We thank Dr&#8217;s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.

1. Computacional Identificación de Potenciales pequeños Molécula Tapado Grupos Nota: En principio, una variedad de atraque o farmacóforos métodos de búsqueda puede ser utilizado para predecir los grupos potenciales de tapado. El propósito principal de estudios computacionales en REPLACE es identificar pequeñas moléculas que conservan las características y las interacciones de los aminoácidos que están sustituidos. <ol><li> Validación del protocolo de acoplamiento 14 LigandFit </li></ol> Nota: En los estudios anteriores, el método de acoplamiento (LigandFit 15, un módulo en la suite de programa de modelado molecular, Descubrimiento Studio 3.0) fue validado para asegurarse de que este algoritmo es suficiente para reproducir los modos de unión de conocida NCAPs y para demostrar que los resultados obtenidos para compuestos desconocidos son predictivos 14. <ol style="margin-left: 40px;"><li> El uso de los siguientes pasos (1,2 - 1,5), identificar los parámetros óptimos para LigandFit de la siguiente manera: en PLP1rejilla para la generación de ener- pose, minimización de poses generados y la función de puntuación PLP1 para el análisis de poses. </li><li> Con el fin de limitar las conformaciones obtenidas y posicionar ligandos apropiadamente para la formación del enlace covalente en el péptido capsulado, establecer los átomos de nitrógeno de indol y nitrógeno de la amida de Trp217 y Gln254, respectivamente, como filtros de interacción para el enlace de hidrógeno. </li><li> Diseño y atracar una biblioteca de alternativas de fragmentos en el CDK2 / ciclina A del receptor (2UUE). Dar prioridad a los grupos de tapado potenciales para la síntesis y el abastecimiento comercial basado en la puntuación PLP1, interacciones con filtros de interacción y complementariedad con el CBG. Los diversos pasos requeridos para LigandFit de acoplamiento son los siguientes. </li></ol><ol start="2"><li> Preparación de receptor de sitio de unión 14 <ol><li> Importe el CDK2 / ciclina A estructura cristalina (id pdb: 2UUE) en una ventana de visualización en el software. Esta estructura contiene la FLIP previamente identificada 5-metil-1-fenil-1H-1, 2,4-triazol-3-carboxamido (3,5-DCPT) rliF unido a la ranura de ciclina (Figura 3). </li><li> Eliminar o mantener en su lugar los residuos rliF (C-terminal). Cuando se retiene la secuencia del péptido, utilizar el grupo amino N-terminal del péptido como un filtro de interacción para el ligando. De las &quot;interacciones receptor-ligando&quot; herramientas, crear una esfera alrededor de la N-cap 3,5 DCPT de Show / Hide sitio esfera. Se crea la esfera para definir la región activa en el sitio de unión donde se permiten las interacciones ligando-receptor que se produzca durante la unión. </li><li> Definir el sitio de unión más lejos de la &quot;encontrar sitio como volumen de ligando seleccionado&quot; y eliminar el ligando 3,5-DCPT de la proteína. Llevar a cabo este paso para definir el volumen de unión dentro de la esfera creada. </li><li> Establezca las indol átomos de nitrógeno y nitrógeno amida de los residuos Trp217 y Gln254 como filtros de interacción para el enlace de hidrógeno. Establezca los filtros de interacción de manera que sólo las poses que INTERACT con los átomos de residuos establecidos será filtrado durante el proceso de acoplamiento, por tanto, la preservación de las interacciones importantes en las poses atracados. </li></ol></li><li> Preparación de ligandos 14 <ol><li> Diseño de una biblioteca de 100 posibles grupos de tapado sobre la base de criterios incluyendo el peso molecular inferior a 500, la presencia de un grupo carboxilato para la ligación con el péptido truncado y la inclusión de grupos hidrófobos apropiados (grupo fenilo sustituido) para interacción de van der Waals en el bolsillo secundaria como muestra en la Tabla 1. </li><li> Seleccione anillos heterocíclicos para imitar las interacciones de unión de hidrógeno péptido con Trp217 y sustituyentes incluido para reemplazar las interacciones ion-emparejamiento de cadenas laterales básicas del HAKRRLIF. Acoplar los ligandos como las respectivas moléculas de aldehído de manera que el oxígeno del carbonilo puede interactuar con el átomo de nitrógeno de la amida de Gln254 similar al esqueleto peptídico en el péptido parental (Tabla 1). </li><li> Antes de docrey, minimizar ligandos diseñados para una conformación de baja energía y prepararse en un estado de ionización apropiado usando el protocolo &quot;Preparar ligandos&quot;. Dibujar y exportar estos potenciales tapas N en el formato de archivo .sdf en ChemDraw para una hoja de cálculo antes de ser importados en el software. Nota: Preparar protocolo ligandos se utiliza para minimizar todos los ligandos para acoplar a sus estados de energía más bajos y los cargos de ionización se aplicaron a los átomos aplicables. Los parámetros por defecto se utilizan para este paso. </li></ol></li><li> Docking de los ligandos en el Ciclina A Groove 14 <ol><li> Seleccione la rutina LigandFit de receptor-ligando conjunto protocolo interacciones del software. Utilice el receptor y los ligandos preparados como entrada para este protocolo. </li><li> Por estas carreras seleccione PLP1 como red de energía, especifican que plantea sea la energía minimizada y que el número de poses generados como 10. Deje todos los otros parámetros a los valores predeterminados. Nota: es LigandFitun método de acoplamiento que puede identificar y generar poses de alta complementariedad y la afinidad potencial con el sitio activo de una proteína utilizando