VSR fue apoyado por una subvención Marie Curie del IIF (HERIDA EN LA TIERRA, acrónimo de: Herida inducida por señales eléctricas en Arabidopsis thaliana).

1. Pulgón Crianza Nota: La elección de las especies vegetales y de áfidos para grabaciones EPG depende de la finalidad de la investigación. Para los estudios en Arabidopsis thaliana, el brassicae Brevicoryne pulgón es apropiado. <ol><li> Posterior B. áfidos brassicae en un invernadero en Brassica oleracea. Mantener las plantas utilizadas para la cría de áfido en jaulas, con el fin de evitar la contaminación de otras plantas. Mantenga las plantas de áfidos crianza y plantas experimentales (en nuestro caso B. oleracea y A. thaliana) en habitaciones separadas, con el fin de evitar la contaminación de las plantas experimentales con pulgones. </li><li> Traslado áfidos de las plantas frescas sobre cada 2 semanas, antes de causar daños a las plantas significativa, o llegar a la superpoblación. Traslado 10-20 pulgones adultos a una planta de cría fresco para iniciar una nueva colonia. </li><li> Supervisar la crianza plantas regularmente para la contaminación por especies no deseadas de áfidos, otros insectos herbívoros, parasitoides de áfidos y fungi que puedan afectar a la salud de la colonia de áfidos. </li><li> Recoger adultos, áfidos sin alas hasta una semana después de su última muda para la grabación EPG. </li><li> Después de los experimentos, devolver las plantas experimentales que no estaban acostumbrados a la cámara de crecimiento, ya que a menudo tienen algún descendiente que se ha producido durante la grabación, que inadvertidamente podría contaminar otras plantas. </li></ol> 2. Insecto de cableado para la grabación EPG <ol><li> Para electrodos de insectos, obtener patillas del conector de latón (clavos, Ø 1,2 mm), alambre de cobre fino (Ø 0,2 mm), de alambre de oro muy fina (aprox Ø 20 micras), pegamento plata a base de agua, un perno de soldadura pequeño y sencillo con fluido de soldadura y alambre de soldadura con núcleo de resina, microscopio estereoscópico con aumento 10X, pequeñas tijeras o bisturí, dos pinzas finas, y una hoja de espuma de poliestireno o caja. Nota: Un mezclador de vórtice podría ser útil. Nota: El protocolo paso a paso para hacer electrodos se indica en la Figura 2. </li><li> Para áfidomanipulación y aplicación de cola, obtenemos: un pequeño cepillo de pelo de camello y suave acuarela (tamaño 2 o menor) y los pasadores de insectos tales como los utilizados para colecciones de insectos, aunque una aguja de coser fino o palillo de dientes pueden funcionar tan bien. Paso 4 muestra cómo iniciar la grabación EPG. </li><li> Paso 1. Nota: Los pasos 1 y 2 a continuación muestran cómo preparar electrodos de insectos menos el pulgón. Paso 3 muestra cómo conectar un áfido al electrodo. Se recomienda vacío fijación del pulgón durante el cableado, pero no siempre se requiere para las especies de movimiento lento (por ejemplo, B. brassicae). <ol><li> Encienda el perno de soldadura y derretir un poco de alambre de soldadura en la punta (Figura 2A). Humedezca la cabeza de la clavija de conexión de latón con un poco de líquido de soldadura (Figura 2B) e introducirlo en la soldadura de metal fundido (Figura 2C). </li><li> Aplicar una funda de metal de soldadura fundida en un extremo de una pieza larga 1-2 cm del alambre de cobre fino (Figura2D). Luego, lleve el alambre pasador y cobre juntos contra el perno caliente (Figura 2E) y moverlos juntos lejos enfriar y solidificar (Figura 2F). </li></ol></li><li> Paso 2. <ol><li> Agite (o vórtice) el vial con pegamento plata durante varios minutos hasta que se muestre una emulsión suave. Cut (tijeras o bisturí) algunas piezas de alambre de oro (de aproximadamente 1,5 cm de longitud) en la placa objeto de la estereoscópico (Figura 2G). </li><li> Tome un pin de latón con hilo de cobre soldada (hecho en la sección 2.3) y sumergir el extremo libre del cable de cobre en el pequeño depósito de cola de plata que se han reunido en el interior de la tapa del vial después de abrirlo (Figura 2H). Nota: Sólo se necesita una pequeña gota. </li><li> Mueva el extremo de cola de cruce del hilo de cobre a la pieza de hilo de oro, mientras levanta un extremo para evitar manchar el pegamento sobre la placa objeto estereomicroscopio. Trate de solapar copper y alambre de oro para unos pocos mm (Figura 2I), distribuyendo el pegamento a lo largo de la superposición de los dos cables. </li><li> Espere hasta que el pegamento se haya secado lo suficiente para mantener los cables unidos. Compruebe el contacto del pegamento después del secado y añadir un poco de pegamento fresco con un pequeño alfiler u otro trozo de alambre de cobre, si algunas partes de los cables unidos muestran partes sin pegamento. </li><li> Después de que el electrodo de insectos está listo, almacenarla, por ejemplo se inserta en un pedazo de espuma de poliestireno. Nota: La longitud del hilo de oro determinará la libertad de movimiento del pulgón: si es demasiado corto (menos de 5 mm), el pulgón puede sentirse limitado y no comportarse normalmente; si es demasiado largo (&gt; 2 cm), el áfido se moverá libremente. Los áfidos tienden a moverse hacia el lado adaxial de las hojas, si se le permite. Si el hilo de oro toca la hoja, la señal estará en cortocircuito. </li></ol></li><li> Paso 3. <ol><li> El pulgón puede mantenerse en su lugar por medio de succión luz, usando un vacío; en este caso, instalar tque succionar dispositivo bajo el microscopio estereoscópico. Coloque la abertura de aspiración en el centro del campo. </li><li> Agite el vial con pegamento plata durante varios minutos (o torbellino) hasta que se forma una emulsión suave. Reunir un áfido con el cepillo pequeño. </li><li> Encienda el dispositivo de succión y montar el pulgón de la abertura de succión (Figura 2J), con la parte posterior del abdomen se volvió hacia el experimentador. Con el pincel fino, eliminar cualquier cera de la superficie del abdomen (abundante en los áfidos de col). </li><li> Abra el vial pegamento y mojar un pasador con una muy pequeña gota de pegamento de plata (Figura 2K). Aplicar la gotita de la cola de plata en la parte posterior del abdomen de la áfido (Figura 2L-M). Que esta gotita completamente seco durante varios minutos, agitar enérgicamente el vial pegamento de nuevo y añadir una segunda gota de pegamento de plata en la parte superior de la primera. Nota: Mientras que el