T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.

1. gene targeting Diseño <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ordene un clon BAC apropiado que cubre la región genómica de interés. Asegúrese de que este es isogénica con el tipo de células madre embrionarias que ser modificado, por ejemplo, los clones RPCI-23 y RPCI-24 BAC para la orientación de genes con C57BL / 6 ES células. </li><li> Aplicar gen convencional criterios de orientación en el diseño de los ataques de vectores. Los parámetros clave incluyen si se requiere la modificación a ser constitutivo o condicional, definiendo exones críticos (CE) para la supresión en una estrategia gen knockout y el espaciamiento y la colocación de cintas intrónicos. NOTA: Cada uno de ellos ha sido discutido en detalle en otra parte 10. </li><li> Elija regiones genómicas cada uno de 5-6 kb que flanquean el sitio de modificación de destino. NOTA: Por consiguiente, el tamaño del inserto subclonado es típicamente 10-12 kb, aunque el límite superior puede ser tan alto como 80 kb con un bajo número de copias del plásmido como subclonación p15A, etc. pBR322 y hasta 200 kb con un BACvector. </li></ol> 2. Multiplex recombinería Oligos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Oligos de diseño para el esqueleto del plásmido (plásmido subclonación) y el marcador seleccionable (casete de inserción). Diseñar cada oligo tal que contiene 180 pb HA que flanquea el sitio diana genómico y 20 pb de la secuencia de cebado específico de la casete de inserción o el plásmido subclonación (Figura 2). NOTA: brazos de homología no deben contener elementos repetitivos, la presencia de elementos repetitivos se traducirá en la orientación incorrecta y subclonación. Elementos repetitivos pueden ser detectados mediante el uso de herramientas basadas en la web, como el &#39;&#39; Repite Enmascarador &#39;&#39;. </li><li> Incluir un sitio único de enzima de restricción (RE) sobre uno de los oligos de vectores para linealizar el vector genes de la orientación para la orientación de células ES (Figura 2). </li><li> Compruebe los parámetros oligo utilizando un programa analizador de oligo. Tenga cuidado de evitar estructuras secundarias en la región de cebados. </li><li> Shorter HA (50 pb) del casete de inserción es tolerada y produce menor número de recombinantes, pero asegúrese de que el plásmido subcloning HA es siempre más larga (180 pb). </li><li> Determinar la orientación del inserto de ADN genómico de lo particular clon BAC utilizando herramientas basadas en web como &#39;&#39; cloneDB &#39;&#39;. Establecer la dirección de replicación del oriS comprobando el mapa de la columna vertebral plásmido BAC utilizados en la construcción de la biblioteca BAC. NOTA: oris es generalmente opuesta a la dirección de la transcripción del marcador de cloranfenicol (CHL) para todos los plásmidos BAC utilizados comúnmente. </li><li> Añadir dos enlaces terminales de fosforotioato (PTO) al extremo 5 &#39;del oligo que es opuesta a la dirección de la replicación en el clon BAC. Añadir una modificación 5 &#39;fosfato a la oligo inverso (Figura 2). NOTA: La asimétrica phosphorothioated casete PCR tras la digestión Red genera un ssDNA intermedio que puede cebar la cadena retrasadadel tenedor de replicación. NOTA: Maximal multiplex frecuencia de recombinación se observa con los cassettes protegidas filamento de revestimiento. Principal capítulo protegida o casetes protegidas duales no puede producir eficiencias de recombinación equivalentes en una loci. </li><li> Ordene oligos con la página o la purificación HPLC. </li></ol> 3. Transformación BAC clon con pSC101 BADgbaA recombinería plásmido. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para hacer que la E. coli cepa que lleva el recombinería BAC competentes, transformada con el plásmido pSC101 BADgbaA que contiene los genes rojos 16. NOTA: El plásmido pSC101 BADgbaA contiene los genes rojos y RecA bajo el control de la inducible araC-P BAD promotor de arabinosa, un marcador de selección de tetraciclina y el replicón pSC101 sensible a la temperatura. <ol><li> Apuñalar a una punta de pipeta estéril en el cultivo de agar BAC e inocular 5,0 ml de caldo lisogenia (LB) pH 8,0 que contenía 12,556; g ml -1 Chl. Crece a 37 ° C durante 5 horas con agitación a 200 rpm. </li><li> Chill 10% (v / v) de solución de glicerol, tubos de microcentrífuga y cubetas de electroporación sobre hielo. Enfriar una gran centrifugadora y microcentrífuga refrigerada a 4 ° C. </li><li> Determinar la densidad óptica (DO) del cultivo usando un espectrofotómetro y medir la absorbancia a 600 nm. Preparar células electrocompetentes (como se describe a continuación) cuando se alcanza una lectura OD 600 de 0,3 a 0,8. </li><li> Centrifugar las células en un tubo de centrífuga de 50 ml en un gran centrifugar a 1216 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células con 1 ml de frío 10% de glicerol y centrifugar las células a 17.949 xg durante 20 segundos a 4 ° C. Realice el lavado de paso un total de 3 veces. </li><li> Resuspender las células en un volumen total de 50 l de 10% de glicerol y añadir 10-200 ng del plásmido pSC101 recombineering BADgbaA. Obtener una única suspensión celular mediante pipeteoarriba y abajo varias veces y luego transferir las células a un pre-refrigerada 1 mm cubeta de electroporación de brecha. </li><li> Electroporar las células con un ajuste de 1,8 kv, 25 mF y 200 Ω. NOTA: Compruebe los ajustes correctos para cada marca de electroporador. Una constante de tiempo de la electroporación menos de 4 indica la presencia de sal y otras impurezas. </li><li> Inmediatamente recuperar las células en 1 ml de LB y transferir las células a un tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Mantener el cultivo GBAA BAC a 30 ° C durante 2 horas con agitación a 200 rpm. NOTA: El plásmido pSC101 BADgbaA se pierde cuando las células se cultivaron a 37 ° C debido a la inactivación del factor de replicación sensible a la temperatura repe. Se cultivan las células GBAA a 30 ° C para mantener las funciones recombinería. </li><li> Añadir 9 ml de LB que contienen 12,5 mg ml -1 Chl y 4 mg ml -1 tetraciclina (Tet) a la cultura GBAA BAC recuperado. Crecer elBAC GBAA cultivo O / N a 30 &#160; ° C con agitación a 200 rpm. NOTA: La eficiencia de transformación de la electroporación el plásmido superenrollado GBAA es suficientemente alta para permitir el crecimiento de saturación de O / N en medios líquidos. </li></ol></li></ol> 4. Preparación de Inserción Casetes y Subclonación plásmidos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para incorporar HA en el casete (s) de inserción y el plásmido subclonación, lleve a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los oligos largo modificados como se describe a continuación. <ol><li> Opcional: para evitar plásmido arrastre en la reacción recombinería, utilice un origen R6K o plantilla plásmido estrecho rango de huéspedes similar a amplificar el casete de inserción. </li><li> Alternativamente, linealizar el plásmido plantilla usando un compendio RE (Tabla 2). Elegir un RE que corta fuera de la región amplificación por PCR y es inactivado por calor. El calor inactiva la RE como recomienda la manufacturer. </li><li> Configurar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un sistema de ADN hotstart polimerasa de alta fidelidad. Preparar una mezcla maestra de PCR como se detalla (Tabla 3). Realizar ciclos térmicos como se muestra (Tabla 3). </li></ol></li><li> Analizar los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Cargar 1-5 l de cada PCR en un 1% (w / v) en gel de agarosa que contiene 0,5 mg ml -1 bromuro de etidio (EtBr). NOTA: La presencia de productos de amplificación no específicos no interfiere en la reacción recombinería. En algunos casos, sin embargo, dímeros de cebadores pueden disminuir la eficiencia recombinería. </li><li> Purificar los productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR. <ol><li> Opcional: eliminar la plantilla plásmido de PCR mediante tratamiento con DpnI seguido por PCR de limpieza. Eluir el ADN en un volumen mínimo de agua desionizada estéril (según lo recomendado por el fabricante). NOTA: La adición de DpnI para no purificado de PCR reacciones resultados en reducción de la eficacia de la escisión del XXe plantilla de ADN plásmido metilado. </li></ol></li><li> Cuantificar PCR de ADN amplificado mediante análisis en gel de agarosa en contra de un conjunto conocido de patrones