un filtro de comparación de forma basada en que se combina con un algoritmo de búsqueda Monte Carlo conformacional. La rejilla de energía utilizada por el programa de acoplamiento es el campo de fuerza para generar interacciones ligando-receptor y poses potenciales. PLP1 potencial lineal por tramos que prioriza específicamente interacciones de enlace de hidrógeno y donde se le asigna el tipo de átomo de PLP para cada no hidrógeno átomo ligando o átomo receptor no hidrógeno. </li></ol></li><li> Analisis de resultados <ol><li> En el primer caso, la pantalla se plantea en el programa visualizador y luego ordenar por valores de la puntuación PLP1 descendente. Utilice funciones de puntuación tales como PLP1 para estimar la afinidad de unión de un ligando acoplado sobre la base de un ligando candidato pose de la geometría y la interacción no covalente con la estructura de receptor diana. Nota: En este caso, la función de puntuación PLP1 resultó give los mejores resultados ya que incluye una estimación de enlaces de hidrógeno. </li><li> Analizar visualmente el 25% superior de las poses anotados para 1) superimposability con el grupo tapado conocido (que tiene una desviación del cuadrado medio relativo (RMSD) valor inferior a 2 a), 2) cumplió filtros de interacción y 3) la complementariedad visual con la ranura de la ciclina . Se acepta en que un correctamente acoplado plantear (en comparación con una estructura experimental) tiene un valor de RMSD &lt;2 Å. </li><li> Examine poses para complementariedad visual, que se define como tener llenado eficiente del bolsillo de unión de una manera que sea consistente con las relaciones estructura-actividad conocidos. Filtros de interacción se establecen para incluir restricciones de átomos que requieren contactos intermoleculares se sabe que son críticos para la unión y / o son requeridos para posicionar el grupo de terminación potencial en la geometría correcta para la formación del enlace amida. Tres ejemplos de poses atracados de potenciales grupos N-tapado haciendo enlaces de hidrógeno con Interaction filtros se muestran en la Figura 4. </li></ol></li></ol> 2. Síntesis y Caracterización de los grupos potenciales N -capping <ol start="1"><li> Síntesis de grupos N-taponado. </li><li> Para la síntesis, utilice todos los comerciales materiales de partida, disolventes y reactivos como se obtiene. Sintetizar potenciales grupos N-tapado por la química orgánica sintética convencional (Figura 5 12,13 para un ejemplo). </li><li> Realizar la cromatografía en capa fina (TLC) sobre gel de sílice para monitorear reacciones. <ol><li> Se disuelve el material de partida y mezcla de reacción (1 mg) en la fase móvil y localizarlos en la placa de TLC usando tubos capilares. </li><li> Coloque la placa de TLC en la cámara que contiene la fase móvil (acetato de etilo y hexano en una proporción 35:65). Una vez que la fase móvil alcanza 90% de la placa de TLC, retirar y secar la placa. </li><li> Utilice la luz ultravioleta para detectar las mezclas de materiales de partida y de reacción en forma de manchas visibles. Californiacular el R f de todos los puntos (relación de la distancia recorrida por el lugar y la fase móvil). Nota: La reacción se completa cuando no hay mancha visto en el R f del material de partida. </li></ol></li><li> Después de la finalización de la reacción, la mezcla de reacción mediante la colocación en un embudo de decantación y lavado con ácido acuoso o solución de base según sea apropiado. Recoger el disolvente orgánico, se evapora en evaporador rotatorio y se seca el producto bruto obtenido a vacío. </li><li> Disolver 500 mg de producto en bruto en el 3-5 ml de disolvente adecuado y añadir a un 1 g de sílice o RP18 samplet y seco bajo aire. Coloque el samplet que contiene el producto bruto en los cartuchos Flash / RP SNAP de sílice y se purifica el material crudo mediante cromatografía flash de alto rendimiento automatizado (de acuerdo con el protocolo del fabricante) empleando un g columna SNAP 100 con una carrera de gradiente a partir de 6% de acetato de etilo: 94 % de hexanos a 50% de acetato de etilo y 50% de hexanos más de15 volúmenes de columna. </li><li> Secar el producto purificado recogido en el disolvente de cromatografía flash utilizando un evaporador rotativo por evaporación de todo el disolvente a sequedad y secar aún más el producto a vacío para eliminar todos los disolventes residuales. Realizar la caracterización del producto purificado por RMN, MS y HPLC analítica. <ol><li> Para 1 H RMN y 13 C NMR, pesar aproximadamente 10 mg de la muestra purificada, se disuelven en un disolvente deuterado apropiado, y transferir el contenido a un tubo de NMR seco para el registro de los espectros de RMN 2,14. </li><li> Registre el 1H RMN y 13 C espectros de RMN con un alto campo RMN Espectrómetro (mínimo 300 MHz). Adquirir los espectros de masas utilizando un QTOF (Tandem cuádruple 1 hora de vuelo espectrómetro de masas), ionización por electrospray (ESI) o unos 70S VG (doble centrándose espectrómetro de masas de sector magnético, EI) 2,14. </li><li> Analizar la pureza de los productos por HPLC con un detector de red de diodos y equipado conun C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 micras en la columna para análisis. Utilice una corrida de gradiente a partir de 100% de agua (ácido trifluoroacético al 0,1%) a 60% de acetonitrilo (ácido trifluoroacético al 0,1%) durante 30 min y mantener el gradiente de 4 min. Extraer los cromatogramas a 226 y 254 nm 2,14. Nota: purezas analíticos de los compuestos evaluados fueron&gt; 95%. </li></ol></li></ol> 3. Síntesis en fase