NGL fue apoyado por la Iniciativa Universitaria Perinatal Wayne State en maternas, perinatales y Salud Infantil. Agradecemos Maureen McGerty y Amy E. Furcron (Wayne State University) por su lectura crítica del manuscrito.

Antes de trabajar con las muestras mencionadas en este protocolo, la aprobación ética animal debe ser dada por el Comité de Ética Local de Investigación y las Juntas de Revisión Institucional. Cuando se trabaja con sangre animal, células o agentes peligrosos que se mencionan en este protocolo, las medidas de bioseguridad y seguridad de laboratorio adecuados se deben seguir. 1. Manejo del ratón y Tejidos Colección <ol><li> Preparar una estación de trabajo estéril y obtener herramientas estériles para la recogida de tejidos. Estas herramientas incluyen grandes y pequeñas tijeras quirúrgicas, pinzas y pinzas de punta fina. Incluir pequeñas placas de Petri marcadas con los nombres tejido apropiado, lleno de solución 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (de 3 - 5 ml) equilibrada a RT de (20 - 22 ° C). También incluir una gran placa de Petri, no marcado, lleno de solución PBS 1x (10 - 15 ml). </li><li> La eutanasia a un ratón embarazadas (10,5 a 19,0 días post-coito (dpc) o antes de la entrega) utilizando dióxido de carbono (CO 2). Para asegurarse de que el ratón es sacrificado, utilice la técnica de dislocación cervical. Nota: Antes de 10,5 dpc, es difícil separar manualmente los tejidos deciduales de los tejidos uterinos. Si no se requiere el aislamiento de los leucocitos deciduales, leucocitos de los tejidos uterinos de ratones no embarazadas o los de ratones a &lt;10,5 dpc pueden también ser realizadas siguiendo este protocolo. </li><li> Con un par de tijeras quirúrgicas estériles, eliminar por completo la parte inferior del abdomen de la piel y el tejido muscular. Con unas pinzas, a un lado todos los demás órganos hasta que el útero y los ovarios son visibles. Con el útero todavía unido, utilice el fórceps para moverlo fuera de la cavidad peritoneal (Figura 1A). </li><li> Localice los ovarios distal a la unión oviducto y uterotubárica de cada cuerno uterino. Uso de las pequeñas tijeras quirúrgicas, hacer una incisión en la unión útero-tubárica y separar los cuernos uterinos de la mesenterio que contiene los vasos uterinos; después,especial en el cuello del útero para separar los cuernos uterinos de la cavidad peritoneal (Figura 1B). </li><li> Con pequeñas tijeras quirúrgicas, hacer una incisión entre el cuello del útero y el segmento inferior de los cuernos uterinos. Dejar adjunta una porción del cuello del útero durante este proceso (Figura 1C) para evitar la apertura de la trompa uterina. </li><li> Sumergir los cuernos uterinos (incluyendo el cuello del útero) en un gran plato de Petri llena con una solución de PBS 1x (10 - 15 ml) para hidratar los sitios de implantación. </li><li> Aunque todavía inmerso en solución de PBS 1x, recortar la grasa de los cuernos uterinos con las pequeñas tijeras quirúrgicas. Mantener los tejidos sumergidos en solución de PBS 1x a lo largo de la disección. </li><li> La celebración de los cuernos uterinos en su lugar con las pinzas, quite uno de los lugares de implantación del útero con un corte transversal a través de la región inter-implantación, utilizando las pequeñas tijeras quirúrgicas (Figura 1D). El sitio de implantación contiene el feto, rodeado por elmembrana corioalantoidea, y el útero, decidual, y los tejidos placentarios. </li><li> Usando las pinzas, mantenga el sitio en su lugar y hacer una pequeña incisión en la pared uterina adyacente a la placenta y los tejidos deciduales (Figura 1E). Recorte alrededor del perímetro de la placenta / decidua hasta que éstos se separan tanto de la pared uterina y la membrana corioalantoidea que incluye el feto (Figura 1F). </li><li> Retire la placenta y tejidos deciduales adjuntos y lugar en solución PBS 1x (3-5 ml; consulte el paso 1.12). </li><li> Coloque el feto rodeado por la membrana corioalantoidea