pegamento de plata es un conductor eléctrico, que no causa significativadaños a la cutícula del insecto. </li><li> Después de cerrar el frasco de pegamento, inserte el extremo libre del alambre de oro en la gotita húmedo y mantener el cable todavía al tiempo que permite que el pegamento se seque por completo (Figura 2 N). Evite manchar pegamento en las piernas o antenas y descartar un áfido si esto ha sucedido. </li><li> Apague el dispositivo de fijación de succión y levante con cuidado el insecto (Figura 2O). Si es necesario, utilizar un pincel fino para ayudar en el levantamiento del áfido del dispositivo de succión. Nota: El cableado B. brassicae no requiere un vacío, ya que pueden ser cableados en una pieza de un tejido de precisión de laboratorio, la superficie rugosa de las cuales proporciona el pulgón con suficiente agarre de modo que no será levantado después de aplicar una gota de pegamento húmedo a su abdomen. Después del secado el pegamento se puede levantar el áfido del tejido con la ayuda de un pincel fino. </li><li> Inserte el pasador de latón con el insecto por cable en la espuma de poliestireno y, si es necesario, continuarel cableado de todos los otros insectos que se utilizará para la sesión de grabación EPG. Nota: Estos protocolos para el cableado de áfidos funcionan bien para nosotros. El usuario puede encontrar a su / su propio método para el cableado de los áfidos. </li></ol></li><li> Paso 4. <ol><li> Ponga plantas en la jaula de Faraday (Figura 2P) sobre un soporte no conductor: utilizar placas de Petri o una placa de vidrio o plástico. </li><li> Inserte un electrodo de planta en el suelo de cada maceta. Inserte el pasador de bronce del insecto por cable en el conector de entrada del preamplificador EPG (Figura 2Q). Nota: el electrodo de suelo no se corresponde con el electrodo de tierra utilizado en otras técnicas electrofisiológicas. Tiene la tensión de desplazamiento necesario para ajustar y compensar las tensiones de polarización del electrodo. </li><li> En la interfaz del software de adquisición de estilete +, con frecuencia de muestreo fijo de 100 Hz, introduzca un nombre de archivo, especifique el tiempo de grabación, y escribir texto para especificar los detalles del experimento (tratamiento, planta / inse<html> especies ct, etc.) en líneas de comentario 2 y 3. </li><li> Baje los insectos en una zona de aterrizaje adecuada de la planta e iniciar la sesión de grabación haciendo clic en el botón Inicio de la interfaz de software de adquisición (estilete +). Nota 1: un máximo de 8 canales se puede utilizar de forma simultánea en una EPG configurar. Una EPG-electrodo o varios electrodos de EPG por planta pueden ser utilizados. Nota 2: cuando el enfoque del estudio es el comportamiento de áfidos, iniciar la grabación antes de acceso a la planta de los pulgones para evitar perder las primeras actividades de penetración de la planta. </li><li> Para el estudio de las respuestas electrofisiológicas de las PE a los estímulos, espere por lo menos 10 minutos después de que el pulgón ha entrado en fase de floema, con el fin de garantizar que el pulgón se encuentra en una fase de la ingestión floema sostenida, y que la línea de base de la señal es estable. Sólo entonces, comenzar cualquier experimento estimulación planta. </li></ol></li></ol>tp_upload / 52826 / 52826fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Hacer EPG-electrodos con pulgones y otros insectos hemípteros de gráfico penetración eléctrica (EPG) grabaciones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Paneles de AI, los pasos necesarios para preparar la EPG-electrodos menos el pulgón. En primer lugar, fundir una pieza de metal de soldadura en la punta de un perno de soldadura (A). Luego, sumerja la cabeza del pasador de latón en una gota de líquido de soldadura (B), y póngase en contacto con el metal fundido en la punta del perno de soldadura (C). Inmediatamente después de este paso, póngase en contacto con el extremo de un cable de cobre a la punta del perno de soldadura, con el fin de la cola a la cabeza del pasador de latón (EF). Con un bisturí o una cuchilla, cortar un trozo de alambre de oro (G). Inmersiónel extremo libre del hilo de cobre (unido en el otro extremo a la clavija de latón) en el pegamento de plata (H), y rápidamente se unen al alambre de oro a él (I) antes de la plata se seca. El alambre de oro es un excelente conductor, y puede ser polarizada. En realidad, en la mayoría de los casos la polarización es demasiado pequeño para ser detectado, y si es así, puede ser compensada con la tensión de offset (V). Paneles JO, los pasos necesarios para conectar un áfido (u otro insecto hemipteran) al electrodo. En primer lugar, levante con cuidado un áfido con un pincel de acuarela fino y colocarlo en la apertura del dispositivo de succión de vacío (J). Encienda la bomba de vacío y cubra el orificio de la válvula de aire con un pedazo de papel para aplicar succión. Sumerja la punta del pasador de insectos en la cola de plata (K), y poner una pequeña gota de pegamento en la parte superior del abdomen del pulgón, bajo un microscopio estereoscópico (LM). Dentro depróxima ~ 20 seg, antes de la gota de pegamento de plata en que se seque el pulgón, inserte el extremo del hilo de oro del electrodo de insectos en la gotita húmedo de cola de plata, y mantenerlo en su lugar durante 1-3 minutos, hasta que el pegamento plata tiene completamente seca al aire (N). En este punto, deshabilitar aspiración quitando el pedazo de papel que cubre el agujero de la válvula de aire del dispositivo de succión y retire con cuidado el pulgón, desde el dispositivo de aspiración: levantar el pulgón después cableado menudo requiere un poco de ayuda de un pincel fino (O). Panel P muestra una vista general de toda la EPG configurado dentro de la jaula de Faraday, y Panel Q muestra una visión general de la combinación planta-áfido de EPG. Vea la sección 2 más arriba para una explicación más detallada de este proceso. Las letras minúsculas son etiquetas que se refieren a los elementos que uno tiene que hacer EPG-electrodos: a: perno de soldadura; b: fundió el metal de soldadura;c: El líquido de soldadura; d: latón pin conector (uñas); e: alambre de cobre; f: hilo de oro 18μm Ø; g: dispositivo de succión; h: pulgón; i: pegamento plata a base de agua; j: Jaula de Faraday; k: electrodo planta; l: conector de entrada (BNC) de la pre-amplificador EPG.