sólida para la Generación de lanza 2 <ol start="1"><li> Síntesis del voltea N-coronado <ol><li> Ensamble compuestos peptídicos N coronadas de a través de métodos estándar de síntesis en fase sólida utilizando los siguientes pasos. <ol><li> Activar 5 equivalentes de aminoácido C-terminal (Fmoc-Phe) en 4.4 equivalentes de O -Benzotriazole- N, N, N &#39;, N&#39; tetrametil-uronio-hexafluoro-fosfato (HBTU, 221,93 mg) en 2 ml de DMF durante 5 min. Cargar la mezcla HBTU Fmoc-Phe a la resina Rink utilizando 6 equivalentes de diisopropiletilamina (DIPEA, 103,13mg) durante 1 hora a RT. </li><li> Eliminar el grupo protector Fmoc del residuo C-terminal utilizando 20% de piperidina en 3 ml de DMF durante 10 min. Aminoácidos posteriores de los pares (por ejemplo, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-pmc) paso a paso. En cada paso, par 5 equiv del siguiente aminoácido usando 6 equivalentes de DIPEA (103,13 mg) y 4,4 equivalentes de HBTU (221,93 mg) en 2 ml de DMF durante 1 hora a RT. </li><li> Aplicar ciclos de lavado (5 x 10 ml de DMF + 5 x 10 ml de DCM) después de las etapas de acoplamiento de aminoácidos Fmoc y de desprotección descritos anteriormente. Después del montaje de péptidos, grupos usando 6 equivalentes de DIPEA (103,13 mg) y 4,4 equivalentes de HBTU (221,93 mg) par N-taponado en 2 ml de DMF durante 1 hora a RT. </li><li> Una vez finalizado el montaje de péptidos, el tratamiento de la mezcla de reacción con 2 ml de la mezcla de escisión (90: 5: 5 TFA / H 2 O / TIPS) O / N para eliminar los grupos protectores de cadena lateral, y pegue voltea de la resina. Se tritura el producto resultante con éter dietílico frío para precipitar y if concentrado necesario en un evaporador rotatorio. </li></ol></li></ol></li><li> Síntesis de Flips-C-coronadas de cubiertas N <ol><li> Pesar y disolver el péptido Arg-Leu N-terminal tapado y protegido (16,1 mg, 0,02 mmol) en diclorometano, y añadir [4- (3-clorofenoxi) piridin-2-il] metanamina (C-cap), junto con O - benzotriazol N, N, N &#39;, N&#39; tetrametiluronio (HBTU; 16,7 mg, 0,02 mmol) y N, N-diisopropiletilamina (DIPEA; 6,5 mg, 0,02 mmol). </li><li> Agitar y monitorear la reacción a temperatura ambiente hasta que la TLC / HPLC indica el consumo completo del material de partida. Después de la finalización de la reacción, se concentra la mezcla de reacción en bruto usando un evaporador rotatorio y luego partición entre acetato de etilo y agua. </li><li> Separar la fase acuosa y la capa orgánica; se lava la capa orgánica con NaOH 1 N, HCl 1 N, y salmuera. Se seca la capa orgánica con aproximadamente 1 g de sulfato de sodio y se concentra el producto en el evaporador rotatorio. Finally tratar el producto O / N con la mezcla de división (95: 2,5: 2,5 ácido trifluoroacético / H2O / TIPS) para la desprotección. </li><li> Se tritura el producto resultante con éter dietílico frío y si es necesario concentrado en el evaporador rotatorio a sequedad completa a fin de eliminar todo el disolvente. Secar aún más el producto al vacío para eliminar todos los disolventes residuales. </li></ol></li><li> Purificación y caracterización de volteretas <ol><li> Purificar voltea crudo usando métodos preparativos semi HPLC en fase inversa. Liofilizar las voltea purificadas y caracterizar su masa molecular mediante espectrometría de masas 2,14. </li><li> Determinar la pureza analítica de los voltea por HPLC con un detector de red de diodos y equipado con una C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 micras columna. Utilice un método de gradiente partiendo de 95% H 2 O (0,1% de ácido trifluoroacético) / 5% de acetonitrilo (0,1% de ácido trifluoroacético) a 35% H 2 O (0,1% de ácido trifluoroacético) / 65% de acetonitrilo (0,1% trifluoroaceácido tic) durante 30 minutos y mantener el gradiente de 4 minutos. Extracto de cromatogramas a 226 y 254 nm. </li></ol></li></ol> 4. Ensayo de unión de polarización de fluorescencia para la determinación de unión competitiva 2,14 <ol start="1"><li> Realizar el ensayo en placas utilizando el siguiente procedimiento negro 384 pocillos (138 l). </li><li> Diluir las muestras, péptidos trazador (4 nM), y complejos de quinasa (CDK2 / ciclina A - 18 g / ml, CDK4 / ciclina D - 37 mg / ml) a las concentraciones requeridas en tampón de ensayo (25 mM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% de Nonidet P-40, ditiotreitol 1 mM (DTT). </li><li> A cada pocillo de la placa de 384 pocillos, añadir: 5 l de CDK4D1 o CDK2CA (0,3 mg / complejo bien purificada recombinante humana quinasa), la solución del compuesto 5 l, 5 l de 30 nM péptido trazador (fluoresceinilo-Ahx-Pro-Val Lys-Arg-Arg-Leu (3ClPhe) Gly o péptido trazador fluoresceinilo-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly). Utilice 5 l de cada DMSO (6%), buffer, trazador y 5 l DMSO (6%), complejo quinasa, trazador como pocillos de control </li><li> Después de la adición de los todos los componentes, centrifugar la placa a 500 rpm durante 1 min (41,16 xg) a TA y luego se incuba la placa con agitación durante 45 min a TA. Usando un lector de placa multimodo y equipado con detector de 485 nm / 535 nm de excitación / emisión y filtros de un espejo dicroico leer la intensidad de fluoresceína de cada pocillo en la placa. </li><li> Calcular la media relativa de polarización (MP) para todas las muestras de ensayo utilizando la ecuación aparece más abajo. Determine los valores de IC50 por regresión logarítmica correlacionando mps relativos y probar concentraciones. </li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Andrews, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REPLACE:+a+strategy+for+iterative+design+of+cyclin-binding+groove+inhibitors.">REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors.</a> Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Non-ATP+Competitive+CDK/Cyclin+Groove+Inhibitors+through+REPLACE-Mediated+Fragment+Assembly.">Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly.</a> J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).</li><li>McInnes, C., Bernstein, M., Desai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+29.">Chapter 29.</a> Annual Reports in Medicinal Chemistry. 47, 459-474 (2012).</li><li>Bower, J. F., Pannifer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fragment-based+technologies+to+target+protein-protein+interactions.">Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions.</a> Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).</li><li>Makley, L. N., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+number+of+'druggable'+targets:+non-enzymes+and+protein-protein+interactions.">Expanding the number of 'druggable' targets: non-enzymes and protein-protein interactions.</a> Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).</li><li>Walensky, L. D., Bird, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrocarbon-Stapled+Peptides:+Principles,+Practice,+and+Progress.">Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress.</a> J Med Chem. , (2014).</li><li>Shapiro, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin-dependent+kinase+pathways+as+targets+for+cancer+treatment.">Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment.</a> J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).</li><li>Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+dependant+kinase+inhibitors:+Useful+targets+in+cell+cycle+regulation.">Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation.</a> Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).</li><li>Morphy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectively+nonselective+kinase+inhibition:+striking+the+right+balance.">Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance.</a> J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).</li><li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+transformed+cells+by+cyclin/cyclin-dependent+kinase+2+antagonists.">Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).</li><li>Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-noncompetitive+inhibitors+of+CDK-cyclin+complexes.">ATP-noncompetitive inhibitors of CDK-cyclin complexes.</a> ChemMedChem. 4, 19-24 (2009).</li><li>Kontopidis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+cyclin+groove+recognition:+complex+crystal+structures+and+inhibitor+design+through+ligand+exchange.">Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange.</a> Structure. 11, 1537-1546 (2003).</li><li>McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomimetic+design+of+CDK+inhibitors+targeting+the+recruitment+site+of+the+cyclin+subunit.">Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit.</a> Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).</li><li>Premnath, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment+based+discovery+of+arginine+isosteres+through+REPLACE:+towards+non-ATP+competitive+CDK+inhibitors.">Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors.</a> Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).</li><li>Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LigandFit:+a+novel+method+for+the+shape-directed+rapid+docking+of+ligands+to+protein+active+sites.">LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites.</a> J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).</li><li>Mendoza, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cyclin-dependent+kinase+2/cyclin+A+antagonists+that+differ+from+ATP+site+inhibitors+block+tumor+growth.">Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth.</a> Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).</li><li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cell+growth+and+survival.+Modifications+to+the+tetrazolium+dye+procedure+giving+improved+sensitivity+and+reliability.">Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.</a> J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).</li><li>Zheleva, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+potent+p21(WAF1)-derived+peptide+inhibitors+of+CDK-mediated+pRb+phosphorylation:+delineation+and+structural+insight+into+their+interactions+with+cyclin+A.">Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A.</a> The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).</li><li>Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein-protein+interactions+as+an+anticancer+strategy.">Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).</li><li>Thayer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+peptides.">Improving peptides.</a> Chemical and Engineering News. 89, 13-20 (2011).</li><li>Yin, H., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+targeting+protein-protein+interactions+with+synthetic+agents.">Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).</li><li>Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+and+drug+discovery+for+protein-protein+interactions.">Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions.</a> Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).</li><li>Cannon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmaceutics+and+drug+delivery+aspects+of+heme+and+porphyrin+therapy.">Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy.</a> J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI&#8217;s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and...

