Este trabajo fue apoyado por becas de la ANR (Programa Blanc Neurociencias), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), Ciudad de París (Aparición Programa), el INSERM y el Hospital La Pitié Salpêtrière (contrato de investigación traslacional) a NR, de Neuropôle de Recherche Francilien (NERF) a la disfunción eréctil, de la Université Pierre et Marie Curie UPMC (Programa de Convergencia) y del Institut du Cerveau et e la Moelle epiniere (París) a GH

NOTA: El protocolo aquí descrito se ajusta a las directrices de los franceses &quot;Comité Consultivo Nacional d&#39;Ethique&quot; y se declara como una actividad de recolección por el INSERM. 1. Resección del Tejido Humano epiléptico <ol><li> Pacientes <ol><li> Obtener el tejido cerebral de pacientes que sufren de epilepsia intratable. Obtener un consentimiento informado por escrito antes de la cirugía. </li><li> Para todos operados pacientes epilépticos realizan un extenso estudio diagnóstico prequirúrgico incluyendo examen neurológico, evaluación neuropsicológica, EEG de superficie, y de neuroimagen (resonancia magnética y, a veces 18 FDG-PET; Figura 1A), seguido por el examen histológico post-quirúrgica del tejido resecado (Figura 1B) . NOTA: La cirugía está indicada cuando las diversas exploraciones localizar de manera similar la zona de inicio de la crisis y cuando el beneficio de su extracción supera los riesgos quirúrgicos. </li></ol></li><li> Cirugía <ol><li> Maiantiepilépticos ntain antes de la cirugía. Realizar la cirugía bajo anestesia general: inducción con sevoflurano inhalado (6% relación entregado y 100% inhalado fracción de O 2), sufentanilo intra venosa (0,3 mg / kg) y antracurium (0,5 mg / kg), seguido por mantenimiento con sufentanil intra venosa (0,5 g / kg / hr) y sevoflurano inhalado (1 MAC). </li><li> Utilice un sistema de neuronavegación para permitir una localización precisa de la corteza lesionada (Figura 1C). Después de la incisión de la piel, realizar un agujero de trépano en el hueso seguida de una craneotomía con un alto simulacro de derrame. Elevar suavemente el colgajo óseo, y abrir la duramadre con tijeras (Figura 1D). </li><li> Utilice ultrasonido intraoperatorio para facilitar la identificación de la corteza anormal, y los instrumentos de microcirugía y un aspirador ultrasónico bajo el microscopio quirúrgico. </li><li> Coagular y cortar el plano-pio arachnoidal de acuerdo con los límites sulcal. Utilice la disección subpial para rElease la corteza de la pia alrededor de la zona lesionada. </li><li> Cortar la materia blanca bajo la corteza anormal para llevar a cabo una sola pieza &quot;en bloque&quot; resección, evitando tanto como sea posible la vasculatura. Evite la manipulación traumática de la corteza. </li><li> Corte una rebanada 1 cm de espesor de tejido resecado largo de una dirección ortogonal a la superficie pial, incluyendo la parte inferior del surco y la corteza de transición. </li></ol></li></ol> 2. artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF) para la preparación de la rebanada, incubación y grabación <ol><li> ACSF para la preparación rebanada <ol><li> Preparar 1 L de base de sacarosa ACSF 7,8, que contiene (en mM): 250 de sacarosa, 3 KCl, 25 NaHCO 3, 10 D-glucosa, 1 CaCl 2, MgCl 2 10; disolver estas sales en agua desionizada y oxigenar la solución con carbógeno durante al menos 10 min. </li><li> Ponga ~ 700 ml de sacarosa ACSF a -80 ° C durante 50-60 min (o -150 ° C durante 15-20 min). Mantenga el resto de lasolución bajo la oxigenación en el hielo. NOTA: La ACSF para la preparación rebanada se puede almacenar a 4 ° C; en este caso, añadir CaCl 2 y MgCl 2 el día del experimento, antes de enfriarla. </li></ol></li><li> ACSF para la incubación rebanada y grabación <ol><li> Preparar al menos 3 L de ACSF grabación 7,8, que contiene (en mM): 124 NaCl, 3 KCl, 26 NaHCO 3, 10 D-glucosa, 1,6 CaCl 2, 1,3 MgCl 2; disolver estas sales en agua desionizada y oxigenar la solución con carbógeno. Antes de la adición de MgCl2, mantener algunos ACSF para realizar grabaciones en 0 Mg 2+ ACSF. NOTA: La ACSF incubación / grabación se puede almacenar a 4 ° C; en este caso, añadir CaCl 2 y MgCl 2 el día del experimento. </li></ol></li></ol> 3. Equipo para la rebanada de Incubación y grabación <ol><li> Cámara de interfaz para la incubación rebanada <ol><li> Utilice una cámara de corte de cerebro para mantener las rebanadas ex vivo de estar &lt;/ Em&gt; en el modo de interfaz. NOTA: La cámara se compone de una sección inferior, que contiene la calefacción y los elementos sensores y un burbujeador de cerámica y se llena con agua destilada, y una parte superior, donde las rodajas descansan sobre una hoja de tejido del cristalino en el área plana en el centro de la cámara (Figura 2A - B). </li><li> Utilice dos tubos finos de PTFE separados, a través del cual el preoxygenated ACSF entra en la cámara. NOTA: Los tubos en espiral en el agua caliente y alcanzan la parte superior de la cámara; entonces la solución sale por medio de la acción capilar con el tejido objetivo, que transmite la solución en los pocillos de salida. </li><li> Conectar los tubos de PTFE de la cámara de interfaz a una bomba peristáltica, para permitir la perfusión continua de las rebanadas con el medio preoxygenated. </li><li> Mantener la tensión alta de oxígeno por la oxigenación con carbógeno (95% O 2 y 5% de CO 2) a través del burbujeador cerámica. NOTA: Esta mezcla de gas calentado y humedecido alcanza elrebanadas en la parte superior de la cámara a través de agujeros apropiados. </li><li> Mantener la temperatura en la parte superior de la cámara mediante la conexión de la cámara a un controlador de temperatura, a través de un cable de doble extremo especial, que tiene un conector para el elemento de calentamiento de la cámara y un sensor de temperatura exterior en un extremo. Coloque el sensor cerca de las rodajas para comprobar la temperatura a lo largo de la incubación (Figura 2C). </li></ol></li><li> Grabaciones matriz multi-electrodo <ol><li> Utilice matrices planas de múltiples electrodos con 120 electrodos de nitruro de titanio (30 micras de diámetro) aislados con nitruro de silicio y el electrodo de referencia interno, dispuestos en una matriz de 12 x 12 con 200 micras separación de centro a centro. NOTA: Son posibles otras configuraciones con diferente diámetro del electrodo y el espaciamiento. En particular, el chip MEA puede ampliarse para probar rebanadas más grandes de los tejidos humanos. </li><li> Adquirir señales eléctricas a 10 kHz utilizando un sistema MEA2100-120 (pre y fiamplificador con filtro integrado de adquisición de datos y un convertidor analógico-digital, resolución de datos de 16 bits, el rango de tensión de entrada y ancho de banda ajustable vía software) a través de un software específico (MC_Rack). NOTA: El cabezal de la platina MEA2100 está dotado de una placa de metal para la fijación de un elemento que se puede calentar la perfusión a través de soportes magnéticos, para perfundir continuamente las rodajas a lo largo de la sesión de grabación. </li><li> Mantenga el tejido hacia abajo en el MEA por una pequeña ancla de platino hecho en casa, lo que asegura un buen acoplamiento eléctrico entre la rebanada y los electrodos. </li></ol></li></ol> 