NGL נתמכה על ידי Perinatal אוניברסיטת היוזמה ויין מדינה באימהי, Perinatal ובריאות ילד. אנו בתודה להכיר מורין McGerty ואיימי א Furcron (אוניברסיטת ויין סטייט) לקריאה הביקורתית שלהם של כתב היד.

המחברים לחשוף אין ניגודי אינטרסים.

איסוף נתונים עקביים שמתעד את מאפייני השפע ופנוטיפי של לויקוציטים מסתנן בממשק אימהי-העוברי הוא חיוני להבנת הפתוגנזה של סיבוכים הקשורים להריון. כמה טכניקות תוארו המאפשרות הבידוד של חדירה לויקוציטים מהרקמות עכברי בממשק האימהי-עוברי במהלך הריון 31,38,39,43-46. עם זאת, ?...

סובלנות חיסונית בהריון היא תקופה בה שינויים ייחודיים להתרחש בתוך המערכת החיסונית של האם. שינויים אלו מאפשרים לאם לעובר תסבול, שתל למחצה אלוגנאית 1. העובר מבטא מורכב histocompatibility גדול אבהי (MHC) אנטיגנים 2, ותאים עובריים כבר נמצאו במחזור הדם האימהי 3; עם זאת, העובר לא נדחה 4,5. חידה זה לא מובן לחלוטין. ההשערה האחרונה קובע כי סובלנות אימהית-עוברית נוצר במהלך משגל והפרית 6,7 ומתוחזק כדי לקיים הריון טווח מלא 8-10. פירוט של סובלנות אימהית-עוברי זה נחשב מנגנון של מחלה במהלך הריון 10-16 המוקדם ומאוחר שלבים. סובלנות האם ועובר כרוך בהשתתפות תת-אוכלוסיות לויקוציטים שונות, כוללים תאי T (תאי T רגולטורים, תאי Th1, תאי Th2, ותאי TH17), מקrophages, נויטרופילים, תאי פיטום, תאי NK, ותאי NKT, תאים דנדריטים, ותאי B, ששינוי בצפיפות ולוקליזציה במהלך הריון 15,17-19. סובלנות האם ועובר מועשרת בממשק אימהי-העוברי 20 - האתר אנטומיים בי המערכת החיסונית של האם אינטראקציה עם אנטיגנים העובריים 20,21. הממשק אימהי-העוברי נוצר במהלך placentation כאשר תאי trophoblast extravillous העובריים לפלוש רירית רחם 22-24. בצד העוברי של ממשק זה, הקרומים המקיפים את העובר ליצור משטח אפיתל מיוחד בתוך השליה, ותאי syncytiotrophoblast לשלוט בבורסה התזונתית באמצעות המגע הישיר שלהם עם דם אימהי 22. בצד האימהי של הממשק, decidua מגייס בריכת הטרוגנית של לויקוציטים שבעכברים כ -30% עד 50% מכל תאי decidual. בנוסף להשתתפותם בmaternסובלנות חיסונית אל, תאים אלה הם תורמים מרכזיים לתהליכים שונים במהלך הריון, למשל., שליה ההגנה על מערכת הרבייה מזיהומים, הפריה, השרשת עובר 7,25, אנגיוגנזה decidual 26, שיפוץ כלי דם 24,27, פלישת trophoblast 28, פיתוח 24,25, וסופו של דבר, עבודה ומסירה 15,17. לכן, המחקר של לויקוציטים המעורב בסובלנות אימהית-עוברית הוא חיוני להבהרת פתוגנזה של סיבוכים הקשורים להריון. בעוד שהשימוש באימונוהיסטוכימיה וimmunofluorescence יצר נתונים להדמיה הישירה והלוקליזציה של רחם, decidual, או כדוריות דם לבנות שליה 29,30, cytometry זרימת הניתוח חשף נוסף תת ספציפי של לויקוציטים בכל אחד מרקמות אלה 31,32. בנוסף, cytometry זרימה נעשה שימוש כדי לקבוע את הצפיפות וחלקם של מאטרסופי-עוברי ממשק לויקוציטים 33 וביטוי רמות של חלבונים תאיים ו תאיים 8-10,34. ניתוח תזרים cytometric של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי דורש השעיה תא בודד. כדי לבודד לויקוציטים מסתנן מdecidual, הרחם, ורקמות שליה, שתי שיטות של ניתוק רקמה שימשו: מכאנית והאנזימטית. שני השיטות לאפשר את ההפרדה של לויקוציטים הסתנן מהמטריצה ​​תאית (ECM) של רקמות אלה. ניתוק רקמה אנזימתי עדיף על ניתוק רקמה מכאני שכן היא מאפשרת תשואה גבוהה יותר של כדוריות דם לבנות עם הנזק קשור-כוח גזירה פחות 35. כתוצאה מכך, ניתוק רקמה מכאני דורש איגום רקמות 36, אשר עשוי להגדיל את השונות וההטרוגניות של הדגימות. עם זאת, ניתוק מכאני עשוי להיות הבחירה כאשר אנטיגן של עניין ניתן לשנות על ידי ניתוק האנזימטית או כאשר פונקציונלי של התאים של צורך העניין לשימור (לדוגמא., רעיל של תאי NK) 35. השימוש בproteolysis עם אנזימים ספציפיים לבזות ECM מבטל את התשואות נמוכות שנצפו עם ניתוק מכאני. מספר מחקרים דיווחו על השימוש בטריפסין 32, collagenase 37, 31 DNase, dispase 38, וקוקטיילים מסחריים של אנזימים שונים 32,39. עם זאת, הטבע והריכוז של אנזימים שונים ואת משך הזמן של עיכול חייב להיות מוגדר בקפדנות ומאומתים על מנת להבטיח שמירה על שלמותו של אפיטופים אנטיגני פני תא הנדרשים לimmunophenotyping. מבני המשטח שונים באופן דיפרנציאלי רגישים להרס על ידי אנזימים שונים, עם כמה אנזימים, כגון טריפסין, להיות ידוע לשמצה בהפשטת epitopes משטח יקוציט מוכרת על ידי רבים נוגדנים חד-שבטיים. הציג במסמך זה הוא שיטה באמצעות proteolytIC וקוקטייל האנזימטית collagenolytic, נקרא Accutase. פתרון האנזימטית זה עדין מספיק ועדיין יעיל במתנער רקמות עכברי בממשק האימהי-עוברי, ואינו דורש תוספת של חומרים כימיים מתנערים אחרים או סרום לסיים את תגובת הניתוק. יתר על כן, הוא מוכן לשימוש כפי שסופק ו, למרות שהזמן של ניתוק צריך להיות מאומת, זה יותר חזק מאשר האנזימים הנ&quot;ל 40,41. הניצול של שילוב של שני הסוגים של רקמות disaggregation משפר את האיכות וכמות התאים שהושגו; כך, מספר מחקרים יישמו את השימוש בשילוב של ניתוק מכאני והאנזימטית עם תוצאות משביעות רצון 31,32,37. הפרוטוקול המתואר במסמך זה הוקם ומאומתים במעבדה שלנו; היא משתמשת בשילוב של ניתוק מכאני עדין ואחריו disaggregation האנזימטית חזק. פרוטוקול זה מאפשר מחקר והבידוד נוסף שללויקוציטים מסתנן ברקמות עכברית בממשק האימהי-עוברי (רחם, decidua, ושליה). הפרוטוקול הבא גם שומר על השלמות של סמנים פני תא ותשואות מספיק תאי קיימא עבור יישומים במורד הזרם כפי שהודגם על ידי ניתוח התזרים cytometric. לבסוף, פרוטוקול זה שומר על העקביות של תא הכנה לניתוח והשוואה של רקמות עכברי שונות המרכיבות את הממשק אימהי-עוברי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Magentic Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Separator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre separation filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe lock conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse extracellular antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface

סובלנות חיסונית בהריון דורשת שהמערכת החיסונית של האם עוברת שינויים ייחודיים במטרה לקבל ולטפח את העובר המתפתח. סובלנות זה הוא שיזמה במהלך משגל, הוקמה במהלך הפריה וההשתלה, ונשמרה לאורך הריון. מתווכים תאיים ומולקולריים פעילים של סובלנות אימהית-עוברית מועשרים באתר של קשר בין רקמות עובריות ואימהיות, הידוע בממשק האימהי-עוברי, הכולל את השליה ורחם ורקמות decidual. ממשק זה מורכב מתאי סטרומה ולויקוציטים הסתננות, ומאפייני השפע ופנוטיפי לשנות במהלך ההריון. לויקוציטים מסתנן בממשק האימהי-עוברי כולל נויטרופילים, מקרופאגים, תאים דנדריטים, תאי פיטום, תאי T, תאי B, תאי NK, ותאי NKT שיחד יוצרים מיקרו-הסביבה המקומית המקיימת הריון. חוסר איזון בין תאים אלה או כל inappropשינוי riate בפנוטיפים שלהם נחשב למנגנון של מחלה בהריון. לכן, המחקר של לויקוציטים שלהסתנן הממשק אימהי-העוברי הוא חיוני על מנת להבהיר את מנגנוני החיסון שיובילו לסיבוכים הקשורים להריון. תאר במסמך זה הוא פרוטוקול שמשתמש בשילוב של ניתוק מכאני העדין ואחריו disaggregation האנזימטית חזק עם מפרקי חלבונים וקוקטייל האנזימטית collagenolytic לבודד את כדוריות דם לבנות שחדרו מהרקמות עכברי בממשק אימהי-העוברי. פרוטוקול זה מאפשר הבידוד של מספרים גבוהים של כדוריות דם לבנות קיימא (&gt; 70%) עם מאפייני אנטיגני ופונקציונליים מספיק שימור. אז יכולים להיות מנותח על ידי כדוריות דם לבנות מבודדים כמה טכניקות, כולל immunophenotyping, מיון תא, הדמיה, immunoblotting, ביטוי mRNA, תרבית תאים, ובמבחני מבחנה פונקציונליים כגון תגובות מעורבות לויקוציטים, הפצה, או מבחני רעילים.

הנתיחה של רקמות עכברי מהממשק האימהי-העוברי מוצגת באיור 1; הליך זה כולל פתיחת חלל הצפק (איור 1 א &#39;, ב&#39;), קרן הרחם (איור 1 ג) כוללים אתרי ההשתלה (1D איור), והאוסף של רקמות הרחם (איור 1E), שליה (איור 1F), ורקמות decidual (איו?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

isolation-leukocytes-from-murine-tissues-at-maternal-fetal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.1K Views.  Wayne State University School of Medicine. Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis. 

Video: Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

שלית Decidual אדם תרבויות איברים ללמוד זיהומים בבית הממשק האם והעובר

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...