<ol>
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Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway.</a> Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).</li><li>Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. 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WFT launched EPG Systems as a retirement activity, and is affiliated with it financially.

Este artículo proporciona un protocolo detallado para la toma eléctrica Penetración Gráfico (EPG) grabaciones. La técnica EPG está bien establecida, con 100 a 200 usuarios activos en todo el mundo, y se ha implementado para muchos estudios sobre diferentes temas, por ejemplo: a) resistencia de la planta huésped de pulgones y otros insectos portadores de estilete 13; mecanismos de transmisión b) virus de plantas y patógenos 14; c) el modo de insecticidas de acción, (toxicidad y cambios de ...

La capacidad de producir señales eléctricas de larga distancia es un rasgo ventajoso de los organismos multicelulares que permite respuestas eficientes a los estímulos externos. Este rasgo ha evolucionado independientemente en plantas y animales, y por lo tanto representa un caso de evolución convergente. Dado que las señales eléctricas se acoplan con funciones importantes en animales tales como la transmisión neural y la contracción muscular, la base molecular, el mecanismo de transmisión, y la función de señales eléctricas estímulos inducidos en animales son sujetos de investigación intensiva. Por el contrario, los estímulos inducidos por la señalización eléctrica en plantas ha recibido poca atención de la investigación. Aunque las plantas no tienen nervios o músculos, parece que hay suficiente evidencia para suponer que las señales eléctricas estímulos inducidos en las plantas juegan un papel clave en sus respuestas a los factores ambientales. El floema, el componente viviente de la vasculatura de la planta, se ha postulado como un sub importanteStrate para la transmisión de señales eléctricas estímulos inducidos, desde estimulado / dañado a las áreas no estimulados / 2 no dañadas. Las principales células del floema son los elementos de criba (SES), células relativamente simple, alargados. Los extremos de las PE están conectados a otra SE, formando una baja resistencia continua, sistema de tubos de tamiz que se extendió por toda la planta. Hay, sin embargo, muy pocos estudios sobre las propiedades eléctricas de estas células altamente especializadas. En estos estudios anteriores, los investigadores acceder a las PE, ya sea con vidrio micro-electrodos 3 estiletes o con electrodos de vidrio que fueron acoplados a plantar insertados-de áfidos, después stylectomy (corte) 4. Microelectrodos de vidrio están hechos de capilares de vidrio que se extraen en un extremo con calor en una punta fina de menos de 1 micra de diámetro, y luego se llena con una solución de KCl. A Ag / AgCl o platino alambre, se inserta en el electrodo de vidrio llenos de KCl se conecta entonces a la entrada del amplificador, y un referenteelectrodo se inserta en el baño que rodea a la célula de interés, completando el circuito. Esta configuración registra la diferencia de potencial entre el electrodo extracelular referente y el electrodo de medición intracelular, es decir, el potencial de membrana de la célula 5. Con este método, Umrath hizo la primera grabación intracelular de una célula de planta, utilizando las algas Nitella 6,7. Nitella es un organismo relativamente simple con células grandes, y por lo tanto susceptibles de experimentos de electrofisiología intracelulares. En contraste, la inserción de electrodos de vidrio intracelulares en las pequeñas células de plantas terrestres multi-celulares, tridimensionales es técnicamente exigente, requiere un investigador altamente cualificado, así como la visualización sofisticado, micromanipulación, y equipo anti-vibración. Aunque electrodos de vidrio son adecuados para grabar a partir de células superficiales en plantas, tales como células epidérmicas de la raíz 8, recordin intracelulargs de células profundamente arraigados en el tejido de la planta, tales como las SE, las respuestas inducidas por daños por causas muy probables, confundiendo los resultados. En 1989, Fromm y Eschrich informaron el uso de un método alternativo, llamado el &quot;método pulgón &#39;, en la que los electrodos de vidrio se acoplan a estiletes áfidos después stylectomy 4. El método áfido es mínimamente invasivo, porque estiletes flexibles no causan daño tejido o célula como electrodos de vidrio hacen. Estiletes áfidos son gran invento de la naturaleza para la penetración de la planta, y los áfidos son considerablemente más hábiles que los seres humanos en la búsqueda de la SE. Desafortunadamente, este método pulgón también es muy exigente en términos de experiencia y el equipo técnico. Además, el éxito de cada experimento que implementa esta técnica depende enteramente de la áfido estar en modo de alimentación - con el estilete insertado en una forma estable SE, en el momento de stylectomy. Pensando en retrospectiva, uno puede ver que las probabilidades de éxito de esta técnica podría haber sido improved mediante la adición a la configuración experimental de un instrumento que permite identificar si o no el estilete áfido está en el SE al aplicar stylectomy. En 1964, McLean y Kinsey describen un &quot;sistema de vigilancia electrónica&quot; para el estudio del comportamiento de alimentación de los pulgones en tiempo real 9,10. En este sistema, el pulgón y la planta estilete-penetrado fueron integrados en un circuito eléctrico. Más tarde, en 1978, Tjallingii ideó una versión modificada del sistema, llamado sistema &#39;eléctrico Penetración Graph&#39; (EPG) 11,12. Considerando que el sistema de monitorización electrónica original era sensible a los potenciales de resistencia originada solamente, con el sistema EPG, la fuerza electromotriz (fem) se originó potenciales, es decir, generados en la planta o en el insecto, se podrían registrar además de los potenciales derivados de la resistencia (R) en el insecto. Esto representa una mejora importante, debido a que tanto la señal de componentes, fem y R,proporcionar biológica información pertinente sobre los acontecimientos durante la penetración planta por áfidos. Lo que hace que el preamplificador EPG sensibles a los componentes R es su relativamente baja resistencia de entrada de 1 GΩ, que es cerca de la media de la resistencia de la planta / pulgón. Una tensión de offset pequeño (Figura 1, V) de