4. Preparación de la Cámara de interfaz y herramientas para la disección y rebanar <ol><li> Cámara de interfaz <ol><li> Llene la sección inferior de la cámara de interfaz con agua destilada. Asegúrese de que el nivel de agua se sumerge por completo la resistencia y es de 2 a 4 mm por debajo de la unión entre la parte inferior y superior de la cámara. Compruebe este nivel todos los días antes de encender la calefacción,con el fin de evitar daños del elemento de calentamiento. </li><li> Conectar la cámara a una fuente de carbógeno, dotado de un regulador de flujo secundario para ajustes finos de la presión del gas. </li><li> Cortar una hoja de papel para lentes con el fin de adaptarse a la zona plana de la cámara de corte, y colocarlo cerca de los tubos de entrada de la solución, para que nadie se escape de la burbuja de la línea de entrada antes de llegar a las rebanadas. </li><li> Cortar dos piezas de hilo de algodón trenzado, siempre y cuando la pieza de tejido del cristalino, y la posición a lo largo de los lados principales de la zona plana de la cámara. NOTA: Esto ayuda a aumentar ligeramente el nivel de la solución de perfusión en la cámara. </li><li> Ajuste el caudal de la bomba peristáltica a 1 ml / min y activar la bomba. </li><li> Iniciar la oxigenación del agua en la parte inferior de la cámara. </li><li> Ajuste la temperatura del controlador de temperatura a 37 ° C y vuelva a encenderlo. Cubra la parte superior de la cámara de interfaz con un trozo de Parafilm y espere al menos 30 minutos para la temperatUre para aumentar y estabilizar. </li></ol></li><li> Herramientas para la disección y corte en rodajas <ol><li> Prepare un kit de disección que consta de dos pinzas finas, una espátula, una cuchara pequeña y una hoja; dos placas de Petri de vidrio, dos cepillos, así como pegamento de cianoacrilato. </li><li> Establezca los parámetros de la vibratome: espesor, 400 m; frecuencia, 70 a 90 Hz; amplitud, 0,9 a 1 mm, velocidad: 0,1 mm / seg. </li></ol></li></ol> 5. cortical humano Preparación de la rebanada <ol><li> Retire la ACSF a base de sacarosa a partir de -80 ° C congelador y se mezcla para obtener una especie de aguanieve. Oxigenar con carbógeno, poner ~ 250 ml en una botella de vidrio y guárdelo en un frasco Dewar lleno de hielo, mientras que ir a la sala de cirugía del hospital para obtener el tejido. Mientras tanto, mantener el resto a -20 ° C. NOTA: Durante la cirugía, el neurocirujano disecciona un pequeño bloque de tejido cortical. Inmediatamente colocar la muestra en el helado sacarosa ACSF para la transferencia al laboratorio. </li><li> Mantenga el tiempo necesario para la transferencia del hospital al laboratorio a un máximo de 30 min. En el laboratorio, tomar la ACSF oxigenada a base de sacarosa de -20 ° C congelador, mezclar tener un granizado, llenar una placa de Petri y la bandeja tampón vibratome y empezar a oxigenar tanto con carbógeno. Tomar con cuidado la pieza de tejido humano de la botella con una cuchara y lo puso en la placa de Petri (Figura 2D). </li><li> Usando las pinzas, retire con cuidado los coágulos de sangre, los vasos y las meninges para evitar la resistencia durante el rebanado. Retire las meninges, que consiste en pia-materia, a partir de los lados del bloque de tejido, prestando atención a no dañar la superficie cortical. Con una cuchilla, corte un lado del tejido para obtener una superficie plana, que se pega en la placa de muestra de vibratome. NOTA: Las meninges, que consisten en pia-materia, se eliminan a partir de los lados del bloque de tejido, prestando atención a no dañar la superficie cortical. </li><li> Si el bloque de tiN ú mero es más grande que la cámara de MEA, cortar un trozo de dimensiones apropiadas antes de pegar en el plato de muestras (Figura 2E). </li><li> Pegue el tejido con el fin de obtener rebanadas corticales transversales, ponerlo en el baño tampón y cortar rodajas gruesas de 400 micras a baja velocidad (0,1 mm / seg) (Figura 2F). </li><li> Cortar trozos de papel para lentes con dimensiones de sector; con una espátula y un cepillo, transferir las rebanadas en estos tejidos del cristalino y se incuba en la cámara de interfaz a 37 ° C durante al menos 1 hora antes de iniciar las grabaciones (Figura 2G - I). Almacenar continuamente los cortes en las mismas condiciones hasta su uso. NOTA: Colocar las rebanadas en el papel de la lente es un paso importante para facilitar tanto la perfusión del lado inferior de las rebanadas y la eliminación de las rebanadas de la cámara de interfaz antes de la grabación. <ol><li> Si bien la transferencia de las rebanadas en el tejido del cristalino, administrarlos con mucho cuidado, evitando tocar el área de la capa cortical conel cepillo. </li><li> Preparar las rodajas de uno a la vez y transferir inmediatamente cada uno de ellos a la cámara de interfaz, a fin de garantizar el suministro de oxígeno adecuado y la temperatura; cortar el bloque de tejido resecado lo más rápidamente posible. </li></ol></li></ol> 6. Preparación de la instalación de MEA para Grabaciones <ol><li> Enchufe el sistema de perfusión a una bomba peristáltica y el sistema de MEA a un ordenador. Oxigenar la ACSF grabación. Publicar un chip de MEA vacío en el interior del amplificador. </li><li> Ajuste el controlador de temperatura para la calefacción elemento de cánula para llegar a 37 ° C en la cámara de MEA y empezar la perfusión a 5-6 ml / min. NOTA: Por lo general, es necesario establecer la temperatura de 3-4 ° C más alta que la deseada, dependiendo de la temperatura ambiente y la velocidad de flujo. <ol><li> Compruebe la temperatura en la cámara de MEA con una multa termómetro, colocándola lo más cerca posible del centro, sin tocar el área del electrodo. </li></ol></li><li> Inicie la grabación softwarcorreo y comprobar que todos los electrodos MEA están bien conectados y que no hay ruido debido a la perfusión. </li><li> Iniciar MEA_Monitor para comprobar el funcionamiento de la mesa de la cámara. </li></ol> 7. Transferencia de una rebanada de la cámara Interfaz para MEA chip para la grabación <ol><li> Vierta un poco calentado grabación ACSF en una placa de Petri de vidrio; con unas pinzas, tomar una rebanada de la cámara de la interfaz, por el acaparamiento de él a través del tejido de la lente, y lo puso en la placa de Petri. Separar cuidadosamente la rebanada del tejido. Si el nivel de la solución en la cámara de interfaz se ajusta cuidadosamente durante el tiempo de incubación, la rebanada se separará del tejido de la lente sólo sumergiéndolo en la solución; de lo contrario, utilice un cepillo pequeño para facilitar el desprendimiento. </li><li> Llenar un chip de MEA con un poco de ACSF y con una espátula, transferir la rebanada en ella. Con una pipeta Pasteur de plástico, retire suavemente la solución para hacer el corte se adhieren sobre la superficie del electrodo y mantenerla en su lugar con un anch platinoo. Añadir 1 ml de ACSF grabación, colocar el chip de MEA en el amplificador y empezar la perfusión en 5-6 ml / min (Figura 2J - L). </li><li> Compruebe la posición de la rebanada en el área de grabación MEA utilizando MEA_Monitor, ajustar si es necesario con el fin de grabar desde las capas corticales y tomar una fotografía. Inicie la grabación. </li></ol>