En este artículo, un estudio de caso de la aplicación de la (reemplazo por alternativas ligando parciales utilizando computacional enriquecimiento) SUSTITUIR estrategia para convertir inhibidores peptídicos de las interacciones proteína-proteína en más moléculas farmacéuticamente relevantes se describe 01.03. Mientras que los IBP son una fuente rica pero poco explotado de posibles objetivos de drogas, las metodologías existentes son claramente insuficientes para hacer estos ampliamente accesible. Las estrategias actuales incluyendo fragmento diseño basado en 4, cribado de alto rendimiento 5 y péptidos grapados 6 han proporcionadas avances, sin embargo, estos son, en muchos casos ineficaces. Como resultado, se requieren más progreso y enfoques más eficientes. REEMPLAZAR ha sido plenamente validado en el desarrollo de inhibidores de la quinasa que han mejorado las propiedades similares a las drogas y que tienen potencial de desarrollo como agentes terapéuticos antitumorales. Esta estrategia se ejemplifica en el desarrollo de inhibidores no de ATP de la célulaCDK ciclo e implica los siguientes: 1) la obtención de información estructural en 3D en las interacciones de HAKRRLIF / RRLIF con la unión de la ciclina ranura; 2) la determinación de los determinantes de unión importantes para la interacción de péptidos; 3) el truncamiento del péptido N-terminal que contiene uno o más determinantes de unión; 4) identificación computacional de potenciales de moléculas pequeñas alternativas (alternativas ligando parciales Plas) para la parte truncada del péptido y que retienen las interacciones clave del péptido parental; 5) la síntesis o el abastecimiento comercial de PLA predijeron para unirse ávidamente con el sitio sub previamente ocupado por el residuo (s) péptido borrado; 6) la síntesis de hojea la ligadura de las mejores PLA al péptido truncado mediante síntesis en fase sólida; 7) las pruebas de lanzamientos en una unión in vitro o ensayo funcional (polarización de la fluorescencia en el contexto / ciclina CDK), seguido de una caracterización adicional en un ensayo de viabilidad celular. Una representación esquemática de REEMPLAZAR strategy se muestra en la Figura 1. En este artículo, se discuten las iteraciones de la estrategia REPLACE y la aplicación de CDK2 / ciclina A se describe en detalle. CDK se cree que están desregulado directamente o indirectamente en la mayoría de los tumores y por lo tanto se consideran objetivos farmacológicos de cáncer apropiada 7. CDK requieren asociación con ciclinas para la activación completa y posteriormente fosforilan proteínas clave que intervienen en la regulación del ciclo celular 8. Los dos grupos principales de CDK son los isotipos que controlan los puntos de control del ciclo celular [G1 / S (CDK4 / ciclina D, CDK6 / ciclina D y CDK4 / ciclina E), fase S (CDK2 / ciclina A) y G2 / M (CDK1 / ciclina B)] y los reguladores de la ARN polimerasa a través de la fosforilación (CDK7 / ciclina H, CDK8 / ciclina C, CDK9 / ciclina T). Un paso clave en la progresión de la fase S se produce cuando el factor de transcripción E2F1 forma un complejo con la proteína DP que luego se une al ADN e inicia la transcripción génica. CDK2 / ciclina A se requiere para neutralizar la transcripción E2F1actividad a través de la fosforilación lo que conduce a la liberación del complejo E2F1-DP y su posterior degradación. Se cree que la inhibición de CDK2 / ciclina A para mantener E2F1 en su estado unido de ADN conduce a la activación persistente. El nivel resultante de E2F-1 actividad superará el umbral requerido para inducir la apoptosis independiente de p53, por tanto, lo que sugiere una estrategia terapéutica. Debido a p53 desregulado y las vías de pRb, los altos niveles de E2F-1 se producen con frecuencia en las células cancerosas y la inhibición de CDK2 / ciclina A debería conducir a la apoptosis selectiva en tumores y puede ser considerado como un objetivo de cáncer validado 7. Clínicamente inhibidores de CDK investigados se dirigen al sitio de unión ATP altamente conservado que conduce a cruzar la reactividad entre las proteínas superior a 500 quinasas en la kinome humana y potencialmente dando lugar a los efectos secundarios y la toxicidad 9. Un enfoque alternativo es-ATP no inhibición competitiva apuntando contratación sustrato a través de la CBGpresentes en la subunidad reguladora positiva ciclina y que es por lo tanto distinta y distante de ATP sitio de unión a 