The research was supported by the National Research Council (CNR) of Italy. The authors thank GIRE members for collecting seed samples and are grateful to Alison Garside for revising the English.

1. Semilla Muestreo y almacenamiento <ol><li> Monitorear campos cultivados para el rendimiento herbicida pobres injustificada, es decir, no se debe a las condiciones climáticas adversas o tratamientos herbicidas de baja calidad. </li><li> Se recoge una muestra de semillas de una especie a la vez y asignar un código único. Las semillas maduras suelen ser recogidos antes de la cosecha de cultivos de plantas que habían sobrevivido al tratamiento (s) herbicida. Monitor oportuna para observar si las semillas se desprenden de la planta madre cuando madura. </li><li> Rellenar un formulario para cada muestra que indica el código único asignado, el nombre de la especie, fecha de recolección, coordenadas GPS, municipio, el nombre del agricultor, el tamaño del campo, nivel de infestación, los cultivos, los herbicidas (s) que se utilizan durante la temporada y los registros históricos del campo . </li><li> Recoger las semillas de al menos 30 plantas seleccionadas al azar que son representativos de la infestación de campo. Asegúrese de que la muestra de semillas contiene al menos 5.000 semillas maduras. Por una especie de malezas obligados cruzamiento(Por ejemplo, Lolium spp. O Amaranthus spp.), Reducir el número de plantas a 10-15, manteniendo el número total de semillas alrededor de 5000 11. </li><li> Sub-muestrear el campo si los parches de malezas se encuentran dispersos en grandes áreas (más de una hectárea) como los diferentes biotipos resistentes a herbicidas son seleccionados. </li><li> Tienda semillas en bolsas de papel sin sellar marcadas con el código único asignado. </li><li> Deje que se evapore la humedad pero no exponga semillas de alta temperatura (es decir, evitar lo que les deja en un coche bajo el sol) o fluctuaciones extremas de temperatura para evitar la inducción de la latencia secundaria. </li><li> Limpio (quitar la paja, las semillas de-casco, etc.) y almacenar a temperatura ambiente en un lugar seco. Después de realizar las primeras pruebas de resistencia, almacenar las semillas por largos períodos de tiempo en un cuarto oscuro a 4 ° C, preferiblemente en bolsas de plástico selladas al vacío. En esta manera semillas preservar su viabilidad durante un tiempo significativamente más largo. </li></ol> NOTA: latencia de la semilla proporciona un mecanismo flexible y eficiente que permite a las malas hierbas para adaptarse y persistir en los agroecosistemas. Para romper la latencia y permitir la germinación de semillas, diferentes protocolos tienen que ser utilizados, dependiendo de las especies de malezas, es decir, el tipo de latencia 16. Hay tres formas principales para eliminar la latencia: <ol><li> Vernalización NOTA: Para obtener la germinación simultánea y emergencia de las plántulas, un período de vernalización semillas que van desde unos pocos días a una semana es necesario para eliminar la latencia fisiológica de muchas especies:. Por ejemplo, Amaranthus retroflexus, Chenopodium album, Lolium spp, Avena fatua, Polygonum persicaria , Phalaris paradoxa 17-19. Se requiere un período de hasta 15 días más para Papaver rhoeas, Cyperus difformis y coccinea Ammania y hasta 30 días para que Schoenoplectus mucronatus <sup&gt; 20. <ol><li> Ponga un poco de agua desionizada en platos de plástico. Corte dos capas de papel de filtro y remojar en el agua, eliminar cualquier exceso. Coloque las semillas secadas al aire en el papel. La transferencia de los platos de plástico de una nevera a 4 ° C durante el período de tiempo requerido. </li></ol></li><li> Escarificación NOTA: Algunas especies de malas hierbas son más recalcitrantes a la germinación que otros debido a la latencia mecánica, es decir, características de la capa de semillas, y requieren el uso de una escarificación química con ácido sulfúrico a germinar 21. <ol><li> Preparar un vaso de