<ol>
	<li>Huberfeld, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+pre-ictal+discharges+emerge+at+the+transition+to+seizure+in+human+epilepsy.">Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy.</a> Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).</li><li>Kwan, P., Brodie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+refractory+epilepsy.">Early identification of refractory epilepsy.</a> New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).</li><li>Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longterm+stability+and+developmental+changes+in+spontaneous+network+burst+firing+patterns+in+dissociated+rat+cerebral+cortex+cell+cultures+on+multielectrode+arrays.">Longterm stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multielectrode arrays.</a> Neuroscience Letters. 361 (1-3), 86-89 (2004).</li><li>Sun, J. -. J., Luhmann, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+oscillatory+network+activity+in+the+neonatal+mouse+cerebral+cortex:+Network+oscillations+in+neonatal+cerebral+cortex.">Spatio-temporal dynamics of oscillatory network activity in the neonatal mouse cerebral cortex: Network oscillations in neonatal cerebral cortex.</a> European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1995-2004 (2007).</li><li>Dossi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Regeneration+of+the+ex-vivo+Reconstructed+Mesocorticolimbic+Dopaminergic+System.">Functional Regeneration of the ex-vivo Reconstructed Mesocorticolimbic Dopaminergic System.</a> Cerebral cortex. 23 (12), 2905-2922 (1991).</li><li>Darbon, P., Scicluna, L., Tscherter, A., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+controlling+bursting+activity+induced+by+disinhibition+in+spinal+cord+networks.">Mechanisms controlling bursting activity induced by disinhibition in spinal cord networks.</a> The European journal of neuroscience. 15 (4), 671-683 (2002).</li><li>Cohen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Origin+of+Interictal+Activity+in+Human+Temporal+Lobe+Epilepsy+in+Vitro.">On the Origin of Interictal Activity in Human Temporal Lobe Epilepsy in Vitro.</a> Science. 298 (5597), 1418-1421 (1126).</li><li>Huberfeld, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbed+chloride+homeostasis+and+GABAergic+signaling+in+human+temporal+lobe+epilepsy.">Perturbed chloride homeostasis and GABAergic signaling in human temporal lobe epilepsy.</a> The Journal of neuroscience. 27 (37), 9866-9873 (2007).</li><li>Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Approach+for+Reliably+Investigating+Hippocampal+Sharp+Wave-Ripples+In+Vitro.">An Approach for Reliably Investigating Hippocampal Sharp Wave-Ripples In Vitro.</a> PLoS ONE. 4 (9), (2009).</li><li>H&#225;jos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+network+activity+in+submerged+hippocampal+slices:+importance+of+oxygen+supply.">Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply.</a> European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).</li><li>Wittner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epileptic+human+hippocampal+cornu+ammonis+2+region+generates+spontaneous+interictal-like+activity+in+vitro.">The epileptic human hippocampal cornu ammonis 2 region generates spontaneous interictal-like activity in vitro.</a> Brain. 132 (11), 3032-3046 (2009).</li><li>Dzhala, V., Valeeva, G., Glykys, J., Khazipov, R., Staley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+alterations+in+GABA+signaling+disrupt+hippocampal+network+activity+in+the+developing+brain.">Traumatic alterations in GABA signaling disrupt hippocampal network activity in the developing brain.</a> The Journal of neuroscience. 32 (12), 4017-4031 (2012).</li><li>Menendezdela de la Prida, L., Huberfeld, G., Cohen, I., Miles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+Behavior+in+the+Initiation+of+Hippocampal+Population+Bursts.">Threshold Behavior in the Initiation of Hippocampal Population Bursts.</a> Neuron. 49 (1), 131-142 (2006).</li><li>Avoli, M., Drapeau, C., Louvel, J., Pumain, R., Olivier, A., Villemure, J. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptiform+activity+induced+by+low+extracellular+magnesium+in+the+human+cortex+maintained+in+vitro.">Epileptiform activity induced by low extracellular magnesium in the human cortex maintained in vitro.</a> Annals of neurology. 30 (4), 589-596 (1991).</li><li>Heinemann, U., Dreier, J., Leschinger, A., Stabel, J., Draguhn, A., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+anticonvulsant+drugs+on+hippocampal+neurons.">Effects of anticonvulsant drugs on hippocampal neurons.</a> Hippocampus. 4 (3), 291-296 (1994).</li><li>Li Zhang, C., Dreier, J. P., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paroxysmal+epileptiform+discharges+in+temporal+lobe+slices+after+prolonged+exposure+to+low+magnesium+are+resistant+to+clinically+used+anticonvulsants.">Paroxysmal epileptiform discharges in temporal lobe slices after prolonged exposure to low magnesium are resistant to clinically used anticonvulsants.</a> Epilepsy research. 20 (2), 105-111 (1995).</li><li>Buzs&#225;ki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+extracellular+fields+and+currents+-+EEG,+ECoG,+LFP+and+spikes.">The origin of extracellular fields and currents - EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).</li></ol>

Se proporcionó patrocinio por sistemas multicanal para la producción de la publicación de vídeo y de acceso abierto.

