particle size distributions with a count-median aerodynamic diameter of 157 nm during aerosol generation. This system reliably and repeatedly creates test atmospheres that simulate occupational, environmental or domestic ENM aerosol exposures.

A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure facility was constructed for nano-sized titanium dioxide (TiO2) inhalation toxicology studies. This system provides nano-TiO2 aerosol test atmospheres that have: 1) a steady mass concentration; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable particle size distribution during aerosol generation.

Whole-Body nanopartículas exposición por inhalación de aerosoles

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Medición inducida glutatión-Alimentación Respuesta en Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Medición de la toxicidad del péptido RAN en C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

In vivo Measurement of Knee Extensor Muscle Function in Mice

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the clinic and the research laboratory, maximal muscular strength is widely measured longitudinally in humans, with knee extensor musculature the most reported functional outcome. Pathology of the knee extensor muscle complex is well documented in aging, orthopedic injury, disease, and disuse; knee extensor strength is closely related to functional capacity and injury risk, underscoring the importance of reliable measurement of knee extensor strength. Repeatable, in vivo assessment of knee extensor strength in pre-clinical rodent studies offers valuable functional endpoints for studies exploring osteoarthritis or knee injury. We report an in vivo and non-invasive protocol to repeatedly measure isometric peak tetanic torque of the knee extensors in mice across time. We demonstrate consistency using this novel method to measure knee extensor strength with repeated assessment in multiple mice producing similar results.

Quantification of knee extensor maximal strength is imperative to understand functional adaptations to aging, disease, injury, and rehabilitation. We present a novel method to repeatedly measure in vivo knee extension isometric peak tetanic torque.

Medición in vivo de la función muscular extensora de la rodilla en ratones

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the ...