precipitados con ácido sulfúrico concentrado (95-98%). Preparar un vaso lleno de agua. Ponga las semillas en un sobre de tela no tejida. </li><li> Remojar por ejemplo, semillas halepense Echinochloa spp. O sorgo durante 20 min o 5 min, respectivamente, en ácido sulfúrico concentrado. </li><li> Tome el sobre del vaso de precipitados con un par de pinzas y lo puso en el vaso lleno de agua. Abre elsobre, poner las semillas en un pequeño colador y enjuague a fondo con agua corriente. </li></ol> Variante: A. plantago-aquatica necesita un protocolo diferente 22, 23 <ol><li> Remoje las semillas durante 2 minutos en cloroformo. Enjuague las semillas con agua desionizada y secar con papel absorbente. Dunk las semillas en ácido sulfúrico 80% durante 5 min. </li><li> Ponga las semillas en un pequeño colador y enjuague a fondo con agua corriente. </li></ol></li><li> Poscosecha maduración de la semilla NOTA: Las semillas de otras especies de malas hierbas no germinan en absoluto durante unos meses después de su vencimiento, independientemente del método utilizado para romper la latencia. <ol><li> Guarde las semillas por un período de al menos 3-4 meses a temperatura ambiente y la humedad baja y luego siga los protocolos anteriores para romper la latencia (por ejemplo, Oryza sativa var. Fagus o P. rhoeas). </li></ol></li></ol> Germinación 3. Semilla <ol><li> Coloque las semillas a germinar en plasplatos de tics que contienen 0,6% (m / v) de agar con nitrato de potasio al 0,1% (KNO 3) ha añadido: <ol><li> Preparar una solución de agar al 0,6% + 0,1% KNO 3 usando agua desionizada. Se disuelve el agar en un horno microondas. </li><li> Verter la solución de agar en platos de plástico. Enfriar el sustrato y luego poner en las semillas. </li></ol> Variante: del suelo también puede ser utilizado como un sustrato en platos de plástico. Esta práctica es particularmente eficiente para Echinochloa spp., S. halepense y Lolium spp. </li><li> Coloque platos de plástico en un armario de germinación por alrededor de una semana con condiciones de luz y temperatura en función de las condiciones óptimas para cada especie de maleza. Para la mayoría de las especies de invierno, el rango de temperatura es 15/25 ° C noche / día y 12 hr fotoperíodo con tubos de neón que proporcionan una densidad de flujo de fotones fotosintético (PPFD) de 15-30 mol m -2 seg -1. Para muchas especies de verano, el rango de temperatura es 15/30 ° C la noche / día. Variante: SOme especies, tales como S. halepense, necesitará un tratamiento térmico. Por lo tanto después de la escarificación, semillas de S. halepense se someten a las siguientes condiciones: ciclos de 4 horas a 45 ° C y 20 horas a 24 ° C durante tres días en el armario de la germinación, y luego tres días en condiciones normales. </li></ol> 4. El trasplante de plántulas y Crecimiento <ol><li> Trasplante de quince a veinte plántulas en bandejas de plástico (325 x 265 x 95 mm) llenos de una mezcla estándar de encapsulamiento (60% suelo franco limoso, 15% de arena, 15% y 10% Agriperlite turba - por volumen). NOTA: El trasplante, en lugar de la siembra directa, permite un soporte uniforme de las plantas en la misma etapa de crecimiento que se obtiene, que es una condición previa importante para optimizar el rendimiento del tratamiento herbicida. </li><li> Identifique cada bandeja con un código de barras que incluye toda la información para la identificación única: Código de la población, el herbicida se está probando, replicar número y número de bandeja progresiva &lt;./ Li&gt; <li> Coloque las bandejas en una sala climatizada plantas de invernadero y el agua según sea necesario para mantener el sustrato en o cerca de la capacidad de campo. NOTA: La temperatura de crecimiento varía dependiendo de las especies de malas hierbas. A menudo se realizan pruebas durante el otoño / invierno / primavera, así que la luz se complementa utilizando 400 W lámparas de halogenuros metálicos, que proporcionan una PPFD de aproximadamente 150 mol m -2 s -1 y un