de ADN, por ejemplo, λ digestión con HindIII o mediante el uso de un espectrofotómetro NanoDrop. </li></ol> 5. Subcloning Plus Inserción <ol style="margin-left: 40px;"><li> Diluir la O / N BAC GBAA cultivo de 50 veces mediante la adición de 200 l en 10 ml de LB + Chl + Tet. Crecer en 30 &#160; ° C con agitación a 200 rpm durante 1 hr 50 min. Incluir una muestra a ser utilizada como control negativo. </li><li> Enfríe todos los materiales y equipos recombinería a 4 ° C como se describe en el paso 3.1.2. </li><li> Verter LB agar pH 8 placas que contienen la concentración correcta del antibiótico selectivo apropiado (s) que permita la selección del fragmento de ADN que se inserta, así como para la selección del vector de subclonación (Tabla 4). NOTA: Algunos antibióticos son sensibles al pH. Uso LBagar pH 8 como una regla. </li><li> Preparar una solución al 10% de L-arabinosa (v w /). Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras. NOTA: arabinosa induce la expresión de las proteínas recombinería a partir del plásmido GBAA. </li><li> Compruebe el diámetro exterior de la cultura GBAA BAC utilizando un espectrofotómetro. Una vez que un OD 600 de 0,25-0,3 se alcanza, inducir a las proteínas recombinería como se describe en el siguiente paso. </li><li> Añadir 200 l de la solución de arabinosa 10% a 10 ml del cultivo de BAC para lograr una concentración final de 0,2% de arabinosa. Incluir un cultivo no inducido (sin arabinosa) para ser utilizado como control negativo. </li><li> Transferir la cultura BAC a un 37 &#160; ° C incubadora de agitación e inducir la expresión Roja durante 45 minutos con agitación a 230 rpm. NOTA: La expresión de proteínas rojas es ineficiente a 30 ° C. </li><li> Centrifugar las células y lavar con 10% de glicerol 3 veces tal como se describe en el paso 3.1.5. </li><li> Añadir 600-1,000 ng de cada uno del plásmido subclonación y el casete (s) de inserción a la reacción recombineering. Incluir un único vector y vector más Insertar controles individuales para comprobar el dominio de la recombinación y la integridad del vector y los cassettes. </li><li> Obtener una única suspensión celular pipeteando arriba y abajo. Realizar electroporación como se describe en el paso 3.1.7 y posterior recuperación en 1 ml de LB a 37 ° C durante 1 hora para los plásmidos multicopia o en 10 ml de LB a 37 ° C durante 3 horas para los vectores del BAC. </li><li> Placa de diferentes diluciones de la cultura por ejemplo, recuperado, 90%, 10%, 1% en las placas de agar de doble selección y crecer a 37 &#160; ° C durante 16 horas. </li></ol> 6. Análisis de recombinantes <ol style="margin-left: 40px;"><li> Opcional: Pick 6 a 12 colonias y realizar colonia PCR utilizando un cebador flanqueante HA y un cebador específico de inserción. Incluya el plásmido subclonación y el cas de inserciónplásmido Sette, así como el clon BAC padre como controles negativos. <ol><li> Realizar análisis en gel de agarosa de los PCR de colonias. Identificar los clones positivos por la presencia de una banda brillante en el tamaño esperado. NOTA: La alta eficiencia del proceso de clonación recombinantes SPI genera principalmente correctos. </li></ol></li><li> Escoja colonias en 5 ml de LB pH 8 que contiene el antibiótico selectivo y crecer O / N a 37 ° C. </li><li> Preparar minipreparaciones de ADN utilizando un kit de purificación de la columna según las instrucciones del fabricante. </li><li> Preparar ADN miniprep BAC utilizando el aislamiento de fenol-cloroformo estándar o un protocolo similar. </li><li> Realizar digiere RE en el ADN miniprep. ADN separadas por electroforesis en gel de agarosa. Analizar los patrones de RE para identificar los clones que contienen los fragmentos de tamaños esperados del vector de orientación correcta. Elija un RE que discrimina claramente entre el inserto (s) vector que carece y el vector que contiene el inserto (s). </li><li> Optional: para obtener células que carecen de la BAC, que todavía está presente en la E. coli después recombinería, utilice el ADN plásmido miniprep transformar DH5alfa o DH10B E. células de E. coli. </li><li> Realizar la secuenciación de ADN a través de la HA y el casete de inserción para comprobar errores de síntesis de oligo. </li></ol>