aproximadamente 100 mV se aplica a la planta, que luego se divide a través de plantas e insectos en un lado, y la resistencia de entrada en el otro. Las tensiones y sus cambios se miden en un punto (Figura 1A, B) entre el insecto y la resistencia de entrada. Por lo tanto, los componentes R representan modulaciones de resistencia-áfido de plantas de la tensión de offset, mientras que los componentes son emf una cierta fracción de los potenciales de la planta en la punta del estilete y potenciales causados ​​en el insecto. Los potenciales de plantas - más relevantes aquí - son potenciales principalmente de membrana de las células vegetales pinchados por los estiletes de áfidos. Los potenciales de insectos parecen ser principalmentelos potenciales de transmisión causados ​​por los movimientos de fluidos dentro de los dos canales del estilete, es decir, la comida y los canales salivales; no hay potenciales de los nervios o músculos internos se registran en la EPG. En la práctica, las funciones de la punta del estilete como una punta de electrodo. Todas las células vegetales están cargados negativamente en el interior respecto al exterior positivo de la célula. La corriente eléctrica (es decir, el movimiento de iones cargados en solución acuosa) que fluye desde el interior hacia el exterior y vice versa es muy limitada debido a la alta resistencia de la membrana celular. Normalmente, el potencial de reposo se mantiene constante. Sin embargo, cuando los iones negativos se mueven hacia fuera o iones positivos se mueven a través de la membrana celular, el potencial de membrana se reduce, es decir, es despolariza &#39;. La despolarización se produce en el caso de la excitación celular. Los iones entonces se mueven dentro o fuera cuando los canales de iones específicos en la membrana se abren o cuando la membrana está dañada y los iones de fugas dentro y fuera. Todas las células tienen canales iónicos y bombas en tque la membrana plasmática que llevar el potencial de membrana a su nivel de reposo mediante la restauración de la concentración original de diversos iones dentro de la célula. El potencial de reposo y sus cambios son componentes emf, y por lo tanto, la técnica de EPG es adecuado para medir ellos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52826/52826fig1.jpg" /> Figura 1. EPG-electrodos. La EPG-electrodo es un áfido de estar integrado en el circuito eléctrico Penetración Graph (EPG), cuyo estilete se inserta en un elemento de tamiz (SE) en el modo de alimentación estable. Si el estilete SE-empalado está en reposo (panel A), el voltaje en el circuito, registrado por EPG, es estable y en el nivel de potencial de reposo (Panel C, Rest). Si la SE es excitado, sus despolariza la membrana (panel B), que se visualiza en la EPG como un incremento gradual en el voltaje (panel C, despolarización). Como el equilibrio iónico en la SE vuelve a descansar, es decir, repolarizes, la tensión registrada por EPG disminuye gradualmente al nivel potencial de reposo (Grupo C, repolarización). En el panel C, &quot;A&quot; y &quot;B&quot; se refieren a los escenarios que se muestran en los paneles A y B, respectivamente. V = Ajustable fuente de tensión de offset. Ri = resistencia de entrada. En paralelo a la resistencia externa 1 GΩ, el amplificador tiene una interna (en el OpAmp) de alta resistencia de 1,5 TΩ (paneles A y B, en gris). Por control remoto del interruptor de la pre-amplificador EPG se puede cambiar de normal a EMF-mode, que permite obtener valores de tensión de alta precisión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> En la siguiente sección, ofrecemos al lector con un protocolo básico para la realización de experimentos de EPG que es válido tanto para los estudios de insectos centrado y enfocado en plantas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brass connector pins</td>
			<td>EPG Systems/hardw.shop</td>
			<td></td>
			<td>&#934; 1.2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin copper wire</td>
			<td>EPG Systems/hardw.shop</td>
			<td></td>
			<td>approx. &#934; 0.2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin gold wire</td>
			<td>EPG Systems</td>
			<td></td>
			<td>&#934; 18 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering fluid</td>
			<td>hardware shop</td>
			<td></td>
			<td>matching the soldering wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin-cored soldering wire</td>
			<td>hardware shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-based silver glue</td>
			<td>EPG systems</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.epgsystems.eu/">recipe in: www.epgsystems.eu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering bolt</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Hund Wetzlar</td>
			<td></td>
			<td>minimum magnification is x10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>A. Hartenstein</td>
			<td>L46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watercolor brushes</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>Number 1 or 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air suction device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see description in: www.epgsystems.eu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>No. 1 or 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid table</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hand made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Fujitsu Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software</td>
			<td>EPG Systems</td>
			<td></td>
			<td>Stylet+d</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giga-4 (-8) Complete System</td>
			<td>EPG Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>includes the following:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Main control box with USB output</td>
			<td></td>
			<td>Di155/Di710</td>
			<td>12/14 bit, rate 100Hz(softw. fixed)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPG probes 4 (8)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50x DC pre-amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel clamps on rod</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power adaptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant electrodes and cables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional test and ground cables&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new application of the electrical penetration graph (epg) for acquiring and measuring electrical signals in phloem sieve elements