fotoperíodo de 12 h 24, 19. Especies de malezas de verano con C 4 ciclo fotosintético por lo general requieren una mayor intensidad de la luz y por lo tanto, las pruebas se realizan a finales de primavera-verano o la intensidad de la luz es complementado aproximadamente 400 mol m -2 s -1 con un fotoperiodo de 14 h. </li><li> Use un protocolo diferente para algunas especies de malezas que infestan arroz con cáscara, por ejemplo, A. plantago-aquatica, S. mucronatus y C. difformis como se describe en 22. <ol><li> Transplante las plántulas en bandejas de poliestireno con 24 células redondas (55 mm de diámetro, 64 mm de profundidad) filconducido con 60% de suelo franco limoso, 30% de arena y 10% de turba (en volumen). </li><li> Establecer las bandejas de 12 cm envases plásticos profundos llenos de agua y aseguradas mediante varillas roscadas de acero inoxidable para evitar que se flotante (Figura 1). </li><li> Mantener el nivel de agua en los recipientes a 1-2 cm por debajo del nivel de la superficie del suelo y añadir 1,5 g de sulfato de cobre a cada recipiente (que contiene 10-12 L de agua) para evitar la proliferación de algas. </li></ol></li></ol> 5. Tratamientos herbicidas <ol><li> Los tratamientos con herbicidas de pre-emergencia: <ol><li> Después de tres días en el gabinete de la germinación como se describe en la sección 3, transplantar las semillas que germinan en bandejas de plástico que contienen el sustrato descrito anteriormente y cubrir con una capa de tierra (aproximadamente 1 cm). Este es un paso crítico a fin de garantizar que las plántulas no surgirán debido al efecto herbicida en lugar de una profundidad de enterramiento excesiva. </li><li> Tome el sustrato de campo capaciudad mediante la colocación de las bandejas, que tienen unos agujeros en la parte inferior, en platillos llenos de agua. </li><li> Un día después del trasplante, el tratamiento de las bandejas con el herbicida de preemergencia 25. </li><li> Mantenga el sustrato o por la capacidad de campo cerca de la adición de agua, según sea necesario, tanto desde arriba y abajo por capilaridad desde el platillo. Este procedimiento favorece la permanencia del herbicida a la profundidad adecuada (es decir, donde las semillas en germinación son) para una buena eficacia del tratamiento. </li></ol></li><li> Los tratamientos con herbicidas de post-emergencia: <ol><li> Rociar las plantas cuando llegan a la etapa de 2-3 hojas (es decir, etapa de crecimiento 12-13 de la escala BBCH crecimiento extendido 26). </li><li> A partir del día después del tratamiento, ajuste el sistema de riego en función de las necesidades de agua de las especies de malezas y la temporada (por ejemplo, para Echinochloa spp. Que suministra agua durante 3 minutos 4 veces al día, a intervalos regulares, de 9 am a 9 pm). El agua es discontribuido mediante un sistema de riego por aspersión automática. Variante: glifosato se aplica en la planta de la etapa BBCH 14-21. </li></ol></li><li> Preparación de herbicidas y la distribución. NOTA: Todos los herbicidas (pre y post-emergencia) se aplican como formulaciones comerciales con surfactantes recomendados en dos dosis, la dosis recomendada de campo (1x) y tres veces mayor que (3x). <ol><li> Si es necesario, preparar la solución de tensioactivo a granel con arreglo a las instrucciones de la etiqueta; la concentración final se expresa generalmente como un porcentaje del volumen final (por ejemplo, 0,3%) o como volumen a ser distribuido por unidad de área (por ejemplo, 1 L ha -1). </li><li> Utilice la solución de tensioactivo como disolvente para la solución de herbicida (soluto) con el fin de mantener la concentración correcta del ingrediente activo. Preparar la solución herbicida más concentrada primero (3x). Calcular la cantidad de producto comercial que se disuelve en la solución de tensioactivo (o en agua desionizada si unatensioactivo no es necesario) usando la siguiente ecuación: Hierbas Dosis = [(Dosis campo x Dosis máxima) x V aleta] / V del Dónde: hierba = dosis