10,11. El CBG es principalmente un surco hidrófobo presente en la ciclina A, ciclina D y ciclina E y se ha demostrado para reconocer una secuencia de consenso que se encuentra en sustratos y supresores de tumores. Como un péptido aislado, el motivo de unión de ciclina (CBM) se une a la CBG y se ha demostrado que inhiben la actividad quinasa de las CDK del ciclo celular. El CBM ha sido optimizado para un octapéptido (HAKRRLIF, CDK2 / ciclina A IC 50 0,07 ± 0,02 mM, CDK4 / ciclina D, IC 50 0,88 ± 0,34 mM) y además truncada a un pentapéptido que representa un buen compromiso entre el peso molecular para las drogas semejanza y la potencia (RRLIF, CDK2 / ciclina A IC 50 1,01 ± 0,17 mM, CDK4 / ciclina D, IC 50 25,12 ± 2,97 M) 12,13. Los CBGS consisten en una gran primaria y secundaria más pequeño bolsillo hidrofóbico que están puenteados por un acidiregión c (incluye Glu220, Glu224 y Asp283). Los determinantes de unión clave de HAKRRLIF incluyen la interacción de Ala2 con el bolsillo hidrofóbico secundaria, el emparejamiento de iones de hidrógeno y lazos de Lys3, Arg 4 y Arg5 con la región ácida y un alto grado de complementariedad de Leu6 y Phe8 con el sitio lipófilo primaria. Además, numerosos enlaces de hidrógeno son aportados desde el esqueleto del péptido, mientras que Ile7 actúa como un residuo espaciador permitir el contacto óptimo con el bolsillo primaria. El modo de unión y las interacciones de HAKRRLIF con CBG se muestra en la Figura 2. Focalización de la interacción proteína-proteína CBM / CBG inhibe la actividad quinasa de CDK2 / ciclina A, CDK2 / ciclina E &amp; CDK4 / ciclina D y esto debe dar lugar a E2F1 apoptosis mediada de las células cancerosas sin afectar a las células normales 7. Aunque CBM péptidos derivados son inhibidores eficaces de las CDK del ciclo celular, es poco probable que sean útiles como fármacos debido a su metabólicala inestabilidad y la falta general de la permeabilidad celular. Con este fin, hemos aplicado la estrategia REEMPLAZAR el fin de convertir estos inhibidores peptídicos potentes en más compuestos similares a las drogas para un mayor desarrollo de terapias antitumorales que explotan E2F1 desregulado través de CDK2 / ciclina A inhibición. El siguiente protocolo se resume el trabajo que se ha completado en la aplicación de REEMPLAZAR a la ranura de ciclina. En el primer caso, se identificaron reemplazos grupo de terminación similares a las drogas para el tetrapéptido N-terminal de HAKRRLIF. Además las mejoras en estos grupos fueron investigados en un estudio de validación adicional para REEMPLAZAR. También se presentan los resultados representativos de estos estudios.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Computational Chemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelyrs Discovery studio 3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Optiplex Workstations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Organic Chemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5&#956;m column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Polarization Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 micro well plates, ,&#160; Micro pipets,&#160;</td>
			<td>Grenier Bio-one</td>
			<td>110256602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)</td>
			<td>BPS Bio Sciences</td>
			<td>40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 nM HEPES</td>
			<td>CALBIOCHEM</td>
			<td>375368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>127838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>N3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70c freezer</td>
			<td>Revco (Ultima II)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTX880 multimode detector&#160; fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, &#160;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP,&#160; MTT reagent,</td>
			<td colspan="2">Fisher, Life technology, Alfa Aesar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Heamocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70c freezer</td>
			<td>Revco (Ultima II)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo electron corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4-8C</td>
			<td>Isotemp Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter.</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of inhibitors of protein-protein interactions through replace: application to the design and development non-atp competitive cdk inhibitors