Propiedades electrofisiológicas de las células se estudian a menudo in vitro, después de disociar desde sus ambientes nativos. Sin embargo, el estudio de la transmisión eléctrica entre las células distantes en un organismo requiere in vivo, grabaciones libres de artefactos de células embebidas dentro de su entorno nativo. La transmisión de señales eléctricas de herida de áreas ilesos en una planta ha puesto mucho despertado el interés de los botánicos. El floema, la parte viva de la vasculatura planta que se extendió por toda la planta, se ha postulado como un pañuelo de papel importante en la transmisión eléctrica en las plantas. La falta de métodos electrofisiológicos adecuados plantea muchos retos para el estudio de las propiedades eléctricas de las células del floema en vivo. Aquí presentamos un nuevo enfoque para la electrofisiología intracelular de elementos de tamiz (PE) que utiliza los áfidos vivos o de otros insectos hemípteros de alimentación floema, integrada en el gra penetración eléctricaph (EPG) de circuito. La versatilidad, robustez y precisión de este método han permitido registrar y estudiar en detalle las señales eléctricas inducidas por la herida en las SE de las venas centrales de la planta modelo Arabidopsis thaliana 1. Aquí nos muestran que la EPG-electrodos se pueden implementar fácilmente intracelulares registros electrofisiológicos de las PE en las venas marginales, así como para el estudio de la capacidad de las PE a responder con señales eléctricas a varios estímulos externos. El enfoque EPG aplicado a electrofisiología intracelular de PE puede ser implementado a una amplia variedad de especies de plantas, en un gran número de combinaciones de plantas / insectos, y para muchos de investigación pretende.