Dosis herbicida (ml), dosis de campo = campo herbicida Dosis (ml ha -1), Dose max = dosis máxima entregada, V aleta = volumen final de la solución (L), V = volumen del emitido por el pulverizador de banco (L ha -1). </li><li> Diluir (2: 1, v / v) la solución 3x herbicida para preparar el menos concentrado (1x). Este procedimiento reduce la posibilidad de cometer errores al pesar o pipetear los herbicidas. Concentración de la solución herbicida se expresa como volumen a ser distribuido por unidad de área (L ha -1). </li><li> Iniciar la secuencia de tratamiento con la dosis de herbicida inferior (1x). De esta manera no hay necesidad de lavar el gabinete de pulverización entre dos tratamientos con la misma herbicida. </li><li> Distribuya el solutio herbicidan usando un pulverizador de banco precisión la entrega de 300 L ha -1 (± 1%), a una presión de 215 kPa, y una velocidad de 0,75 m s-1, con un brazo equipado con tres abanico plano (rango extendido) boquillas hidráulicas . </li><li> Lave el gabinete rociar dos veces cuando el herbicida se cambia el uso de cloro al 1% (v / v) y luego enjuague. Variante: glifosato se aplica con un volumen de pulverización de 200 L ha-1 27. NOTA: Especial atención tiene que ser pagado cuando, como el sulfometuron o flazasulfuron sulfonilureas, se utilizan herbicidas altamente biológicos. En este último caso hacer un lavado con una solución de lejía y otro con amoniaco (2,5% v / v), seguido de un enjuague cuidadoso con agua. </li></ol></li></ol> 6. Recopilación y Análisis de los Datos <ol><li> A través de un lector de código de barras, que identifica automáticamente cada bandeja, registre el número de plantas que sobrevivieron al tratamiento, así como la biomasa estimada Visual (VEB). Las plantas son culocomputan como estar muerto si no muestran crecimiento activo, independientemente del color o de otro aspecto. <ol><li> Hacer la evaluación de tres o cuatro semanas después del tratamiento (WAT) en función de los herbicidas probados (por ejemplo, tres WAT para los inhibidores ACCasa y cuatro WAT para los inhibidores de ALS o glifosato). </li><li> Evaluar la eficacia del tratamiento en general mediante la inclusión de una población susceptible (comprobar S) en todos los experimentos, es decir, una población recogida en un sitio que nunca o raramente tratados con herbicidas era. </li><li> Supervivencia de las plantas Express como porcentaje del número de plantas tratadas, contó justo antes del tratamiento con herbicida, y calcular el error estándar (SE) por valor medio (valor de las dos repeticiones significa). </li><li> El VEB se obtiene a través de una comparación visual de la biomasa vegetal entre tratado y verificación de la misma población de 25, 28 no tratados. Una puntuación, que van desde 10 para las plantas no afectadas por el herbicida (en comparación con la comprobación no tratada) a 0 Cuándolas plantas son claramente muerto, se le da a cada bandeja tratada. </li></ol></li><li> Poblaciones atribuyen a cuatro categorías en función de los resultados obtenidos de los tratamientos con dos dosis de herbicidas: S cuando menos del 5% de las plantas sobrevivieron los 1x dosis de herbicidas, SR cuando los sobrevivientes oscilaron entre 5% a 20% en 1x dosis de herbicidas, R cuando más de 20% de las plantas sobrevivió a los 1x dosis de herbicida y RR cuando los sobrevivientes son más de 20% en dosis de herbicida 1x y más de 10% en dosis de herbicida 3x 17. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Varios pasos dentro de los protocolos son fundamentales para una evaluación exitosa de resistencia a los herbicidas en una población: 1) las semillas deben recogerse en la madurez de las plantas que habían sobrevivido al tratamiento (s) herbicida. La maduración de las semillas de la planta madre es crucial para evitar dificultades en la germinación de las semillas más tarde; 2) Se recomienda el almacenamiento adecuado de semillas para evitar la proliferación de mohos que impidan la germinación; 3) las plántulas...