REPLACE es una estrategia única desarrollada para orientar con mayor eficacia las interacciones proteína-proteína (IBP). Su objetivo es ampliar el espacio disponible objetivo de drogas, proporcionando una mejor metodología para la identificación de inhibidores para estos sitios de unión y que representan la mayoría de los posibles objetivos farmacológicos. El objetivo principal de este trabajo es proporcionar una visión metodológica de la utilización y aplicación de la estrategia REEMPLAZAR que implica enfoques de química computacional y sintéticos. Replace es ejemplificado a través de su aplicación al desarrollo de quinasas no competitivo de ATP de ciclina (CDK) dependientes inhibidores como agentes terapéuticos anti-tumorales. CDK están desreguladas frecuencia en el cáncer y por lo tanto se consideran como objetivos importantes para el desarrollo de fármacos. La inhibición de CDK2 / ciclina A en la fase S se ha informado de promover la apoptosis selectiva de las células cancerosas de una manera independiente de p53 a través de la vía de E2F1. Focalización de la interacción proteína-proteína en la bindin ciclinag ranura (CBG) es un enfoque que permitirá a la inhibición específica de ciclo celular sobre las CDK transcripcionales. El CBG es reconocido por una secuencia de consenso derivada de CDK sustratos y proteínas supresoras de tumores denominado el motivo de unión (CBM) de ciclina. El CBM previamente ha sido optimizado para un octapéptido de p21Waf (HAKRRIF) y luego más truncado para un pentapéptido retener suficiente actividad (RRLIF). Los péptidos en general no están celular permeable, son metabólicamente inestable y por lo tanto el (reemplazo parcial con el ligando Alternativas a través Computacional Enriquecimiento) SUSTITUIR estrategia se ha aplicado con el fin de generar los inhibidores más similares a las drogas. La estrategia comienza con el diseño de péptidos inhibidores fragmento ligado (vueltas) que inhiben selectivamente ciclo celular complejos CDK / ciclina. Voltea se generaron mediante la sustitución de los residuos de forma iterativa HAKRRLIF / RRLIF con el fragmento como pequeñas moléculas (grupos de tapado), a partir de la N-terminal (NCAPs), seguidos de reemplazo enel C-terminal. Estos compuestos son puntos de partida para la generación de inhibidores de CDK no competitivos de ATP como agentes terapéuticos anti-tumorales.