Epilepsia farmacorresistente es una enfermedad poco frecuente, que se puede explorar en el tejido humano in vitro. Esto permite el estudio de la corteza humana epiléptico, que muestra los defectos específicos que están sólo parcialmente reproducidas en modelos animales. El método aquí descrito permite la preparación y la grabación de los tejidos postoperatorias humanos ex vivo con la viabilidad y las redes de modo que espontáneamente producen actividades epilépticos celular conservado. Retener a actividades similares a las registradas en vivo es fundamental para estudiar los mecanismos de génesis de actividades patológicas. Además, tales métodos permiten la exploración de tejidos humanos y evitar modelos animales no perfectos de la enfermedad. Sin embargo, el estudio de los tejidos humanos requiere la sincronización entre neurocirujanos y el laboratorio experimental. Transporte de tejidos requiere cuidados específicos para no ser traumático. Además, tanto la cantidad de la muestra y el tejido es limitado. Por último, el acceso a los tejidos de control adecuadas es la main preocupación. Con esta preparación, los tejidos post operatorios producen espontáneamente descargas de interictales como en ACSF normal de 7,8. Eventos-ictales como también pueden ser provocados en modificado, ACSF proconvulsivantes para que los mecanismos de iniciación de convulsiones y la transición desde el estado interictal a las convulsiones pueden ser investigados. Tejido humano puede mantenerse viable durante un máximo de 10 horas en condiciones de interfaz. Las rebanadas se consideraron viable cuando se observaron de forma espontánea de varias unidades de actividad o en el campo potenciales y cuando dichas actividades fueron evocados por el aumento de la excitabilidad a través de aumentos de potasio extracelular y / o disminución de magnesio. A pesar de la variabilidad en la actividad se produce, probablemente refleja las diferencias en las patologías y las áreas corticales, hemos explorado las características epileptogénicas de un tejido sólo en rodajas saludables que muestran interictal espontáneo y evocado descargas ictales. A fin de conservar la vitalidad y actividad del tejido, una cámara de interfaz se utiliza para almacenar tque rebana a 36-37 ° C para la recuperación antes de grabar con el sistema MEA. De hecho, varios grupos han demostrado claramente las ventajas de la interfaz de sistema de almacenamiento basado comparación con el almacenamiento vaso de precipitados estándar y la importancia de la temperatura para la preservación de la actividad de la red tales como onda ondas agudas espontánea o inducida oscilaciones colinérgicos-9,10. Interfaz de almacenamiento de las rebanadas se ha utilizado anteriormente para registrar la actividad epiléptica de hipocampo humano y rodajas subicular 1,11. Con la técnica actual MEA, después del período de recuperación de rebanar en condiciones de interfaz, la actividad de la red se registra en condiciones sumergidas, en presencia de alta velocidad de flujo (5-6 ml / min) a 37 ° C, con el sistema de MEA. El diámetro reducido (1,8 cm) de chip de MEA, que delimita una cámara de volumen pequeño (&lt;1,5 ml), junto con el aumento de la tasa de flujo, aumenta el suministro de oxígeno de la rebanada, que se ha demostrado ser un factor crítico para espontánea y pharmacologically inducida por las actividades de la red 9,10. Además, la cantidad reducida de ACSF que circula facilita la prueba farmacológica. El procedimiento de corte es sin embargo un traumatismo de los tejidos 12. Tanto la arquitectura neuronal y cloruro de homeostasis parecen estar perturbado en la superficie del tejido (50 micras). El origen de las actividades registradas por los chips de los AMUMA, que muestra el tejido superficial en su mayoría sin penetración profunda, puede surgir de las zonas traumatizadas. Sin embargo, nuestros datos muestran que los potenciales de campo extracelulares localmente detectados se registran en la mayoría de los electrodos de los AMUMA y anterior ir a la obra que se integran en una distancia de 100 a 200 micras desde el sitio de grabación 13, lo que sugiere que las incautaciones registradas en nuestra preparación es improbable que sean producida por áreas traumatizadas. Además, en estudios realizados con electrodos de tungsteno que permite la penetración profunda, las actividades epilépticos registrados en los tejidos humanos son similaresa los observados en pacientes epilépticos 1,7,8. Otro límite de grabación ex vivo de tejidos es la interrupción de las conexiones entre las diferentes áreas del cerebro, restringiendo así neuromodulations dinámicos. Esto puede explicar por qué en tal tejido ningún caso-ictal como se registra de manera espontánea, sino que requiere que se activará por la manipulación farmacológica iónico o la mejora de la estimulación de la excitabilidad. Por consiguiente, en este protocolo, eventos que parecen convulsiones se inducen mediante la combinación de un cambio en K + extracelular del 3 al 6 mM y una reducción de Mg 2 + externo de 1,3 mM a Mg 2 + libre ACSF, a fin de aumentar la excitabilidad del tejido y quitar Mg bloque receptor NMDA dependiente de 2+. De hecho, se ha demostrado previamente que la actividad epileptiforme inducida en rodajas neocorticales y del hipocampo humanos utilizando Mg 2 + libre ACSF se asemeja a las crisis electroencefalográficas grabadas in vivo 14. Además,se ha demostrado que las descargas epileptiformes obtenidos en rebanadas del lóbulo temporal se vuelven resistentes a los anticonvulsivos utilizados clínicamente después de la exposición prolongada a Mg 2 + libre ACSF 15,16, proporcionando así un modelo para investigar los acontecimientos parecen convulsiones farmacorresistentes in vitro. AAM permiten la grabación de ambos, los potenciales de campo y actividades de unidades múltiples que consisten en los potenciales de acción neuronales ex vivo. Por lo tanto, los acuerdos ambientales multilaterales son una poderosa herramienta electrofisiológico en comparación con EEG, que exploran los potenciales de campo generados por las actividades síncronas de conjuntos neuronales in vivo, pero no dan acceso a la única neurona comportamientos 17. Aunque microelectrodos más recientes se pueden grabar en vivo las actividades de unidades múltiples que consisten en los potenciales de acción neuronales, que son invasivas, por lo que su uso se restringe sobre todo a propósito de la investigación durante las grabaciones intracraneales. En particular, las grabaciones AMUMA representan una técnica de elecciónpara estudiar los patrones espacio-temporales de eventos epilépticos, los mecanismos que controlan la aparición de convulsiones y la propagación y la acción de los fármacos antiepilépticos clásicos y nuevos. Cabe destacar que, para desentrañar los tipos de células y la base de señalización de las descargas epilépticas, Spike técnicas de clasificación y los ensayos farmacológicos debe ser combinado con las técnicas de los AMUMA. A pesar de los acuerdos ambientales multilaterales pueden dar acceso a los picos individuales, que no proporcionan información sobre las propiedades sinápticas y biofísicos. En el futuro, otras técnicas deben estar acoplados a las grabaciones de los AMUMA con el fin de mejorar el comportamiento de la muestra celular, actividades de la red y la señalización sináptica. Por ejemplo, imágenes de fluorescencia para desentrañar neuronas o células gliales comportamiento, así como la dinámica de iones, se puede combinar con MEA grabaciones. Además el análisis histológico post hoc también puede revelar alteraciones específicas de tipos de células, proteínas o receptores de modo que la ubicación de las actividades epilépticos se puede correlacionar con reordenamientos específicos de laestructura nerviosa. El sistema de los acuerdos ambientales multilaterales también puede ser embebido en un patch-clamp set-up para correlacionar las células individuales o conductancias con las actividades de población. En el futuro, herramientas optogenética también podrían utilizarse, siempre que las rebanadas humanos pueden cultivarse en el largo plazo, tal como se realizó para rebanadas organotípicos, por lo que la transfección o infección de tipos de células específicas se pueden realizar.