<html> Los herbicidas son la medida de control de malas hierbas más ampliamente utilizado, que representa hasta un 50% del mercado global de protección de las plantas 1. Son herramientas relativamente baratas, evitar prácticas de cultivo del suelo en mano de obra intensiva y requiere mucho tiempo, y en última instancia resultar en la producción rentable, segura y rentable de alimentos 2. Sin embargo, la gran variabilidad genética fenológico y presente en muchas especies de malezas, junto con un exceso de confianza en el uso de herbicidas, se traduce con frecuencia en la selección de poblaciones de malezas resistentes a los herbicidas. La introducción de herbicidas selectivos con un objetivo metabólica muy específico 3-5 se ha incrementado dramáticamente el número de casos de resistencia a lo largo de los años. Hasta la fecha, 240 especies de malezas (140 dicotiledóneas y monocotiledóneas 100) en todo el mundo han desarrollado resistencia a los diferentes sitios de herbicidas de acción (SOA) 4. Esta es una preocupación importante para el manejo de malezas y más en general, para la producción agrícola sostenible. e_content &quot;&gt; La detección temprana de la resistencia, con base en pruebas fiables, se realizan con frecuencia en un invernadero, es un paso clave para manejar malezas resistentes a los herbicidas. Los diferentes enfoques se han desarrollado de acuerdo con los objetivos, el nivel requerido de precisión, el tiempo y los recursos disponibles, como así como las especies de malas hierbas consideradas 6-12. Sin embargo, cuando se requiere la confirmación del estado de resistencia de un nuevo biotipo de malezas (es decir, un grupo de individuos que comparten varias características fisiológicas, incluyendo la capacidad de sobrevivir a uno o más herbicidas pertenecientes a una grupo particular utilizado en una dosis que normalmente controlar ellos), un robusto bioensayo de toda la planta se debe realizar en un ambiente controlado 4, 11. Un biotipo rara vez es resistente a un solo herbicida. Por tanto, cada biotipo se caracteriza por un patrón de resistencia determinado, es decir, número y tipo de SoA de los herbicidas es resistente a, y por una resistencia dadanivel para cada herbicida 13. La determinación precoz y fiable del patrón de cruz o resistencia múltiple 5, 14 es importante para la gestión de la resistencia de campo. Vale la pena mencionar que la resistencia a los herbicidas no tiene nada que ver con la tolerancia natural que algunos exhiben especies de malezas a algunos herbicidas, por ejemplo, las especies dicotiledóneas vs. herbicidas ACCasa inhibidoras, especies monocotiledóneas vs. 2,4-D, Equisetum arvense vs. glifosato. Este artículo presenta un enfoque sólido para probar biotipos resistentes a herbicidas putativo muestreados en los campos donde se había reportado un mal control por el herbicida (s). Se presentan variantes relevantes a los protocolos estándar en relación con las especies de malas hierbas que participan. Las ventajas sobre las técnicas / protocolos alternativos basados ​​en cualquiera de los bioensayos de plantas enteras utilizando sólo una dosis de herbicida 15, o el tratamiento de semillas en placas de Petri 8 están relacionados con la mayor reliability y la posibilidad de inferir el nivel de resistencia debido a la inclusión de dos dosis de herbicidas en los experimentos. Sin embargo, para las pruebas de resistencia de rutina, los mismos métodos pueden ser aplicados en una sola dosis de herbicida, por lo que la reducción de los costes. Además de permitir la confirmación de la condición de la resistencia, la información obtenida se puede utilizar tanto para la optimización de los siguientes pasos de la investigación y / o la elaboración de estrategias de manejo de resistencia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paper bags</td>