Las interacciones de HAKRRLIF con la ranura de la ciclina se muestran en la Figura 2. Los residuos de péptidos que representan los determinantes de unión clave incluyen Ala2, Arg4, Leu6 y Phe8 con otros residuos de aportar contribuciones más pequeños 12,13,18. En este estudio de caso la estrategia REPLACE se ha utilizado con el fin de encontrar alternativas de fragmentos para los residuos en el tetrapéptido N-terminal de HAKRRLIF, imitando principalmente las interacciones de Ala2 y Arg4....

Watch this Scientific Journal Video about Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors at JoV

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

El desarrollo de inhibidores de interacciones proteína-proteína a través REEMPLAZAR: Aplicación al Diseño y Desarrollo para no ATP inhibidores de CDK Competitiva

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

development-inhibitors-protein-protein-interactions-through-replace

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K vistas.  University of South Carolina. We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Video: Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

El uso de SC1 (Pluripotin) para apoyar MESC auto-renovación en la ausencia de LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Investigación

Biología

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Los explantes blastómeras para la Prueba de Compromiso destino celular durante el desarrollo embrionario

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Eficiente iPS Generación Celular de sangre usando episomas y HDAC inhibidores

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Diseño y Desarrollo de aptámeros y oro nanopartículas basados ​​en ensayos colorimétricos para aplicaciones en-el-campo

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

La eliminación de materiales exógenos de la parte exterior de congelados Núcleos para Investigar la antigua comunidades biológicas albergaba el interior

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Estudio de las interacciones proteína-proteína en la autofagia investigación

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Application of Ultrasound and Shear Wave Elastography Imaging in a Rat Model of NAFLD/NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat accumulation (steatosis) and inflammation leading to fibrosis. Preclinical models closely recapitulating human NASH/NAFLD are essential in drug development. While liver biopsy is currently the gold standard for measuring NAFLD/NASH progression and diagnosis in the clinic, in the preclinical space, either collection of whole liver samples at multiple timepoints during a study or biopsy of liver is needed for histological analysis to assess the disease stage.
Conducting a liver biopsy mid-study is an invasive and labor-intensive procedure, and collecting liver samples to assess disease level increases the number of research animals needed for a study. Thus, there is a need for a reliable, translatable, non-invasive imaging biomarker to detect NASH/NAFLD in these preclinical models. Non-invasive ultrasound-based B-mode images and Shear Wave Elastography (SWE) can be used to measure steatosis as well as liver fibrosis. To assess the utility of SWE in preclinical rodent models of NASH, animals were placed on a pro-NASH diet&#160;and underwent non-invasive ultrasound B-mode and shear wave elastography imaging to measure hepatorenal (HR) index and liver elasticity, measuring progression of both liver fat accumulation and tissue stiffness, respectively, at multiple time points over the course of a given NAFLD/NASH study.
The HR index and elasticity numbers were compared to histological markers of steatosis and fibrosis. The results showed strong correlation between the HR index and percentage of Oil Red O (ORO) staining, as well as between elasticity and Picro-Sirius Red (PSR) staining of livers. The strong correlation between classic ex vivo methods and in vivo imaging results provides evidence that shear wave elastography/ultrasound-based imaging can be used to assess disease phenotype and progression in a preclinical model of NAFLD/NASH.

This protocol describes the use of an enhanced ultrasound technique to non-invasively observe and quantify liver tissue changes in rodent models of nonalcoholic fatty liver disease.

Aplicación de imágenes de ultrasonido y elastografía de onda de cizallamiento en un modelo de rata de NAFLD/NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat ...