Este método permite a los investigadores determinar las condiciones óptimas de pulsación de electroporación para el tipo de célula deseado, al tiempo que minimiza la necesidad del enfoque experimental empírico tradicional. Este método utiliza técnicas de microelectroporación para fabricar un dispositivo de actuación microfluídica escalable que es capaz de monitorear eléctricamente el grado de permeabilización de la membrana celular durante todo el proceso de electroporación. Demostrando el procedimiento estará Kishankumar Busha, un estudiante de maestría de mi laboratorio.
Para comenzar, asegure la oblea de silicio al mandril de la recubrida de centrifugado de obleas utilizando el sistema de vacío de la recubridora de centrifugado. Luego programa el spinner. A continuación, dispense cuatro mililitros de SU-8 2010 foto resistir en el centro de la oblea de silicio y ejecutar el programa.
Una vez que el sistema se detenga, apague la aspiradora. Luego asegure la máscara fotográfica con los diseños de canales microfluídicos 2D en el soporte de la máscara e inserte la oblea de silicio con el recubrimiento SU-8 hacia arriba en el mandril de la oblea. Establezca la configuración de exposición para 150 milijulios por centímetro cuadrado y haga funcionar la máquina.
Después de la exposición a los rayos UV, sumerja la oblea de silicio en la solución de revelador SU-8 con una agitación suave durante tres o cuatro minutos. Luego retire la oblea de la solución y enjuague la superficie con isopropanol. A continuación, coloque la oblea de silicio en un horno de 150 grados centígrados durante 30 minutos para una cocción dura.
Luego deje que se enfríe a temperatura ambiente antes de usar la perfilometría del lápiz óptico para medir la altura exacta y la pendiente de las paredes laterales del canal. A continuación, dispense un mililitro de foto resistente sobre la superficie de la diapositiva de vidrio y ejecute el programa una vez más. Una vez que el sistema se detenga, apague la aspiradora y retire el portaobjetos de vidrio.
Después de asegurar la máscara fotográfica con los diseños de electrodos 2D en el soporte de la máscara, inserte y alinee la oblea de vidrio con el recubrimiento S-1818 mirando hacia arriba sobre el mandril de la oblea. Establezca la configuración de exposición para 215 milijulios por centímetro cuadrado y ejecute la máquina. Después de la exposición, sumerja el portaobjetos de vidrio en la solución de revelador MF-319 durante dos minutos, aplicando una agitación suave.
Luego retire la oblea de vidrio y enjuague su superficie con agua desionizada. Finalmente, coloque la corredera de vidrio en el horno de 150 grados centígrados para una cocción dura, asegurándose de que la superficie de los sustratos de interés esté hacia arriba. Después de 30 minutos, retire el portaobjetos del horno y protéjalo de la luz.
Para grabar el portaobjetos de vidrio, sumérjalo en una solución de ácido fluorhídrico tamponado de 10 a 1 durante un minuto en un recipiente de politetrafluoroetileno. Luego transfiera y lave los portaobjetos de vidrio en agua desionizada tres veces. A continuación, utilizando un sistema físico de deposición de vapor, pulveriza titanio durante ocho minutos a una velocidad de 100 angstroms por minuto y platino durante 10 minutos a 200 angstroms por minuto.
Luego, para levantar la fotoresistencia, sumerja las diapositivas de vidrio recubiertas de metal en un baño de acetona durante 10 minutos y sonicar el baño para introducir agitación. Si es necesario, use una toallita empapada en acetona para eliminar cualquier residuo. Lo siguiente para el moldeo de réplica de polidimetilsiloxano hace la base de elastómero PDMS con un endurecedor en una relación de peso de 10 a 1 en un recipiente desechable colocado encima de una balanza electrónica.
Luego, vierta la solución PDMS sobre la oblea de silicio y coloque la mezcla al vacío para eliminar las burbujas de aire. Después de curar la mezcla a 65 grados centígrados durante un mínimo de cuatro horas, use la punta de una cuchilla de afeitar para cortar el PDMS moldeado y pelarlo de la oblea de silicio. Luego, con un punzón de biopsia afilado, retire el PDMS de la entrada y las salidas del dispositivo.