			<td>Celcar SAS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dishes</td>
			<td>ISI plast S.p.A.</td>
			<td>SO600</td>
			<td>Transparent plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 95-98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven fabric</td>
			<td>Carretta Tessitura</td>
			<td>Art.TNT17</td>
			<td>Weight&#160; 17 gr m-&#178;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate &#62;99.0%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic containers</td>
			<td>Giganplast</td>
			<td>1875/M</td>
			<td>600 x 400 x 110 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic trays</td>
			<td>Piber plast</td>
			<td>G1210A</td>
			<td>325 x 265 x 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene trays</td>
			<td>Plastisavio</td>
			<td>S24</td>
			<td>537x328x72 mm, 24 round cells (6x4)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agriperlite</td>
			<td>Blu Agroingross sas</td>
			<td>AGRI100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peat</td>
			<td>Blu Agroingross sas</td>
			<td>TORBA250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germination cabinet</td>
			<td>KW</td>
			<td>W87R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nozzles</td>
			<td>Teejet</td>
			<td>&#160;XR11002-VK, TP11001-VH</td>
			<td>The second type of nozzles are used only for glyphosate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode generator</td>
			<td>Toshiba TEC</td>
			<td>SX4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labels with barcode</td>
			<td>Felga</td>
			<td>TT20200</td>
			<td>Stick-in labels with rounded corners</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode reader</td>
			<td>Cipherlab</td>
			<td>8300-L</td>
			<td>Portable data terminal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench sprayer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Built in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HERBICIDES INCLUDED IN THE RESULTS:</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial product</td>
			<td>Active ingredient</td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Altorex</td>
			<td>imazamox</td>
			<td>BASF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azimut&#160;</td>
			<td>florasulam</td>
			<td>Dow AgroSciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopower</td>
			<td></td>
			<td>Bayer Crop Science</td>
			<td>Surfact to be used with Hussar WG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dash</td>
			<td></td>
			<td>BASF</td>
			<td>Surfact to be used with Altorex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granstar&#160;</td>
			<td>tribenuron-methyl</td>
			<td>Dupont</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gulliver&#160;</td>
			<td>azimsulfuron</td>
			<td>Dupont</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hussar WG&#160;</td>
			<td>iodosulfuron</td>
			<td>Bayer Crop Science</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nominee&#160;</td>
			<td>bispyribac-Na</td>
			<td>Bayer Crop Science</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roundup</td>
			<td>glyphosate</td>
			<td>Monsanto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trend</td>
			<td></td>
			<td>Dupont</td>
			<td>Surfact to be used with Granstar and Gulliver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viper&#160;</td>
			<td>penoxsulam</td>
			<td>Dow AgroSciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weedone LV4</td>
			<td>2,4-D</td>
			<td>Isagro</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for robust herbicide resistance testing in different weed species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