unido a los tejidos uterinos en una placa de Petri llena con solución de PBS 1x (de 3 - 5 ml). La hidratación de estos tejidos facilitará la separación de la membrana corioalantoidea de la pared uterina (véase el paso 1,14). </li><li> Con un par de pinzas de punta fina, pelar suavemente el tejido decidual (capa blanco-gris) de la superficie de la placenta. Realice estepaso cuidadosamente para mantener la integridad de la placenta y los tejidos deciduales (Figura 1G). </li><li> Coloque la placenta y los tejidos deciduales en dos platos etiquetados por separado Petri llenas de solución de PBS 1x (3-5 ml cada una). </li><li> Retire con cuidado la pared uterina de la membrana corioalantoidea con unas pinzas de punta fina. Estos son los tejidos uterinos. </li><li> Coloque los tejidos uterinos en una placa de Petri llena de solución de PBS 1x (de 3 - 5 ml). </li><li> Repita los pasos 1.8 a través de 1,15 hasta que se hayan procesado todos los lugares de implantación. </li><li> Recoger varios uterino, decidual, y tejidos de la placenta para mejorar el rendimiento de las células durante la digestión enzimática. La cantidad de los tejidos depende del tamaño de la camada; sin embargo, el aislamiento de leucocitos requiere&gt; 2 piezas de tejido. Nota: Para obtener información más detallada sobre la disección de los lugares de implantación en diferentes días de gestación, ver las imágenes que se encuentran en el capítulo dos de la Guía de Investigatiel ratón del Embarazo 42. </li></ol> 2. uterino, decidual y placenta Tejido Disociación <ol><li> Etiquetar varios 2 ml estériles tubos cónicos con el nombre de tejido apropiado, y coloque un vial con 1.000 l de solución enzimática en hielo. </li><li> De la placa de Petri llena de solución de 1x PBS, transferir dos piezas (100 - 150 mg) de la uterino, decidual, o tejidos de la placenta a un tubo cónico de 2 ml etiquetados. </li><li> Añadir 500 l de solución enzimática en frío en cada tubo cónico de 2 ml. </li><li> Con tijeras estériles finas, comenzar a disociar el tejido sumergido en la solución enzimática hasta que se picada finamente. Con el tiempo, la suspensión se desarrollará un aspecto lechoso. Este paso no debe exceder más de 2 min para evitar el exceso de manipulación de la muestra. </li><li> Una vez que el tejido ha sido disociado, añadir un extra de 500 l de solución enzimática frío al tubo cónico de 2 ml. </li><li> Coloque el tubo cónico de 2 ml en hielo. </li><li> Repita los pasos 2.2 a 2.6 con cada tejido hasta que se hayan procesado todos los tejidos. </li><li> Transfiera todas las 2 ml tubos cónicos con tejido homogeneizado (tejido picado + solución enzimática) muestras del hielo en una incubadora a 37 ºC y realizar una agitación orbital suave (80 rpm). Incubar durante 30 - 35 min. Asegúrese de que la temperatura de la incubadora se estabiliza antes de iniciar el tiempo de incubación. </li><li> Después de la incubación, retirar los 2 ml tubos cónicos con tejidos disociados de la incubadora y colocarlos en hielo para evitar la digestión más. </li><li> Etiquetar estériles 50 ml tubos cónicos de acuerdo con el tipo de tejido. Retire las tapas y reemplazarlos con un filtro de células estéril (100 micras de tamaño de poro). </li><li> Verter los tejidos disociados de los 2 ml tubos cónicos a través del filtro de células utilizando ~ 20 ml de solución de PBS 1x. Los fragmentos de tejido permanecerán en el filtro de células y la suspensión de células pasarán a través de él. </li><li> Lave el ditejidos ssociated en el filtro de células de 2 - 3 veces con 20 ml de solución de 1x PBS utilizando una pipeta de transferencia. </li><li> Enjuague los vacíos 2 ml tubos cónicos con solución de PBS 1x (1 ml) y verter el contenido a través de los tamices de células. </li><li> Quite los filtros celulares de los 50 tubos cónicos ml y reemplazar las tapas. Centrifugar los tubos a 1250 xg durante 10 min a 4 ºC. </li><li> Con cuidado, aspirar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. El sedimento celular contiene los leucocitos aislados y células del estroma. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento celular en 1 ml de medio de cultivo RPMI sin suero fetal bovino (FBS). Mezclar suavemente. No utilice vórtice. </li><li> Añadir 500 l de FBS limpias a un tubo de plástico de poliestireno de 5 ml y superponer lentamente la suspensión celular. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 1.100 xg sin el freno a TA para sedimentar las células viables mientras que los desechos celulares se retiene en la interfase PBS / FBS. </li><li> Aspirar el sobrenadante sin tocar el sedimento celular. El cell pellet contiene principalmente células viables. </li><li> Opcionalmente: Para concentrar las células mononucleares, utilizar una solución de polisacárido saturada 20%, como se describe a continuación. <ol><li> Resuspender el sedimento celular en 1.000 l de medio de cultivo RPMI sin FBS. </li><li> Añadir 1 ml de solución de polisacárido saturada 20% a un tubo de plástico de poliestireno de 5 ml y superponer lentamente la suspensión celular en la parte superior de esta solución, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mientras capas de la muestra, evitar la mezcla de la solución de polisacárido saturada 20% con la suspensión de células. </li><li> Centrifugar con un rotor basculante a 500 xg durante 30 minutos a temperatura ambiente y sin freno. Es muy importante para desactivar el freno para evitar la mezcla de las células y perder el gradiente. Las células mononucleares se encuentran en la interfaz entre la solución de polisacárido saturada 20% y la solución 1x PBS. </li><li> Aspirar y desechar el sobrenadante. El sedimento celular contiene células mononucleares en su mayoría. Note: Para realizar la tinción de viabilidad y tinción intracelular, consulte el paso 3. Para realizar inmunofenotipo, consulte el paso 4. Para llevar a cabo la tinción de viabilidad y sólo tinción extracelular, consulte el paso 5. Para realizar un cultivo de células de leucocitos aislados, consulte el paso 6. Para llevar a cabo clasificación de células magnético, consulte el paso 7. </li></ol></li></ol> 3. La tinción de viabilidad de células fijables <ol><li> Resuspender el sedimento celular en 1.100 l de solución de PBS 1x. Mezclar suavemente utilizando un micro-pipeta. </li><li> Transferir 100 l de la suspensión celular en un tubo de plástico 5 ml de poliestireno. Añadir 400 l de solución de PBS 1x para el tubo de poliestireno de 5 ml. Este tubo es un control para el tejido auto-fluorescencia. Almacenar a 4 ° C hasta el paso 3.5. </li><li> La transferencia de los 1000 l restantes de la suspensión celular a un nuevo tubo de plástico de poliestireno de 5 ml. Añadir 1 l de colorante viabilidad y homogeneizar suavemente. Incubar durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Después de la incubación, añada 1000 &amp; #181; l de solución de 1x PBS. Mezclar suavemente con la mano. </li><li> Centrifugar ambos tubos de plástico de poliestireno 5 ml (pasos 3.2 y 3.3) a 1250 xg durante 10 min a 4 ºC. Aspirar y desechar el sobrenadante. Nota: El sedimento celular (paso 3.3) se utilizará en el paso 4. El pellet de células (paso 3.2) servirá como un control para el tejido auto-fluorescencia. </li></ol> 4. Inmunofenotipificación <ol><li> Resuspender el sedimento celular en 50 l de anti-ratón CD16 / CD32 (diluido 1: 100 en tampón FACS [0,1% de BSA, azida de sodio 0,05%, solución 1x PBS, pH 7,4]). Mezclar la suspensión celular suavemente. No utilice el vórtice. </li><li> Incubar la suspensión de células en el tubo de poliestireno de 5 ml en la oscuridad a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Después de la incubación, añadir 50 l de cada anticuerpo monoclonal anti-leucocitos reaccionar con marcadores de superficie celular extracelular o anticuerpo de control de isotipo (diluciones de anticuerpos deben ser validados). Por ejemplo, para analizar subpoblaciones de leucocitos, usar