We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.

1. Material Vegetal, condiciones de crecimiento, y vegetativo Clonación Nota: Tres poblaciones rudis fueron investigados en esta investigación: MCR (del condado de McLean, IL), ACR (de Adams County, IL), y WCS (de Wayne County, IL) (Tabla 1). <ol><li> Recoger y suspender semillas rudis en 0,1 g de agar L -1: solución de agua a 4 ° C durante al menos 30 días para mejorar la germinación. Nota: Algunas poblaciones rudis están latentes, pero este paso ayuda a superar la latencia y hacer germinar la semilla de manera más uniforme. </li><li> Germinar semillas de cada población rudis (como en la Tabla 1) en 12 x 12 cm bandejas que contienen un medio para macetas en el invernadero. <ol><li> Mantener condiciones de invernadero a 28/22 ° C temperatura día / noche en un fotoperiodo de 16/8 h 12. </li><li> Suplemento luz natural en el invernadero con la luz de las lámparas de haluro de mercurio para proporcionar un mínimo de 500 mol m -2 </sup&gt; flujo seg -1 fotones a nivel del dosel vegetal. </li></ol></li><li> Trasplante surgió plántulas cuando son 2 cm de altura en 80 cm 3 ollas en el invernadero. </li><li> Trasplantar las plántulas en 950 cm 3 ollas que contienen una mezcla 3: 1 de mezcla para macetas:: 1: 1 de suelo: turba: arena cuando las plántulas son de 4 cm de altura. Añadir 5 g de gránulos de fertilizante de liberación lenta a cada maceta y mezclar con esta mezcla de suelo. </li><li> Corte y retire el meristemo apical contiene las tres hojas más jóvenes a partir de 7 cm plantas altas para eliminar la dominancia apical. Nota: Este paso asegura que cada planta crecerá suficientes brotes axilares 3 cm de clonar. </li><li> Impuestos Especiales cinco brotes axilares (3 cm de longitud) cuando las plántulas son unos 14 cm de altura de cada población rudis (como en la Tabla 1). Eliminar la mayoría de las hojas de estos brotes axilares para disminuir la pérdida de agua a su posterior manipulación, pero conservan las dos hojas más jóvenes para permitir un mayor crecimiento en el trasplante. <br/&gt; Nota: Maneje con cuidado y tratar de no dañar los brotes cuando retire las hojas. Etiqueta de cada planta con una estaca. </li><li> Axilar Transplant dispara en 80 cm 3 macetas (una plántula por maceta) en medio de la maceta, que es el mismo medio usado para la germinación. Medio de la maceta debe ser saturada inicialmente hasta que se formen raíces en la cámara de crecimiento, a continuación, mantener constantes de humedad y colocar macetas en la cámara de crecimiento durante 7 días para establecer raíces. Nota: Las plantas son muy sensibles en este punto y no hay que destacar. <ol><li> Mantener las condiciones de cámara de crecimiento a 28/22 ° C temperatura día / noche en un fotoperiodo de 16/8 h 12. </li><li> Una combinación de las bombillas incandescentes y fluorescentes puede ser utilizado para proporcionar luz en la cámara de crecimiento y debe entregar al menos 550 mol m -2 s -1 flujo de fotones a nivel de copa de la planta 12. </li></ol></li><li> Trasplante de nuevo en 950 cm 3 macetas (una plántula por maceta) containing una mezcla 3: 1 de mezcla para macetas:: 1: 1 de suelo: la turba: arena (también incluirá 5 g de liberación lenta gránulos de fertilizante) cuando las plantas clonadas son 4 cm de altura, a continuación, transferir de nuevo al invernadero. </li><li> Clonar las plantas segunda vez utilizando el mismo método descrito anteriormente (es decir, repita los pasos 1,5 a 1,8, y luego vaya al paso 2.1). Para un estudio de tiempo-curso típico, generar clones de al menos seis plantas independientes de cada población rudis y grabarlos como líneas MCR 1-6, 1-6 y ACR WCS 1-6. <ol><li> Establecer al menos seis distintas &quot;padres&quot; líneas clonales con el fin de repetir el experimento y adecuadamente representar la variabilidad genética dentro de cada población rudis. </li><li> Dependiendo del número de puntos de tiempo se analizará, generar suficientes sub-clones de cada línea clonal &quot;padre&quot; para llevar a cabo un estudio del curso del tiempo. </li></ol></li></ol> 2. La realización de un estudio del metabolismo con extirpados WaterhemHojas p <ol><li> Extirpar las terceras más jóvenes