Para evaluar el estado de resistencia de una población resistente putativo, es fundamental para incluir un cheque susceptible en el ensayo con el fin de verificar la eficacia herbicida. Los resultados de una prueba de detección llevados a cabo en P. poblaciones rhoeas, una mala hierba que infestan los campos de trigo, se presentan en la Figura 2, donde se presenta la eficacia de cuatro herbicidas de post-emergencia en un testigo susceptible (09-36) y, por un presunto resistente (10-9...

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Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Los protocolos para pruebas de resistencia a los herbicidas robusta en diferentes especies de malezas

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

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Research

JoVE Journal

Environment

14.4K vistas.  National Research Council (CNR), Italy. A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Video: Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Una técnica de enriquecimiento optimizado para el aislamiento de<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bacteriófago Especies de Aísla Muestra de Suelo

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

Investigación

Medio ambiente

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Medición de Precios de los herbicidas Metabolismo en Dicot malas hierbas con un ensayo extirpados Leaf

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Potentiodynamic Corrosion Testing

Different metallic materials have different polarization characteristics as dictated by the open circuit potential, breakdown potential, and passivation potential of the material. The detection of these electrochemical parameters identifies the corrosion factors of a material. A reliable and well-functioning corrosion system is required to achieve this.
Corrosion of the samples was achieved via a potentiodynamic polarization technique employing a three-electrode configuration, consisting of reference, counter, and working electrodes. Prior to commencement a baseline potential is obtained. Following the stabilization of the corrosion potential (Ecorr), the applied potential is ramped at a slow rate in the positive direction relative to the reference electrode. The working electrode was a stainless steel screw. The reference electrode was a standard Ag/AgCl. The counter electrode used was a platinum mesh. Having a reliable and well-functioning in vitro corrosion system to test biomaterials provides an in-expensive technique that allows for the systematic characterization of the material by determining the breakdown potential, to further understand the material's response to corrosion. The goal of the protocol is to set up and run an in vitro potentiodynamic corrosion system to analyze pitting corrosion for small metallic medical devices.

Here, we present a protocol to set up and run an in vitro potentiodynamic corrosion system to analyze pitting corrosion for small metallic medical devices.

Potenciodinámico Pruebas de Corrosión

Different metallic materials have different polarization characteristics as dictated by the open circuit potential, breakdown potential, and passivation ...

Protocols for Quantifying Transferable Pesticide Residues in Turfgrass Systems

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes onto humans. For this reason, transferable pesticide residue experiments are required for registration and re-registration by the United States Environmental Protection Agency (USEPA). Although such experiments are required, limited specificity is required pertaining to experimental approach. Experimental approaches used to assess pesticide transfer to humans including hand wiping with cotton gloves, modified California roller (moving a roller of known mass over cotton cloth) and soccer ball roll (ball wrapped with sorbent strip) over three treated turfgrass species (creeping bentgrass, hybrid bermudagrass and tall fescue maintained at 0.4, 5 and 9 cm, respectively) are presented. The modified California roller is the most extensively utilized approach to date, and is best suited for use at low mowing heights due to its reproducibility and large sampling area. The soccer ball roll is a less aggressive transfer approach; however, it mimics a very common occurrence in the most popular international sport, and has many implications for nondietary pesticide exposure from hand-to-mouth contact. Additionally, this approach may be adjusted for other athletic activities with limited modification. Hand wiping is the best approach to transfer pesticides at higher mowing heights, as roller-based approaches can lay blades over; however, it is more subjective due to more variable sampling pressure. Utility of these methods across turfgrass species is presented, and additional considerations to conduct transferable pesticide residue research in turfgrass systems are discussed.

Transferable pesticide residue experiments in turfgrass systems are integral components of human risk exposure assessments. Experimental approaches to measure transferable residues should be adjusted to the human interaction of interest and turfgrass system dynamics. Three transferable pesticide residue protocols are presented and the suitability across three turfgrass systems is discussed.

Protocolos para la cuantificación de residuos de plaguicidas transferibles en Sistemas de céspedes

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and stability of the suspension. In this study, a systematic step-wise approach is carried out to identify optimal sonication conditions in order to achieve a stable dispersion. This approach has been adopted and shown to be suitable for several nanomaterials (cerium oxide, zinc oxide, and carbon nanotubes) dispersed in deionized (DI) water. However, with any change in either the nanomaterial type or dispersing medium, there needs to be optimization of the basic protocol by adjusting various factors such as sonication time, power, and sonicator type as well as temperature rise during the process. The approach records the dispersion process in detail. This is necessary to identify the time points as well as other above-mentioned conditions during the sonication process in which there may be undesirable changes, such as damage to the particle surface thus affecting surface properties. Our goal is to offer a harmonized approach that can control the quality of the final, produced dispersion. Such a guideline is instrumental in ensuring dispersion quality repeatability in the nanoscience community, particularly in the field of nanotoxicology.

Here, we present a step-wise protocol for the dispersion of nanomaterials in aqueous media with real-time characterization to identify the optimal sonication conditions, intensity, and duration for improved stability and uniformity of nanoparticle dispersions without impacting the sample integrity.

Dispersión de los nanomateriales en medios acuosos: hacia la optimización del Protocolo

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB y la proyección de imagen espectral raíz planta Phenotyping y investigación fisiológica: montaje Experimental y protocolos de la proyección de imagen

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A better mechanistic understanding of these complex plant-microbe interactions will be crucial to improving plant production as well as performing basic ecological studies investigating plant-soil-microbe interactions. Here, a detailed description for ecosystem fabrication is presented, using widely available 3D printing technologies, to create controlled laboratory habitats (EcoFABs) for mechanistic studies of plant-microbe interactions within specific environmental conditions. Two sizes of EcoFABs are described that are suited for the investigation of microbial interactions with various plant species, including Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, and Panicum virgatum. These flow-through devices allow for controlled manipulation and sampling of root microbiomes, root chemistry as well as imaging of root morphology and microbial localization. This protocol includes the details for maintaining sterile conditions inside EcoFABs and mounting independent LED light systems onto EcoFABs. Detailed methods for addition of different forms of media, including soils, sand, and liquid growth media coupled to the characterization of these systems using imaging and metabolomics are described. Together, these systems enable dynamic and detailed investigation of plant and plant-microbial consortia including the manipulation of microbiome composition (including mutants), the monitoring of plant growth, root morphology, exudate composition, and microbial localization under controlled environmental conditions. We anticipate that these detailed protocols will serve as an important starting point for other researchers, ideally helping create standardized experimental systems for investigating plant-microbe interactions.

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

This article describes detailed protocols for ecosystem fabrication of devices (EcoFABs) that enable the studies of plants and plant-microbe interactions in highly controlled laboratory conditions.

Protocolos de fabricación (EcoFAB) del ecosistema para la construcción de ecosistemas de laboratorio diseñado para estudiar las interacciones planta-microorganismo

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

Composición y análisis de la distribución de bioaerosoles bajo diferentes condiciones ambientales

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Identificar por-polifluorado química especies y con un flujo de trabajo combinado dirigida y no dirigida-detección de alta resolución espectrometría de masas

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Sampling for Estimating Frankliniella Species Flower Thrips and Orius Species Predators in Field Experiments

The western flower thrips, Frankliniella occidentalis (Pergande), is a polyphagous pest that has been spread worldwide. The extensive use of insecticides in attempts to control its populations eliminates natural enemies and competitor flower thrips species, thereby increasing its populations. An unsustainable situation develops with concomitant resistant pest populations, secondary pest outbreaks, and environmental degradation. Integrated pest management utilizes knowledge of pest and natural enemy relationships to implement tactics that are environmentally friendly and sustainable. Minute pirate bugs are the most important worldwide predators of thrips. They can suppress and ultimately control Frankliniella species flower thrips. Flower samples taken at least weekly are needed to understand predator-prey dynamics. Shown here is the sampling of the flowers of fruiting vegetables and companion plants to estimate the densities of individual thrips and minute pirate bug species. Representative data illustrates how the protocol is used to determine the efficacy of management tactics over time and how to evaluate the benefits of predation by minute pirate bugs. The sampling protocol is similarly adaptable to sampling thrips and minute pirate bugs in other plant species hosts.

Sampling for Estimating Frankliniella Species Flower Thrips and Orius Species Predators in Field Experiments

Presented here is a protocol to determine the number of thrips and minute pirate bug predators in crops over multiple dates in field experiments. Also illustrated is how to determine the efficacy of management tactics against thrips and evaluate the benefits of predation by minute pirate bugs.

Muestreo para la estimación de las especies de Frankliniella, los depredadores de las flores y los depredadores de especies de Orius en experimentos de campo

The western flower thrips, Frankliniella occidentalis (Pergande), is a polyphagous pest that has been spread worldwide. The extensive use of insecticides ...