La epilepsia es un trastorno crónico en el que los ataques epilépticos, que son vertidos estampadas intermitentes que duran varios segundos a decenas de segundos en (EEG) electroencefalográficos asociados con manifestaciones clínicas, interrumpen un estado interictal, caracterizado por la presencia de descargas neuronales síncronos decenas de milisegundos de duración y llamó eventos interictales 1. Afecta aproximadamente al 1% de la población del mundo y aunque las convulsiones se controlan en la mayoría de los pacientes, aproximadamente un tercio de las personas con epilepsia no muestran respuesta adecuada a los fármacos antiepilépticos 2. En esta condición, llamada epilepsia farmacorresistente y cuyos mecanismos todavía tienen que ser claramente identificado, la resección quirúrgica de la parte específica del cerebro identificada como la zona de crisis de inicio sigue siendo el único tratamiento alternativo que ofrezca un resultado positivo para los pacientes. De este modo, las piezas resecadas de cirugía ceden la oportunidad de estudiar los mecanismos de descargas interictales y la generación y propagación de convulsiones, así como farmacorresistencia en el tejido nervioso central humano viable ex vivo. Multi-electrodo matrices (AAM), que consiste en un arreglo de microelectrodos distribuidos espacialmente, permite la estimulación simultánea y registro de la actividad electrofisiológica de varios sitios de los tejidos, proporcionando así un enfoque excelente para estudiar los patrones espacio-temporales de la actividad espontánea y evocada . Esta técnica, primero aplica para supervisar los cambios en el desarrollo de la actividad de cultivo celular neuronal 3 y luego adaptado para cerebral aguda y organotípicos de médula espinal y las rodajas de 4 - 6, que se considera actualmente una valiosa herramienta de electrofisiológico. El protocolo actual se describe cómo preparar rebanadas corticales humanas de tejido resecado quirúrgicamente y para grabar con los acuerdos ambientales multilaterales fiable ex vivo interictal y eventos que parecen convulsiones de estas rebanadas. Por tanto, esta técnica proporciona una manera de abordar los mecanismos básicos subyacentes actividades epilépticos iniciación, propagación y los efectos de los fármacos antiepilépticos, tanto a nivel celular y de la red. Todos los procedimientos utilizados para obtener, preparar, mantener y registrar rebanadas humanos se describen en detalle aquí.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="826">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:201px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:279px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Brain Slice Chamber-2: Interface</td>
			<td style="width:201px;">AutoMate Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">S-BSC2</td>
			<td style="width:279px;">It requires separate temperature controller</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">2-channel Temperature Controller</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">TC02</td>
			<td style="width:279px;">It allows to plug in and use 2 interface chambers.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">CA3</td>
			<td style="width:279px;">The reference PT100 is placed near the slices&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">6pin plug-connector with PT100</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">TS-PT100</td>
			<td style="width:279px;">External reference for CA3 cable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">MEA2100-120</td>
			<td style="width:279px;">It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:227px;">Microelectrode array for MEA2100-120</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">120MEA200/30</td>
			<td style="width:279px;">Electrode spacing: 200 &#181;m; electrode diameter: 30 &#181;m; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:227px;">Video Microscope Table</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">MEA-VMT-1</td>
			<td style="width:279px;">Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Perfusion cannula</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">PH01</td>
			<td style="width:279px;">Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">MC_Rack</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td></td>
			<td style="width:279px;">Software for data acquisition and recordings</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:227px;">Magnetic Perfusion Holder</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">MPH</td>
			<td style="width:279px;">Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier&#39;s ground</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Neuroexplorer</td>
			<td style="width:201px;">Nex Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:279px;">Software for data analysis; info@neuroexplorer.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Peristaltic pump (drive unit)</td>
			<td style="width:201px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;">F155001</td>
			<td style="width:279px;">0,01 to 48 rp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Peristaltic pump (pump head)</td>
			<td style="width:201px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;">F117800</td>
			<td style="width:279px;">R2 two channel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Ultrasonic aspirator</td>
			<td style="width:201px;">Integra Life sciences, USA</td>
			<td style="width:119px;">Cusa Excel +</td>
			<td style="width:279px;">It allows blunt subpial dissection of the cortex</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Neuronavigation</td>
			<td style="width:201px;">Isis Solutions, France</td>
			<td style="width:119px;">Surgiscope</td>
			<td style="width:279px;">It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Vibratome HM 650 V</td>
			<td style="width:201px;">Microm</td>
			<td></td>
			<td style="width:279px;">Block slicing into 400 &#956;m thick slices</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue

Epilepsia, afecta a alrededor del 1% de la población, comprende un grupo de trastornos neurológicos caracterizados por la aparición periódica de convulsiones, que alteran la función normal del cerebro. A pesar del tratamiento con fármacos antiepilépticos disponibles actualmente dirigido funciones neuronales, un tercio de los pacientes con epilepsia farmacorresistente son. En esta condición, la resección quirúrgica de la zona del cerebro generando convulsiones sigue siendo el único tratamiento alternativo. El estudio de los tejidos epilépticos humanos ha contribuido a entender los nuevos mecanismos epileptogénicas durante los últimos 10 años. De hecho, estos tejidos generan descargas epilépticas interictales espontáneos, así como eventos ictales inducida farmacológicamente-que se pueden grabar con técnicas de electrofisiología clásicos. Sorprendentemente, las matrices de múltiples electrodos (MEA), que son dispositivos microfabricados incrustación de una matriz de microelectrodos espacialmente dispuestas, ofrecen la oportunidad única de estimular simultáneamente y registro pote campontials, así como los potenciales de acción de múltiples neuronas de diferentes áreas del tejido. Así AMUMA grabaciones ofrecen un excelente enfoque para estudiar los patrones espacio-temporales de interictal espontánea y eventos que parecen convulsiones evocados y los mecanismos que subyacen a la aparición de convulsiones y la propagación. Aquí se describe cómo preparar rebanadas corticales humanas de tejido resecado quirúrgicamente y para grabar con los acuerdos ambientales multilaterales y interictales-ictales como eventos ex vivo.

El registro de la actividad rebanada cortical humano comienza mientras que la perfusión del tejido con ACSF grabación normal (como se describió previamente) 7,8. En esta condición, cuando el tejido está bien conservado durante la cirugía y más tarde durante la transferencia de tejido de la preparación hospital y rebanada, se puede observar la actividad espontánea, en la forma de pequeños eventos-interictales similares, detectados a partir de pequeños grupos de electrodos MEA. Descargas de interictales como consistieron en un potencial de campo, por lo general bifásica, que comprende una desviación negativa agudo inicial, llegando a decenas de microvoltios, seguido de un frente de onda más larga duración de varias decenas de milisegundos. Actividades de unidades múltiples Fast son generalmente incrustadas en el potencial de campo principalmente en la parte inicial. Un ejemplo representativo de la actividad interictal como se ilustra en la Figura 3Aii, donde se muestra la traza registrada por un electrodo MEA. Para grabar las crisis epilépticas de envitro rodajas corticales humanos, es necesario para perfundir con un ACSF &quot;epileptógena&quot;, en el que Mg 2+ está ausente y K + se eleva a 6 mM, para aumentar la excitabilidad del tejido 1 (el aumento de K + del 3 al 6 mM por sí sola no es suficiente para inducir convulsiones; datos no presentados). Una vez que la perfusión con 0 Mg 2+ 6 mM K + ACSF ha comenzado, la actividad de las rebanadas corticales aumenta gradualmente y la primera convulsión aparece dentro de 15 a 20 min (15,4 ± 1,7 min, n = 10, a partir de 5 pacientes; la Figura 3 Ai ). Evocamos actividad ictal similares, como se muestra en la Figura 3, en el 75% de los pacientes probados y en el 66,7% de todas las rebanadas grabados. Actividades epilépticas se registran a partir de electrodos adyacentes del chip de MEA, y la comparación de la dinámica de aparición de eventos potenciales de campo permite el estudio de su sitio de génesis y propagación. Una convulsión representante registrado de una rebanada de zumbidouna corteza cerebral con el sistema de MEA se muestra en la Figura 3B (una traza representante de una convulsión registrada por un solo electrodo MEA se muestra en mayor resolución temporal en la Figura 3 AIII). Tenga en cuenta que la toma se graba desde casi todos los electrodos del chip MEA, lo que indica que es capaz de propagar a una gran área cortical. Además, mirando a las trazas individuales registradas de cada electrodo, es posible observar la propagación progresiva de la toma a través del tejido: de hecho, comienza primero en la zona cortical que cubre la mitad derecha de la matriz de electrodos, y se propaga gradualmente a el área que cubre la mitad izquierda (.. i e, comparar los rastros de L6 electrodo y B6; Figura 3B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig1highres.jpg" width="300" /> Figura 1: A una displasia cortical. d su extirpación quirúrgica de tipo A Taylor displasia cortical focal (flecha blanca) incrustado en un surco lóbulo frontal izquierdo se visualiza en la resonancia magnética preoperatoria (A), y más tarde confirmado por examen histológico etiquetado quinasa (B) MAP; barra de escala: 200 micras) que muestra una dyslamination cortical, las neuronas anormales y una pista en las neuronas con una migración incompleta en la sustancia blanca inferior. Durante la cirugía, la displasia se localiza de acuerdo con los datos de resonancia magnética con un sistema de neuronavegación (C). Visualización de la circunvolución que contienen la displasia durante la cirugía (D). <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2:. Equipo y procedimiento para la preparación rebanada cortical humana Una cámara de interfaz se utiliza para mantener las rebanadas corticales humanas ex vivo (A); el resto rebanadas en una hoja de tejido del cristalino en el área plana en la parte superior de la cámara (B), donde un sensor de temperatura (C, izquierda), conectado a un controlador de temperatura (C, derecha, arriba) a través de un doble cable de composición (C, derecha, abajo), se coloca para mantener 37 ° C durante todo el tiempo de incubación rebanada. Una vez obtenido, colocar el bloque de tejido resecado en una placa de Petri llena de helado ACSF base de sacarosa (D) y eliminar los coágulos sanguíneos, los vasos y meninges, para facilitar el corte en lonchas. Si el bloque de tejido es más grande que las cámaras de los AMUMA, aislar una pieza de dimensiones adecuadas con una cuchilla (E) y pegarla en la placa muestra vibratome (F). Cortar rodajas gruesas 400 micras y con la ayuda de una espátula (G) transferirlos en pedazos de tejido del cristalino (H) e incubar en la cámara de interfaz (I). Antes de grabar, remove el tejido de la lente sumergiendo la rebanada en una placa de Petri llena de ACSF y transferirlo a un chip de MEA ACSF lleno con una espátula (J). Retire la solución para que el corte se adhieren sobre la MEA (K) y mantenerlo en posición mediante el uso de un ancla de platino. Coloque el MEA en el amplificador (L), iniciar la perfusión y la grabación. <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig3highres.jpg" width="300" /> Figura 3: MEA grabaciones de las crisis epilépticas en rebanadas corticales humanos (A) Un representante rastro de la actividad cortical rebanada humana registrada por un electrodo MEA se muestra en el panel i.. En presencia de ACSF normal, es posible observar la actividad-interictal como espontánea (pequeño rectángulo gris, ampliada en el panel ii); luego, cuando se ha iniciado la perfusión con 0 Mg 2 + 6 mM de K + ACSF, la primera seizure aparece después de un minuto de retraso ~ 15 y es seguido por otros eventos en 2-3 intervalo min. Panel III muestra la incautación en el gran rectángulo gris en el panel i con una escala ampliada. El trazo azul ilustra un zoom de la actividad, tal como se indica por la línea azul y la flecha. Panel IV) muestra los datos ilustrados en Panel III) de paso alto filtradas a 250 Hz, que revelan la actividad de varias unidades con un zoom (traza azul). (B) de grabación Representante de una convulsión en presencia de Mg 2 + 0 6 mM de K + ACSF de todos los electrodos MEA. Cada cuadro representa un electrodo de 12 x 12 matriz de MEA y muestra una ventana de tiempo de 80 seg; la línea de puntos indica la posición de la superficie cortical relativamente al conjunto MEA.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue at JoVE.com