anti-moutilizar anticuerpos que reaccionan con los siguientes marcadores de superficie de células de leucocitos: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, y CD8 (Tabla 1). </li><li> Una vez que los anticuerpos contra marcadores extracelulares se han añadido al tubo de plástico de poliestireno 5 ml, mezclar suavemente. Incubar en la oscuridad durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Durante esta incubación, preparar y pre-calentar la solución tampón de fijación (diluido con agua desionizada, 1: 5) a 37 ºC, si es necesario. Mantenga el tampón a 37 ºC en la oscuridad hasta que su uso es necesario. </li><li> Después de 30 min de incubación, añadir 500 l de tampón FACS en el tubo de plástico de poliestireno de 5 ml y mezclar suavemente. Este paso es necesario para lavar las células y eliminar el exceso de anticuerpo no unido. </li><li> Centrifugar las muestras a 1250 xga 4 ° C durante 10 minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante. Nota: Si no se requiere la tinción intracelular, consulte el paso 5. Si se requiere la tinción intracelular, realice permeabilización y intracelulartinción ular aquí y, a continuación, proceder a la fijación (paso 4.8). </li><li> Añadir 500 l de la solución tampón de fijación pre-calentado al sedimento celular y se incuba en la oscuridad durante 10 min a 37 ºC. </li><li> Dispensar 500 l de tampón FACS en el tubo de plástico de poliestireno de 5 ml. Mezclar suavemente. </li><li> Centrifugar las muestras a 1250 xga 4 ° C durante 10 minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir 500 l de tampón de FACS a cada muestra. Estas muestras pueden ahora ser analizadas por citometría de flujo. Adquirir las muestras inmediatamente para obtener mejores resultados. </li></ol> 5. La tinción de viabilidad de células irreparable <ol><li> Después de inmunofenotipificación extracelular, resuspender el sedimento celular en 500 l de tampón FACS. </li><li> Añadir 1 l de 4 &#39;, dihidrocloruro de 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 200 g / ml) justo antes de la adquisición de la muestra. </li><li> Visualice las muestras dentro de 1 - 2 minutos después de la adición de DAPI utilizando un citómetro de flujo. </li></ol><ol><li> Preparar una estación de trabajo bajo una campana de humos estéril. Pre-calentar el medio de cultivo RPMI a 37 ° C usando un baño de agua. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 1.000 l de tampón FACS para el recuento celular. </li><li> Contar el número de células viables utilizando un contador celular automático o hemocitómetro y solución de azul de tripano al 0,4%, siguiendo las instrucciones del fabricante. Anote el número total de células vivas. </li><li> Centrifugar las células a 1250 xga 4 ° C durante 10 min para eliminar el tampón FACS. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 500 l de medio de cultivo RPMI-pre calentado suavemente pipeteando 2 a 3 veces. </li><li> Placa el número deseado de células en una placa de 24 pocillos estéril y se incuba a 37 ° C. El tiempo de incubación será determinado por la pregunta de investigación. </li></ol> 7. Clasificación celular magnética <ol><li> Configurar una estación de trabajo limpia con los siguientes materiales: Columnas MS, separador celular magnética, 15tubos cónicos ml, 30 micras filtros pre-separación, y un multi-soporte. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 500 l de tampón MACS (0,5% de BSA, 2 mM EDTA, solución 1x PBS, pH 7,2). </li><li> El uso de un contador de células automático o hemocitómetro y el 0,4% de solución de azul de tripano, contar y registrar el número total de células vivas. </li><li> Centrifugar las células a 1250 xga 4 ° C durante 10 minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante. Añadir otros 500 l de tampón MACS. </li><li> Proceda a realizar la separación magnética siguiendo las recomendaciones del fabricante. </li><li> Determinar la pureza por citometría de flujo o microscopía. </li></ol>