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L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li></ol>

T.R.R is the inventor of a British patent application on multiplex recombineering technology.

Construcción de líneas de células madre embrionarias y modelos de ratón históricamente ha incluido la orientación de genes utilizando construcciones de plásmidos que contenían el alelo modificado 4. Sin embargo, la construcción de estos vectores complejos orientación de genes ha demostrado ser un cuello de botella significativo en la producción oportuna de tales modelos. El desarrollo de estrategias de construcción vector recombinería basada ha permitido mejorar los diseños vectoriales y montaje vector más eficiente. Sin embargo, los protocolos recombinería actuales todavía implican varios pasos, requieren de purificación de plásmido intermedio y utilizan diferentes cepas bacterianas. Subclonación de inserción plus ofrece un nuevo enfoque para la construcción de vectores que se pueden realizar en un solo evento electroporación en la cepa huésped BAC residente. La utilidad de SPI en la dirección de genes fue probado aquí en una variedad de aplicaciones de construcción del vector. En todos los casos examinados aquí, SPI demostró ser eficiente y se produjo el plásmido recombinante correcta.En la mayoría de los casos, las múltiples cintas de diferentes fueron insertados correctamente en el vector de direccionamiento. Grandes casetes de ADN y vectores fueron alojados fácilmente en el protocolo SPI y demostraron la flexibilidad de este sistema. SPI se basa en el uso de secuencias de homología largas y fosforotioato (PTO) la protección de los casetes de ADN lineales. Modificación PTO confiere protección contra exonucleasas al ADN lineal 20,21 y la larga HA aumenta la eficiencia de recombinación para permitir la multiplexación. Sin embargo, la síntesis de secuencias de oligo largos aumenta las posibilidades de acumulación de errores especialmente supresiones. Las mutaciones en el oligo pueden ser particularmente perjudicial si cubren regiones codificantes de proteínas. La secuenciación del ADN a través de la HA y cubre la longitud completa de la cinta insertada es muy recomendable para eliminar clones con las alteraciones de la secuencia. También se sugiere el uso de un sistema de ADN polimerasa de alta fidelidad para evitar la introducción de unaerrores y PCR. La longitud y la composición de la HA del plásmido subclonación es más crítica respecto a la de la casete de inserción (datos no mostrados). Para aplicaciones especialmente sensibles como la construcción de vectores knockin, donde no se toleran las mutaciones en las regiones de exón, la HA del casete de inserción se puede acortar (50-120 pb) para evitar problemas asociados con oligos largos. El casete de inserción también se puede dejar phosphorothioated no modificada o dual (donde el conocimiento de la dirección de la replicación no está disponible). Pero multiplexación en estos casos todavía requiere mucho protegidos HA plásmidos subclonación. Una advertencia de esta estrategia particular es la disminución de la eficiencia de multiplexación que potencialmente pueden afectar SPI clonación en diferentes loci. La longitud de la casete de inserción y el plásmido subclonación es otro parámetro importante en el SPI clonación. Moléculas de ADN más grandes electroporar menos eficiencia y el efecto es acumulativo, dada la rerequisito de introducir todos los casetes en la misma célula (datos no mostrados). La multiplexación es más eficiente con casetes de inserción más pequeños. Fragmentos de ADN mayores de 3 kb también poner un límite en el procesamiento de ssDNA Roja mediada, que es más eficiente hasta 3 kb 30. Casetes Inserción de más de 3 kb son duales resecado y recombinan menos eficiente a través de una vía independiente beta 20. Por lo tanto, la detección de colonias suficientes para identificar el clon correcto se vuelve importante en estos casos. Una mayor duración de la post electroporación recombinación también aumenta las posibilidades de recuperación del clon correcto en ejercicios difíciles SPI. Hasta cuatro cassettes pequeños (&lt;1,5 kb) pueden ser insertados simultáneamente con el proceso de SPI, aunque la eficiencia de multiplexación disminuye con cada casete adicional (datos no mostrados). Sin embargo, esto refleja el resultado de un experimento óptima SPI y es recomendable tener en cuenta los límites de multiplexación cuando se utiliza muchas grandes cassettes. </p&gt; El desarrollo de herramientas de edición del genoma como agrupados interspaced regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) Sistema endonucleasa -cas9 ha permitido la creación de nuevas modificaciones del genoma y ha llevado a la ingeniería del genoma más eficiente 36. Sin embargo, estas nuevas tecnologías han complementado vectores de genes objetivo en lugar de ellos suplantado. Se prevé que el sistema de CRISPR-cas podría sustituir a la selección de antibióticos y perfeccionar el protocolo recombineering multiplex.