A continuación, programe el generador de plasma para la unión PDMS. Luego coloque el PDMS y la diapositiva de vidrio del electrodo en el sistema con las características hacia arriba y ejecute el programa. Una vez completado el programa, retire los dispositivos y use un estereoscopio para alinear rápidamente las características del canal con los electrodos.
Aplique firmemente presión desde el centro del PDMS hacia los lados para eliminar cualquier burbuja de aire no deseada en la interfaz de unión. Cosechar las células HEK293, centrifugarlas y resuspender el pellet en tampón de electroporación a aproximadamente cinco millones de células por mililitro. A continuación, agregue la codificación de ADN plasmático para GFP a una concentración final de 20 microgramos por mililitro y mezcle suavemente.
Luego transfiera la suspensión de células de plasma y ADN a una jeringa de un centímetro cúbico para experimentación. Coloque el microdispositivo en el escenario del microscopio a través de un portaobjetos. Luego encienda el dispositivo acoplado cargado, la cámara CCD y enfoque el canal microfluídico.
A continuación, para la electroporación de una sola celda, ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 0,1 a 0,3 microlitros por minuto para garantizar el flujo de células individuales a través del conjunto de electrodos. A continuación, ajuste los parámetros de pulso para el pulso de electroporación de energía eléctrica inicial y más bajo. Siga un número predeterminado de detecciones celulares por aplicación de pulso.
Al final de cada condición probada, aspire las células de la salida del microdispositivo y reponga la salida con medios de recuperación. Iterar a la siguiente condición de pulso de electroporación y repetir hasta que se prueben todas las condiciones de pulso de electroporación. A continuación, determine los parámetros de pulso de electroporación para una retroalimentación basada en la población de alto rendimiento.
Para la electroporación controlada por retroalimentación basada en la población, ajuste el caudal de la bomba de la jeringa a uno a tres microlitros por minuto y ajuste la amplitud del pulso a la condición optimizada. Luego desactive el modo de disparo y configure el ancho de pulso para que coincida con el tiempo de tránsito de la celda. Después de electroporar el número deseado de células, apague tanto la bomba de jeringa como el generador de funciones.
Luego transfiera las células del depósito de salida a un matraz o placa de cultivo celular del tamaño adecuado lleno de medios de recuperación precalentados y transfiera el matraz o placa de cultivo a una incubadora. Para el análisis de datos, cargue los datos en un software de análisis y genere una gráfica de corriente frente a tiempo para cada condición pulsante. Luego determine el grado de permeabilización de la membrana celular, genere el mapa de permeabilización de la membrana celular sobre todas las condiciones de pulso probadas y verifique la condición de pulsación óptima.
Después de la incubación, capture imágenes de epifluorescencia utilizando FITC y filtros rojos lejanos, y analice los conjuntos de imágenes manualmente o mediante un algoritmo. Aquí se destacan los principios operativos detrás de la detección de permeabilización a nivel de célula única para una amplitud de pulso única. Después de cada parámetro de pulso de electroporación, se prueba el siguiente pulso de electroporación de mayor energía.
El mapa de permeabilización de la membrana celular para las células HEK293 mostró una clara correlación entre la energía eléctrica aplicada y el grado de permeabilización de la membrana celular. En este experimento, se determinó como óptimo una intensidad de campo eléctrico de 1,8 kilovoltios por centímetro y un pulso de 670 microsegundos. A estos valores, se logró una eficiencia de electrotransfección del 70%.
En contraste con una intensidad de campo eléctrico de 0,4 kilovoltios por centímetro y una duración de pulso de tres milisegundos, la eficiencia de electrotransfección a las 24 horas fue inferior al 5%. Esta tecnología de electroporación se puede utilizar en proyectos de investigación biomédica adicionales, como la generación y prueba de células T con CAR o la optimización y prueba de técnicas de edición de genes CRISPR-Cas9. Esta tecnología de microelectroporación permite la interrogación eléctrica de las respuestas de diferentes tipos de células para aplicar las condiciones de pulso eléctrico y correlacionar esa información con la entrega de carga molecular clínicamente relevante.