Los autores describen ningún conflicto de intereses.

La recogida de datos consistentes que registra las características de abundancia y fenotípicas de los leucocitos infiltrantes en la interfase materno-fetal es esencial para la comprensión de la patogénesis de las complicaciones relacionadas con el embarazo. Varias técnicas se han descrito que facilitan el aislamiento de la infiltración de leucocitos de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal durante el embarazo 31,38,39,43-46. Sin embargo, cada técnica es diferente, utiliza enzimas o combinac...

La tolerancia inmune durante el embarazo es un período en que se producen cambios distintivos en el sistema inmunológico de la madre. Estos cambios permiten a la madre para tolerar el feto, un injerto alogénico semi-1. El feto expresa paternal complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) antígenos de 2, y las células fetales se han encontrado en la circulación materna 3; sin embargo, el feto no se rechaza 4,5. Este enigma no se entiende completamente. La hipótesis más reciente afirma que se crea la tolerancia materno-fetal durante el coito y su fecundación 6,7 y mantenido para sostener un embarazo a término 8-10. El desglose de esta tolerancia materno-fetal se considera un mecanismo de la enfermedad durante las primeras y últimas etapas del embarazo 10-16. La tolerancia materno-fetal consiste en la participación de los diversos sub-poblaciones de leucocitos, incluyendo las células T (células T reguladoras, las células Th1, células Th2 y células Th17), macrophages, neutrófilos, mastocitos, células NK, y células NKT, células dendríticas y células B, que el cambio en la densidad y localización durante todo el embarazo 15,17-19. Tolerancia materno-fetal se enriquece en la interfase materno-fetal 20 - el sitio anatómico donde el sistema inmune de la madre interactúa con los antígenos fetales 20,21. Se crea la interfaz materno-fetal durante la placentación cuando las células trofoblásticas extravillous fetales invaden la mucosa uterina 22-24. En el lado fetal de esta interfaz, las membranas que rodean al feto crean una superficie epitelial especializada dentro de la placenta, y las células sincitiotrofoblasto controlan el intercambio de nutrientes a través de su contacto directo con la sangre materna 22. En el lado materno de la interfaz, el decidua recluta una piscina heterogéneo de leucocitos en ratones que representan el 30% a 50% de todas las células deciduales. Además de su participación en maternAl tolerancia inmune, estas células son los principales contribuyentes a los distintos procesos durante el embarazo, por ejemplo., la protección del tracto reproductivo de las infecciones, la fecundación, la implantación del embrión 7,25, la angiogénesis decidual 26, remodelado vascular 24,27, la invasión del trofoblasto 28, de la placenta desarrollo 24,25, y, en última instancia, el trabajo y la entrega 15,17. Por lo tanto, el estudio de los leucocitos implicados en la tolerancia materno-fetal es esencial para dilucidar la patogénesis de las complicaciones relacionadas con el embarazo. Aunque el uso de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia ha generado datos para la visualización directa y localización de uterina, decidual, o leucocitos placentarios 29,30, citometría de flujo análisis ha revelado también subconjuntos específicos de leucocitos en cada uno de estos tejidos 31,32. Además, la citometría de flujo se ha utilizado para determinar la densidad y la proporción de maternal-fetal interfaz de leucocitos 33 y de expresión los niveles de proteínas extracelulares e intracelulares 8-10,34. Análisis de citometría de flujo de leucocitos en la interfase materno-fetal requiere una suspensión de una sola célula. Con el fin de aislar los leucocitos infiltrantes de la decidual, uterino, y tejidos de la placenta, se han utilizado dos métodos de disociación de tejidos: mecánica y enzimática. Ambos métodos permiten la separación de los leucocitos infiltrados de la matriz extracelular (ECM) de estos tejidos. Disociación enzimática de tejido es superior a la disociación de tejido mecánica, ya que permite un mayor rendimiento de los leucocitos con daño asociado a la fuerza de cizallamiento menos 35. En consecuencia, la disociación de tejido mecánico requiere la agrupación de tejidos 36, que pueden aumentar la variabilidad y la heterogeneidad de las muestras. Sin embargo, la disociación mecánica puede ser la opción cuando el antígeno de interés puede ser alterada por disociación enzimática o cuando la funcionalidad de la células de las necesidades de interés que se conserva (por ejemplo., la citotoxicidad de las células NK) 35. El uso de la proteolisis con enzimas específicas para degradar la ECM elimina los bajos rendimientos observados con disociación mecánica. Varios estudios han reportado el uso de tripsina 32, colagenasa 37, DNasa 31, Dispasa 38 y cócteles comerciales de diversas enzimas 32,39. Sin embargo, la naturaleza y concentración de diferentes enzimas y la duración de la digestión deben ser meticulosamente definidos y validados con el fin de asegurar el mantenimiento de la integridad de los epítopos antigénicos de la superficie celular necesarias para inmunofenotipo. Las diversas estructuras de la superficie son diferencialmente susceptibles a la destrucción por diferentes enzimas, con algunas enzimas, tales como tripsina, siendo notorio para pelar epítopos de superficie de leucocitos reconocidos por muchos anticuerpos monoclonales. Introducido en el presente documento es un método que utiliza un proteolytic y cóctel enzimático colagenolítica, llamado Accutase. Esta solución enzimática es lo suficientemente suave mientras que todavía eficiente en disociar tejidos murinos en la interfase materno-fetal, y no requiere la adición de otros reactivos o suero de disociación para terminar la reacción de disociación. Por otra parte, está listo para usar tal como se suministra y, aunque el tiempo de disociación debe ser validado, es más robusto que las enzimas mencionadas anteriormente 40,41. La utilización de una combinación de ambos tipos de desagregación del tejido mejora la calidad y la cantidad de células obtenidas; Por lo tanto, varios estudios han implementado el uso combinado de disociación mecánica y enzimática con resultados satisfactorios 31,32,37. El protocolo descrito en este documento se estableció y validó en nuestro laboratorio; que utiliza una combinación de una disociación mecánica suave seguido por una desagregación enzimática robusto. Este protocolo permite el estudio y el aislamiento adicional delos leucocitos infiltran en los tejidos murinos en la interfase materno-fetal (útero, decidua y placenta). El siguiente protocolo también mantiene la integridad de los marcadores de superficie celular y los rendimientos de células viables suficiente para aplicaciones posteriores como se demuestra por análisis de citometría de flujo. Finalmente, este protocolo mantiene la consistencia de la preparación de células para el análisis y la comparación de diferentes tejidos murinos que componen la interfaz materno-fetal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Magentic Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Separator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre separation filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe lock conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse extracellular antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface

La tolerancia inmunológica en el embarazo requiere que el sistema inmunológico de la madre experimenta cambios distintivos para aceptar y nutrir al feto en desarrollo. Esta tolerancia se inicia durante el coito, establecido durante la fecundación y la implantación, y se mantiene durante todo el embarazo. Mediadores celulares y moleculares activos de la tolerancia materno-fetal se enriquecen en el sitio de contacto entre los tejidos fetales y maternas, conocidos como la interfaz materno-fetal, que incluye la placenta y el útero y los tejidos deciduales. Esta interfaz se compone de las células del estroma y leucocitos infiltrantes, y sus características fenotípicas de abundancia y cambia en el transcurso del embarazo. Leucocitos infiltrantes en la interfase materno-fetal incluyen neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, mastocitos, células T, células B, células NK, las células NKT y que juntos crean el micro-entorno local que sustenta el embarazo. Un desequilibrio entre estas células o cualquier inappropalteración piados en sus fenotipos se considera un mecanismo de la enfermedad en el embarazo. Por lo tanto, el estudio de los leucocitos que se infiltran en la interfase materno-fetal es esencial con el fin de dilucidar los mecanismos inmunológicos que conducen a complicaciones relacionadas con el embarazo. Descrito en el presente documento es un protocolo que utiliza una combinación de disociación mecánica suave seguido por una desagregación enzimática robusto con una proteolítica y cóctel colagenolıtica enzimática para aislar los leucocitos infiltrantes de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal. Este protocolo permite el aislamiento de un gran número de leucocitos viables (&gt; 70%) con propiedades antigénicas y funcionales suficientemente conservadas. Leucocitos aislados pueden ser analizados mediante varias técnicas, incluyendo la inmunofenotipificación, clasificación de células, formación de imágenes, inmunotransferencia, la expresión de ARNm, cultivo celular, y en ensayos funcionales in vitro tales como reacciones mixtas de leucocitos, la proliferación, o ensayos de citotoxicidad.

La disección de los tejidos murinos de la interfaz materno-fetal se muestra en la Figura 1; Este procedimiento incluye la apertura de la cavidad peritoneal (Figura 1A, B), cuernos uterinos (Figura 1C), incluyendo los sitios de implantación (Figura 1D), y la colección de los tejidos uterinos (Figura 1E), placenta (Figura 1F), y los tejidos deciduales (Figura 1G) a 16,5 dpc. La Figura 2</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Aislamiento de leucocitos a partir de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

isolation-leukocytes-from-murine-tissues-at-maternal-fetal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.1K vistas.  Wayne State University School of Medicine. Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis. 

Video: Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

El aislamiento de la infiltración de leucocitos cerebro-

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Investigación

Inmunología e Infección

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Aislamiento y análisis de Brain-secuestrados Los leucocitos de<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA de ratones infectados

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioenergética y los Oxidativo ráfaga: Los protocolos para el aislamiento y la Evaluación de leucocitos humanos y plaquetas

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Aislamiento y Trasplante de diferentes Aged murinos tímicos injertos.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Aislamiento de leucocitos de la interfaz humana Materno-fetal

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón Piel Usando enzimática Digest y Separación de degradado

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...