hojas (de 2 a 3 cm de longitud; incluir 0,5 cm de peciolo adjunta) cuando las plantas rudis clonados son de 10 a 12 cm de altura para el metabolismo de los herbicidas y DT 50 análisis. </li><li> Pecíolos Cortar la hoja de cada planta rudis por segunda vez (asegurando que 0,3 cm de pecíolo permanece) bajo el agua, y colocar estos extremos cortados en 1,5 ml viales de plástico (una hoja por vial) 15. Nota: Cortar una segunda vez bajo el agua evita que las burbujas de aire que se formen y tapar los vasos del xilema. <ol><li> En primer lugar, sumerja parcialmente hojas cortadas con el corte del peciolo en tampón de pre-incubación (200 l) de 0,1 M Tris-HCl (pH 6) durante 1 hora. </li><li> En segundo lugar, mover cada hoja a un nuevo 1,5 ml vial que contiene un tampón de incubación (200 l) de 0,1 M Tris-HCl (pH 6), además de 150 mM [14 URL- C] herbicida, y se incuba a 28 ° C durante 1 hr a permitir la absorción del herbicida en las hojas. Nota: Tanto la 14 C-mesotriona y <shasta&gt; 14 C-primisulfuron-metilo se utiliza en nuestros estudios en las actividades específicas de aproximadamente 20 mCi mmol -1. Tanto la difusión y la absorción a través de la corriente de transpiración xilema contribuyen a la cantidad de herbicida tomado por hoja. Nota: El efecto de los inhibidores metabólicos sobre el metabolismo de los herbicidas se puede determinar mediante la modificación de los pasos 2.2.1 y 2.2.2 anteriormente. Añadir 100 mM del inhibidor a la memoria intermedia pre-incubación y dejar incubar durante 2 hr, luego se transfieren a tampón de incubación con el herbicida y otra vez Añadir 100 mM inhibidor. Por ejemplo, malatión y tetcyclacis inhiben ciertas actividades del citocromo P450 en plantas 15-17. </li><li> Lave la parte sumergida de hojas cortadas con agua desionizada y transferir hojas cortadas a un cuarto de la fuerza de Murashige y Skoog (MS) solución de sales (500 l) durante 0 horas, 5 horas, 11 horas, 23 horas o 35 horas, respectivamente, en la cámara de crecimiento para el estudio del metabolismo curso temporal. </li></ol></li><li> Cosecha quitando la licencias de la solución de incubación en el punto de tiempo apropiado y moler manualmente cada tejido de la hoja en nitrógeno líquido usando un tubo de polipropileno (15 ml) y una maja de vidrio. </li><li> Extraer herbicida radiomarcado y sus metabolitos a partir de cada hoja con 7 ml de 90% de acetona con un homogeneizador de tejidos de laboratorio en el mismo tubo de polipropileno como anteriormente. Enjuague homogeneizador de tejidos con un adicional de 7 ml de 90% de acetona, y continuar para homogeneizar hasta que el tejido se pulveriza a fondo (generalmente alrededor de 2 min). Nota: 90% de acetona se puede utilizar para la extracción de la mayoría de los herbicidas de los tejidos vegetales. Sin embargo, si este método es incapaz de extraer más de 90% de los compuestos radiomarcados absorbidos, a continuación, 90% de metanol o acetonitrilo al 90% pueden estar sustituidos como el disolvente de extracción. </li><li> Label 90% extractos de acetona (14 ml en total) y se almacena a 4 ° C durante 16 horas para permitir que se produzca la extracción adicional. Nota: Después de esta extracción de hojas tratadas, la cantidad de rad extraíbleioactivity es típicamente al menos 98% de compuestos radiomarcados absorbidos por la hoja tratada. Radiactividad no extraíble (residuos ligados) en las hojas cortadas en promedio sólo el 0,3% en todos los puntos de tiempo en nuestro estudio anterior 12, pero esta cantidad puede variar de acuerdo con el herbicida utilizado y el punto de tiempo examinado. </li><li> Se obtuvieron muestras de centrifugar a 5000 xg durante 10 min y el concentrado de sobrenadantes a 40 ° C con un evaporador giratorio hasta un volumen final de 0,5 ml. Transferencia este volumen a un tubo de plástico 2,0 ml. </li><li> Añadir acetonitrilo: agua (1: 1, en volumen) para ajustar el volumen final de la planta extrae a 1,25 ml y volver a centrifugar a 10.000 xg durante 10 minutos para eliminar cualquier partícula. </li><li> Medir la radioactividad total en una alícuota tomada de cada muestra (dpm l -1) por espectroscopía de centelleo líquido (LSS) 12 y normalizar cantidades de [14 C-etiquetados] compuestos