En un estudio anterior, se implementó la técnica de EPG-electrodo con el fin de caracterizar las señales eléctricas producidas en las SE de la vena media durante el ataque de oruga 1. El nervio central es un sitio de inserción preferido para electrodos de vidrio convencionales, así como para los electrodos de vidrio-estilete, porque es SE-densa, relativamente robusto y, por lo tanto susceptible a la fijación necesaria para la aplicación de estas técnicas. Aquí, nos aprovechamos de la versatilidad de...

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A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

Una nueva aplicación de la eléctrica Penetración Gráfico (EPG) para la adquisición y medición de señales eléctricas en el floema Tamiz Elementos

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

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Research

JoVE Journal

Environment

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

14.6K vistas.  University of Würzburg. Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants. 

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Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail millet. Recently, the 510 Mb genome of foxtail millet, S. italica, has been sequenced 1,2 and a 25x coverage genome sequence of the weedy relative S. viridis is in progress. S. viridis has a number of characteristics that make it a potentially excellent model genetic system including a rapid generation time, small stature, simple growth requirements, prolific seed production 3 and developed systems for both transient and stable transformation 4. However, the genetics of S. viridis is largely unexplored, in part, due to the lack of detailed methods for performing crosses. To date, no standard protocol has been adopted that will permit rapid production of seeds from controlled crosses.
The protocol presented here is optimized for performing genetic crosses in S. viridis, accession A10.1. We have employed a simple heat treatment with warm water for emasculation after pruning the panicle to retain 20-30 florets and labeling of flowers to eliminate seeds resulting from newly developed flowers after emasculation. After testing a series of heat treatments at permissive temperatures and varying the duration of dipping, we have established an optimum temperature and time range of 48 &deg;C for 3-6 min. By using this method, a minimum of 15 crosses can be performed by a single worker per day and an average of 3-5 outcross progeny per panicle can be recovered. Therefore, an average of 45-75 outcross progeny can be produced by one person in a single day. Broad implementation of this technique will facilitate the development of recombinant inbred line populations of S. viridis X S. viridis or S. viridis X S. italica, mapping mutations through bulk segregant analysis and creating higher order mutants for genetic analysis.