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Estamos aquí describimos cómo realizar múltiples grabaciones de electrodos de matriz de tejido cortical humano epiléptico. Resección del tejido epiléptico, preparación rebanada y matriz de electrodos múltiples grabaciones de eventos interictales y ictales se demuestran en detalle.

Multi-electrodos Grabaciones variedad de epilepsia humana postoperatoria cortical del tejido

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

multi-electrode-array-recordings-human-epileptic-postoperative

Microsoft Bing

Research

JoVE Journal

Medicine

20.4K vistas.  CNRS UMR 7241, INSERM U1050, Collège de France.  Estamos aquí describimos cómo realizar múltiples grabaciones de electrodos de matriz de tejido cortical humano epiléptico. Resección del tejido epiléptico, preparación rebanada y matriz de electrodos múltiples grabaciones de eventos interictales y ictales se demuestran en detalle. 

Video: Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

La formación del epitelio prostático humano utilizando tejido recombinación de roedores Urogenital mesénquima seno y células madre humanas

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Investigación

Medicina

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

La encapsulación termogénico preadipocitos para el trasplante en los depósitos de tejido adiposo

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Trabajar con Tejidos Humanos para la Investigación del Cáncer Traslacional

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS images are constructed from calibrated freehand 2D B-mode ultrasound images, which are positioned into a voxel array. Ultrasound (US) imaging allows quantification of muscle size, fascicle length, and angle of pennation. These morphological variables are important determinants of muscle force and length range of force exertion. The presented protocol describes an approach to determine volume and fascicle length of m.&#160;vastus lateralis and m.&#160;gastrocnemius medialis. 3DUS facilitates standardization using 3D anatomical references. This approach provides a fast and cost-effective approach for quantifying 3D morphology in skeletal muscles. In healthcare and sports, information on the morphometry of muscles is very valuable in diagnostics and/or follow-up evaluations after treatment or training.

3D ultrasound imaging (3DUS) allows fast and cost-effective morphometry of musculoskeletal tissues. We present a protocol to measure muscle volume and fascicle length using 3DUS.

Proyección de imagen de ultrasonido 3D: morfometría rápida y rentable de tejido músculo-esquelético

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. It is hypothesized that pro-atherogenic mediators released from fat tissues particularly in association with central/visceral adiposity may promote pathogenic vascular changes locally and systemically, and the notion that cardiovascular disease may be the consequence of adipose tissue dysfunction continues to evolve. Here, we describe a unique method of videomicroscopy that involves analysis of vasodilator and vasoconstrictor responses of intact small human arterioles removed from the adipose depot of living human subjects. Videomicroscopy is used to examine functional properties of isolated microvessels in response to pharmacological or physiological stimuli using a pressured system that mimics in vivo conditions. The technique is a useful approach to gain understanding of the pathophysiology and molecular mechanisms that contribute to vascular dysfunction locally within the adipose tissue milieu. Moreover, abnormalities in the adipose tissue microvasculature have also been linked with systemic diseases. We applied this technique to examine depot-specific vascular responses in obese subjects. We assessed endothelium-dependent vasodilation to both increased flow and acetylcholine in adipose arterioles (50 - 350 &#181;m internal diameter, 2 - 3 mm in length) isolated from two different adipose depots during bariatric surgery from the same individual. We demonstrated that arterioles from visceral fat exhibit impaired endothelium-dependent vasodilation compared to vessels isolated from the subcutaneous depot. The findings suggest that the visceral microenvironment is associated with vascular endothelial dysfunction which may be relevant to clinical observation linking increased visceral adiposity to systemic disease mechanisms. The videomicroscopy technique can be used to examine vascular phenotypes from different fat depots as well as compare findings across individuals with different degrees of obesity and metabolic dysfunction. The method can also be used to examine vascular responses longitudinally in response to clinical interventions.

Videomicroscopy systems are used to examine functional properties of isolated adipose tissue arterioles in response to physiological and pharmacological stimuli. This technique can be used to examine microvascular phenotypes in different adipose tissue domains in obese humans.

Evaluación de la función Microvascular del tejido adiposo humano mediante videomicroscopía

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration

Surgery is commonly used to improve and maintain quality of life. Unfortunately, in vulnerable patients such as the elderly, complications may occur and significantly diminish the outcome. Indeed, after routine orthopedic surgery to repair a fracture, as many as 50% of elderly patients suffer from neurologic complications like delirium. Also, the capacity to heal and regenerate tissue after surgery decreases with age, and can impact the quality of fracture repair and even osseous integration of implants. Thus, a better understanding of mechanisms that drive these age-dependent changes could provide strategic targets to minimize risk for such complications and optimize outcomes. Here, we introduce a clinically relevant mouse model of tibial fracture. The postoperative changes in these mice mimic some of the cognitive impairments commonly observed after routine orthopedic surgery in humans. Briefly, an incision is performed in the right hind limb under strictly aseptic conditions. Muscles are disassociated, and a 0.38-mm stainless steel pin is inserted into the upper crest of the tibia, inside the intramedullary canal. Osteotomy is then performed, and the wound is stapled. We have used this model to investigate the effects of surgical trauma on postoperative neuroinflammation and behavioral changes. By applying this fracture model in combination with parabiosis, a surgical model in which 2 mice are anastomosed, we have studied cells and secreted factors that systemically rejuvenate organ function and tissue regeneration after injury. By following our step-by-step protocol, these models can be reproduced with high fidelity, and can be adapted to interrogate many biologic pathways that are altered by surgical trauma.

This protocol describes a mouse model of orthopedic surgery that has been used to study mechanisms of postoperative neuroinflammation and behavioral changes, and when combined with parabiosis, to study tissue regeneration during aging.

Un modelo de ratón de cirugía ortopédica para el estudio de la disfunción cognitiva postoperatoria y regeneración de los tejidos

Surgery is commonly used to improve and maintain quality of life. Unfortunately, in vulnerable patients such as the elderly, complications may occur and ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) used as 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) represent an elegant and biologically highly relevant 3D cell culture model, which highly resemble in situ tissue due to their complexity, biomechanics and molecular composition. Tissue slicing is widely applied in various animal models. 3D-LTCs derived from human PCLS can be used to analyze responses to novel drugs, which might further help to better understand the mechanisms and functional effects of drugs in human tissue. The preparation of PCLS from surgically resected lung tissue samples of patients, who experienced lung lobectomy, increases the accessibility of diseased and peritumoral tissue. Here, we describe a detailed protocol for the generation of human PCLS from surgically resected soft-elastic patient lung tissue. Agarose was introduced into the bronchoalveolar space of the resectates, thus preserving lung structure and increasing the tissue&#39;s stiffness, which is crucial for subsequent slicing. 500 &#181;m thick slices were prepared from the tissue block with a vibratome. Biopsy punches taken from PCLS ensure comparable tissue sample sizes and further increase the amount of tissue samples. The generated lung tissue cultures can be applied in a variety of studies in human lung biology, including the pathophysiology and mechanisms of different diseases, such as fibrotic processes at its best at (sub-)cellular levels. The highest benefit of the 3D-LTC ex vivo model is its close representation of the in situ human lung in respect of 3D tissue architecture, cell type diversity and lung anatomy as well as the potential for assessment of tissue from individual patients, which is relevant to further develop novel strategies for precision medicine.

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Here, we present a protocol for the preparation of agarose-filled human precision-cut lung slices from resected patient tissue that are suitable for generating 3D lung tissue cultures to model human lung diseases in biological and biomedical studies.

Generación de cultivos de tejido de pulmón humano 3D (3D-LTCs) para el modelado de la enfermedad

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, the fundamental physical diffraction limit prevents interrogation of nanoscale anatomy and subtle pathological changes when using conventional optical imaging approaches. Here, we describe a simple and inexpensive protocol, called expansion pathology (ExPath), for nanoscale optical imaging of common types of clinical primary tissue specimens, including both fixed-frozen or formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue sections. This method circumvents the optical diffraction limit by chemically transforming the tissue samples into tissue-hydrogel hybrid and physically expanding them isotropically across multiple scales in pure water. Due to expansion, previously unresolvable molecules are separated and thus can be observed using a conventional optical microscope.

Nanoscale imaging of clinical tissue samples can improve understanding of disease pathogenesis. Expansion pathology (ExPath) is a version of expansion microscopy (ExM), modified for compatibility with standard clinical tissue samples, to explore the nanoscale configuration of biomolecules using conventional diffraction limited microscopes.

Imágenes nanoscópicas de secciones de tejido humano a través de la expansión física e isotrópica

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

A Postoperative Evaluation Guideline for Computer-Assisted Reconstruction of the Mandible

Valid comparisons of postoperative accuracy results in computer-assisted reconstruction of the mandible are difficult due to heterogeneity in imaging modalities, mandibular defect classification, and evaluation methodologies between studies. This guideline uses a step-by-step approach guiding the process of imaging, classification of mandibular defects and volume assessment of three-dimensional (3D) models, after which a legitimized quantitative accuracy evaluation method can be performed between the postoperative clinical situation and the preoperative virtual plan. The condyles and the vertical and horizontal corners of the mandible are used as bony landmarks to define virtual lines in the computer-assisted surgery (CAS) software. Between these lines the axial, coronal, and both sagittal mandibular angles are calculated on both pre- and postoperative 3D models of the (neo)mandible and subsequently the deviations are calculated. By superimposing the postoperative 3D model to the preoperative virtually planned 3D model, which is fixed to the XYZ axis, the deviation between pre- and postoperative virtually planned dental implant positions can be calculated. This protocol continues and specifies an earlier publication of this evaluation guideline.

Here, we propose a practical, feasible and reproducible evaluation guideline for computer-assisted reconstruction of the mandible in order to create uniformity between studies regarding postoperative accuracy evaluation. This protocol continues and specifies an earlier publication of this evaluation guideline.

Una Guía de Evaluación Postoperatoria para la Reconstrucción Asistida por Computadora de la Mandíbula

Valid comparisons of postoperative accuracy results in computer-assisted reconstruction of the mandible are difficult due to heterogeneity in imaging ...

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, an ex vivo way to cultivate myocardial slices obtained from human heart samples was demonstrated, while approaching in vivo condition of myocardial contraction. These samples originate mostly from heart transplantations or left-ventricular assist device placements. Using a vibratome and a specially developed cultivation system, 300 &#181;m thick slices are placed between a fixed and a spring wire, allowing for stable and reproducible cultivation for several weeks. During cultivation, the slices are continuously stimulated according to individual settings. Contractions can be displayed and recorded in real-time, and pharmacological agents can be readily applied. User-defined stimulation protocols can be scheduled and performed to assess vital contraction parameters like post-pause-potentiation, stimulation threshold, force-frequency relation, and refractory period. Furthermore, the system enables a variable pre- and afterload setting for a more physiological cultivation.
Here, we present a step-by-step guide on how to generate a successful long-term cultivation of human left ventricular myocardial slices, using a commercial biomimetic cultivation solution.

We present a protocol for ex vivo cultivation of human ventricular myocardial tissue. It allows for detailed analysis of contraction force and kinetics, as well as the application of pre- and afterload to mimic the in vivo physiological environment more closely.

Preparación del tejido miocárdico humano para el cultivo a largo plazo

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...