inyectados para el análisis HPLC (por ejemplo, 10,000 total dpm / muestra / run) para y-ejes será uniforme entre las muestras al graficar los resultados. </li></ol> 3. Análisis de HPLC Herbicida Metabolismo en hojas extirpados Nota: Resolver total de radiactividad extraíble en herbicidas padres y herbicidas metabolitos utilizando las siguientes condiciones de RP-HPLC 12. <ol><li> Realizar RP-HPLC con una columna C 18 (4,6 x 250 mm, 5 micras de tamaño de partícula para HPLC analítica) a una velocidad de flujo de 1 ml min -1 para la mayoría de los herbicidas no polares. Nota: columnas C 4 o C 12 de RP-HPLC también se pueden utilizar para optimizar la separación del herbicida padre de sus metabolitos. Un filtro de pre-columna y / o columna de seguridad también se pueden usar para proteger y prolongar la vida de la columna de RP. <ol><li> Utilice la siguiente fase móvil para RP-HPLC: Eluyente A, 0,1% de ácido fórmico (v / v) en agua, y Eluyente B acetonitrilo de grado HPLC 100%. Nota: metanol grado HPLC también se puede utilizar como Eluente B para la resolución de los compuestos más polares y metabolitos, pero tenga en cuenta que los tiempos de retención también pueden cambiar. Nota: El perfil de elución se utiliza para resolver mesotriona o primisulfuron-metil de sus metabolitos polares en nuestra investigación 12 es: Paso 1, A: B (4: 1, v / v) a A: B (3: 2, v / v ) en un gradiente lineal (12 min); Paso 2, A: B (3: 2, v / v) a A: B (3: 7, v / v) en un gradiente lineal (5 min); Paso 3, A: B (3: 7, v / v) a A: B (1: 9, v / v) en un gradiente lineal de 2 min (que comprende un total de 19 min). Nota: Los degradados y pasos isocráticas pueden necesitar ser ajustado en base a las propiedades físicas del material original con el fin de optimizar la resolución. </li><li> Siga los pasos gradiente lineal anteriores con A: B (1: 9, v / v) a A: B (4: 1, v / v) en un gradiente lineal (3 min) y A: B (4: 1, v / v) etapa isocrática (por lo menos durante 2 min) para volver a equilibrar la columna de la RP antes de inyectar la próxima extracto de 12. </li></ol></li><li> Detectar y visualizar compuestos radiomarcados con un Scinti Flowlación Analizador. Registrar la cantidad de herbicida matriz restante en cada muestra como un porcentaje de la radiactividad total en cada muestra (detectado y cuantificado por el flujo Analizador de Centelleo de acuerdo con las instrucciones del fabricante) para determinar las tasas de metabolismo de los herbicidas en cada población rudis durante el curso del tiempo. </li></ol> 4. Procedimientos estadísticos <ol><li> Organizar tratamientos en un diseño completamente al azar (u otro dispositivo adecuado para el análisis estadístico). </li><li> Realice dos experimentos independientes con cada tratamiento, compuesto de tres réplicas biológicas para cada experimento. Los dos experimentos independientes incluyen seis repeticiones biológicos en total. Si el efecto experimento es no significativa (α = 0,05), combinar y analizar los datos de cada experimento independiente. Si el efecto experimento es significativo, luego analizar cada experimento separado. Nota: Incluir los primeros tres repeticiones biológica in Experimento 1 y los próximos tres repeticiones biológica en el Experimento 2. Cada réplica biológica representa un &quot;padre&quot; clara línea clonal derivada de cada población (MCR 1-6, 1-6 ACR, y WCS 1-6) para que cada tiempo- análisis curso utiliza plantas genéticamente idénticas. Los dos experimentos independientes incluyen seis repeticiones biológicos en total, lo que permite una adecuada representación de la variabilidad genética y la determinación de una mediana DT 50 para cada población rudis. </li><li> Analizar los datos con el análisis no lineal de mínimos cuadrados de regresión y ajuste con una curva de primer orden sencilla con el fin de estimar DT 50 s. La ecuación siguiente se describe el modelo: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li> donde en este modelo y representa el porcentaje del herbicida matriz restante en el tiempo t, μ i es el DT 50 para cadarudis población i, y el parámetro C 0 es la cantidad estimada de padres herbicida presente en t = 0 12. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

El método de hoja extirpada descrito en este documento se ha utilizado anteriormente en la investigación del metabolismo primisulfuron en hojas de maíz 15, pero nuestros resultados demuestran que este protocolo también es eficaz, preciso y reproducible para medir el metabolismo de los herbicidas en una especie de maleza dicotiledóneas 12. Una ventaja importante de la técnica de hoja extirpada en comparación con los estudios de la planta entera es que una hoja extirpada es independiente de lo...

Resistencia a los herbicidas en las malezas presenta una seria amenaza para la producción mundial de alimentos y fibras 1,2. Actualmente, miles de poblaciones y biotipos resistentes de más de un centenar de especies de malas hierbas en todo el mundo se han documentado y estudiado 3. Un mecanismo importante que confiere resistencia a los herbicidas en las plantas es la alteración de los herbicidas genes y las proteínas diana del sitio, incluyendo mutaciones genéticas que afectan a la cinética de unión de la proteína herbicida o la amplificación del gen diana del sitio 2. Desintoxicación metabólica a través de actividades elevadas de monooxigenasa citocromo P450 (P450) o glutatión S transferasa (GST) enzimas es otro mecanismo que confiere resistencia a herbicidas en las malas hierbas, que es distinta de varias formas de mecanismos basados ​​target-site-2. Resistencia basada en metabólico tiene ramificaciones importantes para si los costos de acondicionamiento físico planta (también conocido como la aptitud sanciones) pueden ser el resultado de las mechanis herbicida de resistenciam, así como sobre la posibilidad de un único mecanismo de desintoxicación para conferir resistencia cruzada o múltiples herbicidas en las poblaciones de malezas 1,2,4. Generalmente, el metabolismo de los herbicidas en las plantas se puede dividir en tres fases distintas 5. Fase I implica la conversión herbicida o de activación, tales como hidroxilación mediada por P450 de anillos aromáticos o grupos alquilo, o por N - o reacciones de desalquilación O-, lo que aumenta la polaridad y herbicida parcial desintoxicación 5,6. De reciente introducción de grupos funcionales en la fase I pueden proporcionar sitios de enlace para la conjugación de glutatión reducido por GST o glucosa por glicosiltransferasas UDP-dependientes en la Fase II de 5,7. Por ejemplo, el principal metabolito inicial de primisulfuron-metil en el maíz es hidroxi-primisulfuron-metil 8, que puede ser metabolizado adicionalmente a hidroxi-primisulfuron-glucósido (Fase II) y luego transportado a la vacuola para el almacenamiento a largo plazo o más metabólica proprocesamiento 5,6 (Fase III). Rudis (Amaranthus tuberculatus) es una especie anual dicotiledóneas de difícil control de malezas que dificulta la producción de maíz (Zea mays), soja (Glycine max) y el algodón (Gossypium hirsutum) en los Estados Unidos. El alto grado de diversidad genética de rudis se ve facilitada por su biología dioica y de larga distancia polinización por el viento, y una sola planta rudis hembra puede producir hasta un millón de semillas 9. Estas semillas son pequeñas y de fácil propagación, lo que naturalmente dotar rudis con un mecanismo de dispersión efectiva. Rudis muestra germinación continua durante todo el ciclo de cultivo 9, y sus semillas son capaces de germinar después de varios años de inactividad. Rudis es una planta C 4 que posee una tasa de crecimiento superior a la mayoría de las malezas de hoja ancha en los sistemas de cultivo de cultivo 10. Además, numerosas poblaciones rudis son resistentes a múltiples families de herbicidas 3. Una población de rudis (designado MCR) de Illinois es resistente a la 4-hidroxi-fenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) herbicidas -inhibiting 11, tales como mesotriona, así como a la atrazina y la acetolactato sintasa (ALS) herbicidas inhibidores, incluyendo primisulfuron-metil , debido a los mecanismos no basados ​​en meta-sitio 12,13. Una población diferente de rudis designada ACR 14, que es primisulfuron-metil-resistente (debido a una mutación en el gen ALS) y la atrazina resistentes pero sensibles a la mesotriona, y una población rudis designado WCS 14 que es sensible a primisulfuron-metil, mesotriona y atrazina se utilizaron en comparación con MCR en nuestra investigación previa 12 y los experimentos actuales (resumen en la Tabla 1). Los estudios iniciales no detectaron alteraciones en la secuencia del gen HPPD o niveles de expresión, o reducción de la absorción mesotriona, en el MCRpoblación, en comparación con las poblaciones-mesotriona sensibles 12. Sin embargo, los estudios de metabolismo con plantas enteras demostraron niveles significativamente más bajos de herbicida mesotriona padres en MCR en comparación con el ACR y WCS, que se correlacionaban con las respuestas fenotípicas anteriores para mesotriona 11,12. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Rudis Población </td><td> Abreviatura </td><td> Fenotipo de Mesotriona </td><td> Mecanismo de resistencia mesotriona </td><td> Fenotipo de primisulfuron </td><td> Mecanismo de resistencia primisulfuron </td></tr><tr><td> McLean County-resistente </td><td> MCR </td><td> Resistente </td><td> Metabolismo * </td><td> Resistente </td><td> Metabolismo </td></tr><tr><td> Adams County-resistente </td><td> ACR </td><td> Sensithe </td><td> - </td><td> Resistente </td><td> Mutación de destino de las instalaciones en la ELA 14 </td></tr><tr><td> Wayne County-Sensible </td><td> WCS </td><td> Sensible </td><td> - </td><td> Sensible </td><td> - </td></tr></tbody></table> * Mecanismos de resistencia no-objetivo del sitio, excepto el metabolismo mejorado, también pueden conferir resistencia mesotriona en la población MCR 12. Tabla 1: Descripción de la población rudis de Illinois utilizados en este estudio. Además de determinar las tasas de metabolismo de los herbicidas en las plantas de semillero rudis intactas, un enfoque experimental diferente fue desarrollado y empleado en nuestra investigación anterior para investigar el metabolismo mediante el uso de un ensayo extirpado rudis hoja 12, así como diversos inhibidores de P450 (por ejemplo, tetcyclacis y malatión). Este método fue adaptado específicamente para rudis de un Previous investigación del metabolismo primisulfuron-metil en el maíz extirpado hojas 15, puesto que el ensayo de la hoja extirpada aún no había sido reportado para la realización de investigaciones metabolismo de los herbicidas en una planta dicotiledónea. El insecticida malatión organophophosate se ha utilizado con frecuencia para in vivo y en la investigación herbicida metabolismo vitro para indicar la participación P450 16. Por ejemplo, la tolerancia y el rápido metabolismo de mesotriona en el maíz se deben a la hidroxilación del anillo catalizado-P450, que se verifica cuando el malatión aumento de la sensibilidad de maíz a la mesotriona 17. Del mismo modo, el malatión inhibe el metabolismo del inhibidor primisulfuron-metil ALS en el maíz extirpado deja 15. Una ventaja importante de la técnica de hoja extirpada es que los datos generados son independientes de los patrones de translocación planta entera, un factor importante a considerar al evaluar el metabolismo de los herbicidas de postemergencia, sistémicas en las plantas. Por consiguiente, este método permite cuantitativa ymetabólica análisis cualitativos para centrarse en una sola hoja tratada 12. Una estrategia de clonación vegetativa, en combinación con el protocolo de hoja extirpada, se utilizó previamente en rudis para llevar a cabo estudios de metabolismo 12. Debido a la naturaleza cruzamiento de rudis (varón separado y plantas femeninas), y en gran medida de la diversidad genética dentro de las especies de Amaranthus dioicas 9, este protocolo garantiza que se analizaron las plántulas rudis genéticamente idénticos dentro de los experimentos de tiempo-por supuesto. Este artículo demuestra la utilidad del método de la hoja extirpada para medir las tasas de metabolismo de los herbicidas en una mala hierba dicotiledónea (rudis). La cantidad de herbicida matriz restante se determinó en cada punto de tiempo (Figura 1) por análisis de regresión de mínimos cuadrados no lineal, y se ajuste con una curva de primer orden sencillo con el fin de estimar el tiempo para 50% de herbicida absorbido para degradar ( DT 50). Representativocromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) se muestran para ALS-resistentes y poblaciones rudis -sensibles, que indican la desaparición de los herbicidas de los padres y la formación concomitante de metabolito polar (s) durante un estudio de evolución temporal (Figura 2). El objetivo de nuestro artículo es describir y demostrar la utilidad de la prueba de la hoja extirpado en combinación con un método de clonación vegetativa para la determinación de las tasas precisas y reproducibles del metabolismo de los herbicidas en plantas dicotiledóneas, utilizando el anillo marcado (URL- 14 C) herbicidas uniformemente en tres poblaciones rudis que difieren en sus respuestas a la planta entera HPPD- y herbicidas inhibidores de ALS (Tabla 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>for pre-germinating seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting medium</td>
			<td>Sun Gro Horticulture</td>
			<td>49040233</td>
			<td>for plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutricote</td>
			<td>Agrivert&#160;</td>
			<td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td>
			<td>slow-release fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber E15</td>
			<td>Controlled Environments Limited</td>
			<td>20207</td>
			<td>plant culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>buffer for excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (concentrated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144500</td>
			<td>adjust pH of buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) salts&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0404</td>
			<td>incubation of excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>leaf washes after incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>plant extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (HPLC grade)</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>MKH07610</td>
			<td>HPLC mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt Analytical</td>
			<td>MK259205</td>
			<td>acidify mobile phase pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>1.5 or 2.0 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (temperature controlled)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>15 or 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#220;CHI</td>
			<td>R200</td>
			<td>concentrate plant samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation spectrometry (LSS)</td>
			<td>Packard Instruments</td>
			<td>104470</td>
			<td>quantify 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N2910401</td>
			<td>resolve herbicide metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow scintillation analyzer&#160;</td>
			<td>LabLogic System</td>
			<td>1103303</td>
			<td>for HPLC analysis of 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column&#160;</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>03-050-522&#160;</td>
			<td>reversed phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo M cocktail</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013579</td>
			<td>for Flow-scintillation analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18</td>
			<td>for LSS; biodegradable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>CH-6010&#160;</td>
			<td>homogenize leaf samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring rates of herbicide metabolism in dicot weeds with an excised leaf assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

Se detectaron grandes diferencias en las tasas de metabolismo mesotriona entre cualquiera WCS o ACR y MCR (Figura 1). En cada punto de tiempo, MCR había metabolizado mesotriona más rápidamente que las dos poblaciones-mesotriona sensible, WCS y ACR, que se correlaciona con las respuestas fenotípicas planta entera anteriores 11. Por clonación suficientes plantas desde una única planta parental de cada población, los análisis tiempo-por supuesto metabolismo herbicida son uniformes y repr...

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Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Medición de Precios de los herbicidas Metabolismo en Dicot malas hierbas con un ensayo extirpados Leaf

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

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Research

JoVE Journal

Environment

11.9K vistas.  University of Illinois. This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

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Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Flujos de nutrientes minerales y sustancias tóxicas de medición en plantas con Trazadores Radiactivos

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

Investigación

Medio ambiente

Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Los protocolos para pruebas de resistencia a los herbicidas robusta en diferentes especies de malezas

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

LC-MS El análisis de las plaquetas humanas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Laboratory and Field Protocol for Estimating Sheet Erosion Rates from Dendrogeomorphology

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to severe environmental impacts. The understanding of sheet erosion is, consequently, a worldwide issue with implications for both environment and economies. However, the knowledge on how erosion evolves in space and time is still limited, as well as its effects on the environment. Below, we explain a new dendrogeomorphological protocol for deriving eroded soil thickness (Ex) by acquiring accurate microtopographic data using both terrestrial laser scanning (TLS) and microtopographic profile gauges. Additionally, standard dendrogeomorphic procedures, dependent on anatomical variations in root rings, are utilized to establish the timing of exposure. Both TLS and microtopographic profile gauges are used to obtain ground surface pro&#64257;les, from which Ex is estimated after the threshold distance (TD) is determined, i.e., the distance between the root and the sediment knickpoint, which allows de&#64257;ning the lowering of the ground surface caused by sheet erosion. For each profile, we measured the height between the topside of the root and a virtual plane tangential to the ground surface. In this way, we intended to avoid small-scale impacts of soil deformation, which may be due to pressures exerted by the root system, or by the arrangement of exposed roots. This may provoke small amounts of soil sedimentation or erosion depending on how they physically affect the surface runoff. We demonstrate that an adequate microtopographic characterization of exposed roots and their associated ground surface is very valuable to obtain accurate erosion rates. This finding could be utilized to develop the best management practices designed to eventually halt or perhaps, at least, lessen soil erosion, so that more sustainable management policies can be put into practice.

Characterizing erosion from dendrogeomorphology has usually focused on accurately finding the starting time of root exposure, by examining macroscopic or cell level changes caused by exposure. Here, we offer a detailed description of different novel techniques to obtain more precise erosion rates from highly accurate microtopographic data.

Laboratorio y el protocolo de campo para estimar tasas de erosión de la hoja de Dendrogeomorphology

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to ...

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to bacteria control the amount that will accumulate in staple food crops. The bioavailability of these metals is dependent on their speciation in solution, but more particularly under anoxic conditions where Hg is methylated to toxic monomethylmercury (MeHg) and Cd persists in the rhizosphere. Whole-cell microbial biosensors give a quantifiable signal when a metal enters the cytosol and therefore are useful tools to assess metal bioavailability. Unfortunately, most biosensing efforts have so far been constrained to oxic environments due to the limited ability of existing reporter proteins to function in the absence of oxygen. In this study, we present our effort to develop and optimize a whole-cell biosensor assay capable of functioning anaerobically that can detect metals under anoxic condition in quasi-real time and within hours. We describe how the biosensor can help assess how chemical variables relevant to the environmental cycling of metals affect their bioavailability. The following protocol includes methods to (1) prepare Hg and Cd standards under anoxic conditions, (2) prepare the biosensor in the absence of oxygen, (3) design and execute an experiment to determine how a series of variable affects Hg or Cd bioavailability, and (4) to quantify and interpret biosensor data. We show the linear ranges of the biosensors and provide examples showing the method's ability to distinguish between metal bioavailability and toxicity by utilizing both metal-inducible and constitutive strains.

Here, we present a protocol to use an anaerobic whole-cell microbial biosensor to evaluate how different environmental variables affect the bioavailability of Hg and Cd to bacteria in anoxic environments.

Un análisis de anaerobios biosensores para la detección de mercurio y cadmio

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has become particularly relevant for assessing the anthropogenic-altered global nitrogen cycle and the emission of greenhouse gases (i.e., N2O). Several methods are available for measuring denitrification, but none of them are completely satisfactory. Problems with existing methods include their insufficient sensitivity, and the need to modify the substrate levels or alter the physical configuration of the process using disturbed samples.This work describes a method for estimating sediment denitrification rates that combines coring, acetylene inhibition, and microsensor measurements of the accumulated N2O. The main advantages of this method are a low disturbance of the sediment structure and the collection of a continuous record of N2O accumulation; these enable estimates of reliable denitrification rates with minimum values up to 0.4-1 &#181;mol N2O m-2 h-1. The ability to manipulate key factors is an additional advantage for obtaining experimental insights. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate. The method is appropriate for estimating denitrification rates in any aquatic system with retrievable sediment cores. If the N2O concentration is above the detection limit of the sensor, the acetylene inhibition step can be omitted to estimate the N2O emission instead of denitrification. We show how to estimate both actual and potential denitrification rates by increasing nitrate availability as well as the temperature dependence of the process. We illustrate the procedure using mountain lake sediments and discuss the advantages and weaknesses of the technique compared to other methods. This method can be modified for particular purposes; for instance, it can be combined with 15N tracers to assess nitrification and denitrification or field in situ measurements of denitrification rates.

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

This method estimates sediment denitrification rates in sediment cores using the acetylene inhibition technique and microsensor measurements of the accumulated N2O. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate.

Estimación de las tasas de desnitrificación sedimento usando corazones y N2O microsensores

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has ...

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and shape of activated sludge flocs can indicate the conditions at the microscale, and also directly affect how well the sludge settles in a clarifier.
Particle size and shape are both misleadingly &#39;simple&#39; measurements. Many subtle issues, often unaddressed in informal protocols, can arise when sampling, imaging, and analyzing particles. Sampling methods may be biased or not provide enough statistical power. The samples themselves may be poorly preserved or undergo alteration during immobilization. Images may not be of sufficient quality; overlapping particles, depth of field, magnification level, and various noise can all produce poor results. Poorly specified analysis can introduce bias, such as that produced by manual image thresholding and segmentation.
Affordability and throughput are desirable alongside reproducibility. An affordable, high throughput method can enable more frequent particle measurement, producing many images containing thousands of particles. A method that uses inexpensive reagents, a common dissecting microscope, and freely-available open source analysis software allows repeatable, accessible, reproducible, and partially-automated experimental results. Further, the product of such a method can be well-formatted, well-defined, and easily understood by data analysis software, easing both within-lab analyses and data sharing between labs.
We present a protocol that details the steps needed to produce such a product, including: sampling, sample preparation and immobilization in agar, digital image acquisition, digital image analysis, and examples of experiment-specific figure generation from the analysis results. We have also included an open-source data analysis pipeline to support this protocol.

The size and shape of particles in activated sludge are important parameters that are measured using varying methods. Inaccuracies arise from non-representative sampling, suboptimal images, and subjective analysis parameters. To minimize these errors and ease measurement, we present a protocol specifying every step, including an open source software pipeline.

Medición de la forma y el tamaño de las partículas de lodo activado inmovilizado en Agar con una tubería de Software de código abierto

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

Cultivo de microalgas verdes en fotobiorreactores de columna de burbuja y un análisis de lípidos neutros

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Estimación del índice de área hoja utilizando tres métodos distintos en soportes caducifolios puros

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a non-targeted approach, plant metabolites and xenobiotics of interest are identified and localized in plant tissues to uncover&#160;specific distribution patterns. Then, in silico prediction of potential metabolites (i.e., catabolites and conjugates) from the identified xenobiotics is performed. When a xenobiotic metabolite is located in the tissue, the type of enzyme involved in its alteration by the plant is recorded. These results were used to describe different types of biological reactions occurring in S. alba leaves in response to xenobiotic accumulation in the leaves. The metabolites were predicted in two generations, allowing the documentation of successive biological reactions to transform xenobiotics in the leaf tissues.

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

This method uses mass spectrometry imaging (MSI) to understand metabolic processes in S. alba leaves when exposed to xenobiotics. The method allows the spatial localization of compounds of interest and their predicted metabolites within specific, intact tissues.

Investigación Del Metabolismo De Xenobióticos En Hojas De Salix alba A Través De Imágenes Espectrometría De Masas

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a ...