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

We have developed a methodology for performing crosses in Setaria viridis (S. viridis). The method involves pruning the panicle prior to a hot water treatment to kill viable pollen. Crosses are performed following a well-controlled growth regime and typically result in the recovery of 1 to 7 cross-pollinated seed/s per panicle.

Los métodos para realizar cruces en<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Un nuevo sistema de modelo para las gramíneas

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

Investigación

Medio ambiente

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with more than 150 of economic value. It is a major pest of greenhouse crops, especially in Solanaceae and Cucurbitaceae (e.g., tomatoes, eggplants, peppers, cucumbers, zucchini) and greenhouse ornamentals (e.g., roses, chrysanthemum, carnations), annual field crops (such as maize, cotton, soybean, and sugar beet), and in perennial cultures (alfalfa, strawberries, grapes, citruses, and plums)1,2. In addition to the extreme polyphagy that makes it an important agricultural pest, T. urticae has a tendency to develop resistance to a wide array of insecticides and acaricides that are used for its control3-7.
T. urticae is an excellent experimental organism, as it has a rapid life cycle (7 days at 27 &#176;C) and can be easily maintained at high density in the laboratory. Methods to assay gene expression (including in situ hybridization and antibody staining) and to inactivate expression of spider mite endogenous genes using RNA interference have been developed8-10. Recently, the whole genome sequence of T. urticae has been reported, creating an opportunity to develop this pest herbivore as a model organism with equivalent genomic resources that already exist in some of its host plants (Arabidopsis thaliana and the&#160;tomato Solanum lycopersicum)11. Together, these&#160;model organisms could provide insights into molecular bases of plant-pest interactions.
Here, an efficient method for quick and easy collection of a large number of adult female mites, their application on an experimental plant host, and the assessment of the plant damage due to spider mite feeding are described. The presented protocol enables fast and efficient collection of hundreds of individuals at any developmental stage (eggs, larvae, nymphs, adult males, and females) that can be used for subsequent experimental application.

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Protocols for efficient preparation of homogenous samples of spider mites, infestation of experimental plants, and assessment of plant damage, as required for studies of plant-pest interaction were developed.

Aplicación de descubierto en dos de Spider Mite<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; Estudios interacción planta-plaga

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with ...

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

La eliminación de oligoelementos por cúprico Óxido nanopartículas de uranio<em&gt; In Situ</em&gt; Recuperación de purga de agua y su efecto sobre la viabilidad celular

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and enables to perform rapid, automated and simple SPE. The pre-concentrated solution is compatible with analysis by immunoassay, with a low organic solvent content. A method is described for the extraction and pre-concentration of natural hormone 17&#946;-estradiol in 100 ml water samples. Reverse phase SPE is performed with octadecyl-silica sorbent and elution is done with 200 &#181;l of methanol 50% v/v. Eluent is diluted by adding di-water to lower the amount of methanol. After preparing manually the SPE column, the overall procedure is performed automatically within 1 hr. At the end of the process, estradiol concentration is measured by using a commercial enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA). 100-fold pre-concentration is achieved and the methanol content in only 10% v/v. Full recoveries of the molecule are achieved with 1 ng/L spiked de-ionized and synthetic sea water samples.

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Un método simple para la fase sólida automatizada Extracción de muestras de agua para análisis inmunológico de los pequeños contaminantes

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Modification and Application of a Leaf Blower-vac for Field Sampling of Arthropods

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the modification and application of a leaf blower-vac for suction sampling of arthropod populations in rice. When used in combination with an enclosure, application of this sampling device provides absolute estimates of the populations of arthropods as numbers per standardized sampling area. The sampling efficiency depends critically on the sampling duration. In a mature rice crop, a two-minute sampling in an enclosure of 0.13 m2 yields more than 90% of the arthropod population. The device also allows sampling of arthropods dwelling on the water surface or the soil in rice paddies, but it is not suitable for sampling fast flying insects, such as predatory Odonata or larger hymenopterous parasitoids. The modified blower-vac is simple to construct, and cheaper and easier to handle than traditional suction sampling devices, such as D-vac. The low cost makes the modified blower-vac also accessible to researchers in developing countries.

