Las inflorescencias jóvenes como explant para la producción de callos son importantes para establecer una transformación genética rápida y eficiente y un método de regeneración para revelar la función génica, así como para la mejora de los cultivos. Las inflorescencias jóvenes como explan para la producción de callos son importantes para establecer una transformación genética rápida y eficiente y el método de regeneración para revelar la función génica. La demostración en vídeo de esta técnica ayudará al espectador a entender el proceso de mantenimiento de los materiales para producir esa alineación transgénica deseada sin perder tiempo y esfuerzo.
Comience por recoger inflorescencias de arroz jóvenes del campo de arroz o de un invernadero en la etapa de meiosis, asegurándose de que estén cubiertas con la vaina de la hoja. Limpie cada inflorescencia con un hisopo de alcohol al 70% y déjelo secar antes de cortar. Lleve la inflorescencia a un banco de laboratorio estéril y córtelo en trozos pequeños con tijeras esterilizadas, luego transfiera los esquejes a una placa Petri que contenga el medio NBD2.
Incubar la placa en la oscuridad a 26 grados celsius durante 10 a 14 días para inducir callo. Para realizar la transformación, transfiera una sola colonia de la placa blanca EB con antibióticos selectivos a cinco mililitros de medio YEB líquido que contenga los mismos antibióticos en un tubo de ensayo estéril cónico de 50 mililitros. Agitar el tubo en un agitador orbital a 250 veces g y 25 a 28 grados Celsius hasta que las bacterias crezcan a un OD 600 de 0.5.
Añadir un mililitro de suspensión bacteriana a 100 mililitros de medio YEB con los mismos antibióticos selectivos en un matraz cónico de 250 mililitros y agitar el matraz en un agitador orbital a 250 g y 28 grados Celsius durante cuatro horas. Centrifugar el cultivo a 4.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para recoger las bacterias. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet con medio AAM AS, luego diluya la suspensión a un OD 600 de 0.4.
Después de la incubación, recoger alrededor de 150 calli embriogénicos amarillo claro sano en un matraz estéril de 150 mililitros. Añadir de 50 a 75 mililitros de la suspensión celular bacteriana en el matraz y luego añadir de 10 a 25 mililitros de AAM fresco como medio para sumergir la calla durante 10 a 20 minutos, temblando ocasionalmente. Vierta la suspensión bacteriana del matraz cuidadosamente y seque la cali con papel de filtro estéril, luego colóquela en un plato de Petri con un medio NBD AS y cúbralas con papel de filtro.
Incubar los callos a 25 a 28 grados centígrados en la oscuridad durante tres días, controlándolos para detectar el crecimiento excesivo bacteriano. Después de tres días de cultivo, transfiera la calita a un plato estéril de Petri con papel de filtro y, a continuación, séquelos al aire durante dos horas en un banco limpio. Asegúrese de que las callas no estén adheridas al papel filtrante y transfiéralas al medio de selección primario NBD2.
Después de dos semanas, transfiera el calli uniformemente a un nuevo plato que contenga un nuevo medio de selección, luego mueva el calli al medio de LA MS fresco para la diferenciación y los cogollos de brote al medio MS con 10 miligramos por litro de higromicina para proliferar más brotes. Transfiera los nuevos brotes a medio de media NIEBLA para la inducción de la raíz y los cultivo bajo la luz a 25 a 28 grados centígrados. Las plantas transformadas deben producir raíces dentro de dos semanas.
Para realizar la observación del fenotipo reproductivo, retire la palea y el lema del floro y imagine las anteras enteras bajo un microscopio estéreo. Para observar la viabilidad del polen, escoja espiguillas de arroz maduros antes de la antítesis de la flor y retire la palea y el lema para liberar las anteras. Tome seis anras y colóquelas en un tobogán de vidrio.
Añadir una gota de agua destilada, aplastar la antera con pinzas para liberar los granos de polen, a continuación, añadir dos a tres gotas de solución de yodo y cubrir con un cubreobjetos. Observe la diapositiva bajo un microscopio de bajo aumento. Los granos de polen teñidos de negro muestran una viabilidad más vigorosa, mientras que los granos sin color o los de color marrón amarillo teñido se atrofian o degeneran.
Para realizar la microscopía de sección transversal, utilice una solución azul de 0,5% de toluidina para manchar los portaobjetos durante 30 minutos, luego enjuáguelos con agua y séquelos en la campana del humo. Una vez secas, sella las diapositivas con pegamento de árbol neutro, coloca suavemente un cubreobjetos en el portaobjetos y sécalos en la campana de humo, luego haz una imagen de la muestra bajo un microscopio. Este protocolo fue utilizado para crear una línea estéril masculina por agrobacterium-transformación genética mediada en arroz.
Los calli embrionarios se utilizaron directamente para la transformación o subcultivo para la proliferación para obtener más calli para una mayor infección. Después de co-cultivar durante 48 horas, los calli fueron trasladados a una segunda ronda de medio de selección. Después de 10 a 14 días, los calli transformados mostraron microcalli recién formados mientras que los callos no transformados se volvieron marrones y murieron.
Más tarde, las calis de color sanas y cremosas se transfirieron al medio de regeneración. Los calli transformados poco a poco mostraron puntos verdes. Estas manchas verdes se cultivaron en medio de regeneración para permitir el crecimiento del brote y luego se desplazaron a medio de la mitad de la NIEBLA para inducir raíces.
Más tarde, se cosecharon brotes de cultivo sanos y vigorosos con raíces bien desarrolladas. En total, se obtuvieron 21 plántulas regeneradas. La amplificación de PCR para la región de Higromicina mostró que la frecuencia de transformación era de aproximadamente 85,71%Los transformantes fueron genotipados para identificar las mutaciones en los sitios de destino de sgRNA.
Entre las 18 plantas transgénicas, ocho líneas heterocigotas y tres líneas homocigotas estaban crispr CAS9 positivas. Los mutantes nocautut homocigotos fueron validados por la observación básica de órganos reproductores masculinos. Las anras de osabcg15 eran más pequeñas y más pálidas que las del tipo salvaje y carecían de granos de polen maduros.
Se realizó una microscopía de sección transversal para investigar los defectos morfológicos anther en osabcg15. En la etapa 10, las microoras de tipo salvaje se volvieron redondas y vacuoladas con exine teñido de azul oscuro. Por el contrario, las microorasporas osabcg15 colapsaron y se degradaron.
Al intentar este protocolo, es importante asegurarse de que el material recogido está en fase de meiosis y controlar el tiempo de secado al aire de la calla.