El desarrollo de tecnologías de segmentación de genes ha permitido la construcción de líneas celulares y modelos de ratón para investigar diferentes sistemas biológicos 1-3. Una primera etapa clave en la modificación de una secuencia genómica es el diseño y la construcción de un gen vector dirigido 4. Vectores de abordaje son construcciones de plásmidos que llevan el alelo de interés que contiene las modificaciones deseado (s) flanqueados por un marcador de selección (por ejemplo, neomicina), y las regiones genómicas largos requeridos para la recombinación homóloga eficiente en células de mamífero 5. Modificación del gen preciso se consigue mediante la introducción del vector de orientación en células madre embrionarias (ES) 6 o células somáticas 7, con lo cual la recombinación homóloga entre tramos idénticos de secuencia de ADN en el vector de direccionamiento y los resultados locus genómico en la transferencia de la modificación prevista al genoma mediante conversión génica 8. Tal modified células ES pueden ser inyectadas en blastocistos de ratón para producir descendencia (quimeras) que luego pueden transmitir estos alelos modificados a través de la línea germinal 9. Una ruta alternativa para producir ratones transgénicos implica la microinyección de un vector de expresión de genes en cigotos de ratón unicelulares, que conduce a la integración aleatoria del vector en el genoma del ratón 10. Los métodos tradicionales de la construcción del vector se han basado en convencional &#39;cortar y pegar&#39; clonación usando enzimas de restricción y ligasas de ADN para clonar el marcador de selección diferente y fragmentos genómicos en un esqueleto del vector. Sin embargo, un factor limitante inherente de clonación tradicional es el posicionamiento y la elección de los sitios de restricción, especialmente con secuencias de ADN más largos. Esto a menudo requiere múltiples etapas de subclonación y también introduce las secuencias de ADN extrañas en el vector, que a menudo conduce a una menor eficiencia de la orientación de genes. Recombinería (eng recombinogenicineering) es una tecnología de la ingeniería de ADN que supera estas limitaciones mediante el uso de recombinación homóloga (HR) mediada por las proteínas de recombinación del fago en E. coli células 11,12. Dado que cualquier región de una secuencia homóloga puede servir como un sustrato de recombineering, se eliminan las limitaciones de disponibilidad de sitios de restricción. Las secuencias de ADN de gran tamaño pueden ser modificados sin problemas directamente in vivo, por tanto, también la preservación de su integridad estructural 13. Recombinería es muy eficiente con homologías cortas (50 pb) 14 y por lo tanto brazos de homología (HA) pueden ser convenientemente incorporados en las secuencias de oligo sintéticos. En un experimento típico recombinería, un oligo o un fragmento de ADN bicatenario (dsDNA) contiene HA se electroporación en recombinería E. competente células de E. coli que contienen el objetivo situado ya sea en el cromosoma o en un plásmido 15. El potencial de recombinación es conferida por la expresión inducible de la rec Redombination proteínas del fago 16,17 o las proteínas RECET del profago rac 18. La exonucleasa Red / RecE convierte dsDNA lineales a un ADN monocatenario (ssDNA) intermedio, que luego se une por su socio, Red / RecT, una proteína de recocido de una sola hebra (SSAP) 19. El recocido de una larga ssDNA o un corto oligo a su secuencia diana complementaria se produce en el capítulo menos del tenedor de replicación y conduce a la incorporación de la secuencia en el sitio diana. Retardamien hebra ssDNA recombinación es la base de la alta eficiencia de recombineering y puede ser descrita por el &quot;beta&quot; modelo de recombinación 20,21. Un flujo de trabajo típico recombinería para construir un vector de orientación de genes involucra cualquiera de las dos siguientes rutas. Una ruta implica la subclonación de la región genómica deseada de un clon BAC de ratón en un plásmido seguido de la inserción secuencial de sitios de recombinación LoxP, un marcador de selección <shasta&gt; 22 etc., o la ruta alternativa implica la orientación del BAC locus genómico con los diferentes elementos de la orientación del vector de múltiples rondas de recombinería 10,23 y después subclonando el locus modificado en un plásmido mediante reparación brecha clonación 24,25. Variaciones sobre este tema se han utilizado en diferentes tuberías recombinería de alto rendimiento como parte de los programas de producción de gran ratón 26,27. Sin embargo, estos procedimientos implican etapas complicadas y largas, requieren el uso de vectores especializados y E. coli cepas (por ejemplo, células que expresan Cre) y utilizar una o más etapas intermedias de purificación de ADN vector y re-transformación (Tabla 1). Subclonación de inserción más (SPI) es una técnica recombineering novela que combina beta recombinación y reparación brecha de la clonación en un único proceso (Figura 1). Montaje vector SPI es simple, rápida y flexible y ofrece una mejora significativa en recombi estándaringe- se acerca (Tabla 1). Aquí, nos demuestran la facilidad y utilidad de usar SPI para diferentes aplicaciones en la construcción del vector con un énfasis particular en la construcción de diseños de vectores no estándar y desafiantes. Los casos de prueba incluyen la construcción de un vector knockin indicador fluorescente, una expresión de la proteína etiquetada vector knockin dual, un fluorescente reportero vector BAC y un vector knockout condicional. Estos examinaron diversamente el requisito de localizar un receptor de superficie celular, purificar un complejo de proteína nuclear o condicionalmente ablación de la expresión de un gen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1597">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:216px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:941px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:315px;">Antibiotics except Zeocin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:216px;">Ampicillin, A9518-5G; 
			Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; 
			Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Zeocin</td>
			<td style="width:127px;">Invivogen:&#160;</td>
			<td style="width:216px;">ant-zn-1</td>
			<td>Zeocin is also available from Life technologies/Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">C57BL/6 BAC clones</td>
			<td style="width:127px;">CHORI: https://bacpac.chori.org/&#160;</td>
			<td style="width:216px;">RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries</td>
			<td>129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:315px;">KOD hotstart DNA polymerase system</td>
			<td style="width:127px;">Millipore: https://www.merckmillipore.com</td>
			<td style="width:216px;">71086-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:315px;">L-Arabinose</td>
			<td style="width:127px;">Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:216px;">A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:315px;">Long oligos</td>
			<td style="width:127px;">IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com</td>
			<td style="width:216px;">IDT Ultramers or Gene Link long oligos</td>
			<td>PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">MinElute PCR purification kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen: http://www.qiagen.com&#160;</td>
			<td align="right" style="width:216px;">28004</td>
			<td>Minimum elution PCR purifications kits are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">QIAPrep Spin Mini Prep kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen: http://www.qiagen.com&#160;</td>
			<td align="right" style="width:216px;">27104</td>
			<td>Silica column or similar matrix kits are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:127px;">NEB: https://www.neb.com</td>
			<td style="width:216px;">DpnI: R0176L</td>
			<td>See NEB website for a list of RE.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcloning plus insertion (spi) - a novel recombineering method for the rapid construction of gene targeting vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a &#8216;targeting&#8217; vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.

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Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term &#8216;subcloning plus insertion&#8217;, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

Subclonación Plus Inserción (SPI) - Un nuevo método recombinería para la rápida construcción de la orientación de genes Vectores

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

subcloning-plus-insertion-spi-novel-recombineering-method-for-rapid

Research

JoVE Journal

Biology

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

16.3K vistas.  University of Leicester. Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.