Assessment of arthropod abundance in crops is critical for investigating population dynamics and species interactions. Here we describe the modification and application of a leaf blower-vac for suction sampling of arthropods in rice.

Modificación y aplicación de un soplador de hojas-vac de campo Muestreo de artrópodos

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonate (CaCO3) profiles. The objective is to describe a simple conceptual model and detailed protocol for repeatable field and laboratory measurements of these quantities. Here, accurate elevation is measured using a ground-based differential global positioning system (GPS); other data acquisition methods could be applied to the same basic method. Soil samples are collected from prescribed depth intervals and analyzed in the lab using an efficient and precise modified pressure-calcimeter method for quantitative analysis of inorganic carbon concentration. Standard statistical methods are applied to point data, and representative results show significant correlations between changes in soil surface layer CaCO3 and changes in elevation consistent with the conceptual model; CaCO3 generally decreased in depositional areas and increased in erosional areas. Maps are derived from point measurements of elevation and soil CaCO3 to aid analyses. A map of erosional and depositional patterns at the study site, a rain-fed winter wheat field cropped in alternating wheat-fallow strips, shows the interacting effects of water and wind erosion affected by management and topography. Alternative sampling methods and depth intervals are discussed and recommended for future work relating soil erosion and deposition to soil CaCO3.

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonates. Repeatable methods for field and laboratory measurements of these quantities and data analysis methods are described here.

Medición y mapeo de patrones de erosión y deposición relacionadas las concentraciones de carbonato de suelo bajo manejo agrícola

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and estimating fish abundance. We developed and implemented a rotating stereo-video camera tool that covers a full 360 degrees of sampling, which maximizes sampling effort compared to stationary camera tools. A variety of studies have detailed the ability of static, stereo-camera systems to obtain highly accurate and precise measurements of fish; the focus here was on the development of methodological approaches to quantify fish density using rotating camera systems. The first approach was to develop a modification of the metric MaxN, which typically is a conservative count of the minimum number of fish observed on a given camera survey. We redefine MaxN to be the maximum number of fish observed in any given rotation of the camera system. When precautions are taken to avoid double counting, this method for MaxN may more accurately reflect true abundance than that obtained from a fixed camera. Secondly, because stereo-video allows fish to be mapped in three-dimensional space, precise estimates of the distance-from-camera can be obtained for each fish. By using the 95% percentile of the observed distance from camera to establish species-specific areas surveyed, we account for differences in detectability among species while avoiding diluting density estimates by using the maximum distance a species was observed. Accounting for this range of detectability is critical to accurately estimate fish abundances. This methodology will facilitate the integration of rotating stereo-video tools in both applied science and management contexts.

We describe a new method for counting fishes, and estimating relative abundance (MaxN) and fish density using rotating stereo-video camera systems. We also demonstrate how to use distance from camera (Z distance) to estimate species-specific detectability.

Desarrollo de nuevos métodos para cuantificar la densidad de peces utilizando herramientas de estéreo y vídeo subacuáticos

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

La prueba de infección de planta: Spray y mediada por la herida la inoculación con el patógeno de planta Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

Protocolo experimental para examinar los perfiles de respuesta conductual en peces larvales: aplicación a la Neuro-estimulantes cafeína

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Combining Eye-tracking Data with an Analysis of Video Content from Free-viewing a Video of a Walk in an Urban Park Environment

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. Eye-tracking informatics are known to connect to a range of feelings, health conditions, mental states and actions. But because vision is the result of constant eye-movements, teasing out what is important from what is noise is complex and data intensive. Furthermore, a significant challenge is controlling for what people look at compared to what is presented to them.
The following presents a methodology for combining and analyzing eye-tracking on a video of a natural and complex scene with a machine learning technique for analyzing the content of the video. In the protocol we focus on analyzing data from filmed videos, how a video can be best used to record participants&#39; eye-tracking data, and importantly how the content of the video can be analyzed and combined with the eye-tracking data. We present a brief summary of the results and a discussion of the potential of the method for further studies in complex environments.

The objective of the protocol is to detail how to collect video data for use in the laboratory; how to record eye-tracking data of participants looking at the data and how to efficiently analyze the content of the videos that they were looking at using a machine learning technique.

Combinando los datos de seguimiento ocular con un análisis de contenido de vídeo de la visualización gratuita de un vídeo de un paseo en un entorno de parque urbano

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. ...