This research is funded by an operating grant from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) to C.A. and D.A.J. The authors acknowledge the Canadian Foundation for Innovation and Princess Margaret Cancer Foundation for funding the STTARR research facility that enables the imaging and therapy research components of this work.

1. Preparación de liposomas <ol><li> Disolver los lípidos de 1,2-sn -glicero Dipalmitoyl--3-fosfocolina (DPPC), 1-estearoil-2-hidroxi-sn-glicero-3 fosfatidilcolina (MSPC o S-liso-PC) y N - (carbonilo metoxipolietilenglicol 2000) -1,2-sn -glicero distearoyl--3-fosfoetanolamina (mPEG 2000 DSPE) en cloroformo. Por ejemplo, para la preparación de 10 ml de HTLC, pesar 314,4 mg de DPPC, 39,4 mg MSPC, y 83,9 mg mPEG 2.000 DSPE en un vial de vidrio ámbar. A continuación, se disuelven los lípidos en 2 ml de cloroformo y calentar el vial durante 30 segundos en un baño de agua 60 ° C. </li><li> Eliminar el cloroformo utilizando un evaporador rotatorio. Coloque la película lipídica resultante bajo alta presión de vacío O / N. </li><li> Para 10 ml de HTLC, hidratar la película lipídica con 5 ml 0,1 N tampón Tris (pH 7.4) durante 1 h. Al mismo tiempo, pesar 162,4 mg de 1,2-sn -glicero dipalmitoyl--3-fosfoglicerol (DPPG) de lípidos y 100 mg de polvo de hidrato de CDDP y wITH 5 ml 0,1 N tampón Tris que contiene 30% de etanol (pH 7,4) durante 1 hora. </li><li> Para la formulación de Gd-HTLC, pesar la misma cantidad de DPPG lípidos y 10 mg polvo CDDP, y luego hidratar con una solución de 2,5 ml de D-os-HP-DO3A (279,3 mg / ml) más 2,5 ml 0,1 N tampón Tris que contiene 30% de etanol ( pH 7,4) durante 1 hr. Durante la hidratación, las mezclas se deben mantener en viales de color ámbar y se colocan en una placa caliente a 70 ° C con agitación constante y vórtex cada 10 min. </li><li> Combinar la mezcla de lípidos y la mezcla de lípidos de drogas, y de nuevo hidratar durante 1 hr. Vortex cada 15-20 min. </li><li> Montar la extrusora de 10 ml con dos pilas de 200 filtros de policarbonato nm. Conectar el thermobarrel de la extrusora a un baño de agua circulante a 70 ° C, y conectar el extrusor a un tanque de nitrógeno comprimido. </li><li> Inmediatamente después de la hidratación, la transferencia de la mezcla en la cámara de extrusor. Abra el flujo de nitrógeno (ajustar la presión a 200 psi) para extruir los liposomas a través de las membranas. Recoger el LiposomES en un tubo de 50 ml. Mantenga el tubo en un baño de agua caliente (70 ° C) en todo momento durante el proceso de extrusión. Repita este proceso 5 veces. </li><li> Desmontar la extrusora y el cambio a dos pilas de 100 filtros de policarbonato nm. Volver a montar la extrusora y ajustar la presión de 400 psi. Repita el paso 5, excepto la extrusión de los liposomas 10 veces. Recoger la muestra de la extrusión final en un tubo de 15 ml. </li><li> Enfriar los liposomas a RT, y centrifugar a 1000 xg durante 3 min para precipitar CDDP insoluble. </li><li> Se dializa los liposomas O / N contra 0,9% de solución salina en un tubo de diálisis con un corte de peso molecular 15.000 (MWCO) en condiciones estériles. </li><li> Diluir 10 l de los liposomas en 990 l de agua destilada. Utilice dispersión dinámica de luz para medir la distribución del tamaño de HTLC y Gd-HTLC. Realizar 3 mediciones con 10 carreras cada uno. </li><li> Diluir 40 l de los liposomas en 3.960 l de agua destilada. Hacer 5-6 soluciones estándar de platino y gadolinioen el intervalo de concentración de 0,1 a 20 mg / ml. Medir las concentraciones de platino y gadolinio usando acoplado inductivamente espectrómetro de emisión atómica de plasma (ICP-AES) en 3 longitudes de onda diferentes. Realizar 3 mediciones en cada longitud de onda para el resultado de la media. </li><li> Determinar el gel a la temperatura del líquido fase cristalina de transición (T m) de la formulación de liposomas HTLC usando un calorímetro de barrido diferencial (DSC). Cargar 5-10 mg de HTLC en una bandeja de DSC y el uso de una bandeja vacía como referencia. Utilice una velocidad de barrido de 5 ° C / min hasta la rampa encima de la temperatura de 0 ° C a 60 ° C. </li><li> Envuelva los liposomas en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz y se almacena a 4 ° C. </li></ol> 2. La liberación in vitro a partir de liposomas <ol><li> Preparar columnas de centrifugación. <ol><li> Incubar 50 g de perlas de filtración en gel en 400 ml 0,9% de solución salina a temperatura ambiente durante 3-4 h. Enrolle un pedazo de lana de vidrio, mojado con 0,9% de solución salina y colóquelo en la punta de una jeringa de 1 ml. Pulse la lana de vidrio para llenar aproximadamente 0,05 hasta 0,1 ml de la jeringa. Usar una pipeta de vidrio para añadir gradualmente alrededor de 1 ml de medio de filtración en gel en la jeringa. </li><li> Coloque la jeringa en un tubo de 15 ml y centrifugar a 1000 xg durante 3 min. Retire la columna de centrifugación y colocarlo en un tubo de 15 ml. </li></ol></li><li> Muestra de 400 l de HTLC o Gd-HTLC en 8 viales de vidrio de 1 dram e incubar en un baño de agua a temperatura controlada, ya sea en 37 ° C o 42 ° C. Extraer un vial en cada punto de tiempo (es decir, 5, 15, 30 y 60 min) e inmediatamente colocar en hielo. </li><li> Añadir 100 l de 0,9% de solución salina en la columna de centrifugación preparado, a continuación, añadir 100 l de HTLC o Gd-HTLC antes de la incubación (control) o después de la incubación en el baño de agua en la columna de centrifugación. Centrifugar a 1000 xg durante 3 min. Retire la jeringa del tubo y diluir la solución en el tubo para el análisis de ICP-AES. </li></ol> 3. Implantación de xenoinjerto subcutáneo del cuello uterinoTumor <ol><li> Se realizaron todos los estudios con animales de acuerdo a los protocolos de uso de animales aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Red de Salud de la Universidad (UHN). </li><li> Realizar todos los estudios de animales en un gabinete de bioseguridad (BSC). Autoclave todas las herramientas quirúrgicas antes de cualquier cirugía. Después de cada operación, limpie las herramientas quirúrgicas con etanol al 70% y esterilizar de nuevo utilizando un esterilizador de cuentas caliente. </li><li> Para la eutanasia, colocar al animal en una cámara aislada de CO 2, a continuación, realizar la dislocación cervical. </li><li> Para la anestesia general utilizando 100% de oxígeno, utilizar 5% isofluorano para la inducción y el 2% para el mantenimiento. Para asegurar la profundidad de la anestesia, aplique presión con pinzas a la superficie palmar de la almohadilla plantar de observar la respuesta animal. Aplicar lubricante ocular para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. </li><li> Para un animal que ha sido sometido a cirugía, coloque el animal en una jaula limpia sin la compañía de otros animales. Monitorear hasta que se recuperó el conocimiento suficiente. </li><li> Culturalas células ME-180 en medio esencial mínimo alfa (α-MEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y antibióticos. </li><li> Recoger las células y mantener las células en medio completo antes de la inoculación. Contar las células utilizando un hemocitómetro. </li><li> Inocular cada ratón donante que soportar una inyección intramuscular (im) ME-180 (células de cáncer cervical humano) tumor. Nota: El crecimiento en el sitio de im ha sido seleccionado con el fin de asegurar el desarrollo de tumores bien vascularizados. Compra ratones SCID hembra (edades 6-8 semanas, aproximadamente 20 g) de una instalación de cría en el local. <ol><li> Anestesiar un ratón SCID hembra e inyectar 1 x 10 6 células ME-180 en el músculo gastrocnemio de la extremidad posterior usando una aguja de 27 G. </li><li> Medir el tamaño del tumor usando un calibrador hasta que los tumores han alcanzado 9 hasta 12 mm en su dimensión más larga. Terminar el estudio si el tumor ha superado 12 mm, o si la masa tumoral compromete comportamiento, ambulación, alimentos y agua ingesta normal. </li></ol></li><li> Piezas de tumor de implantes de ratones donantes en los ratones receptores. <ol><li> Anestesiar un ratón donante utilizando 5% isofluorano. La eutanasia el ratón por dislocación cervical bajo anestesia. Retire el tumor donante del ratón donante. Cortar el tumor en fragmentos cúbicos de 2-3 mm 3. </li><li> Anestesiar el ratón receptor utilizando 5% isofluorano. Inyectar 100 l de 0,5 mg / ml de meloxicam por vía subcutánea antes de la cirugía. Aplique una solución de yodo quirúrgica matorrales, luego etanol al 70%, y la solución de yodo, por último, a la piel afeitada. Afeitarse la extremidad posterior izquierda del ratón receptor. Hacer una incisión a nivel de la piel. Inserte un donante pieza tumoral por vía subcutánea a través de la incisión. Cierre la incisión utilizando 1-2 pinza (s) herida. </li><li> Retire los clips de 3-5 días después de la implantación. Se requiere tumor subcutáneo para el uso de la configuración de calefacción basado en láser. </li><li> Permitir que los tumores crezcan durante 2-3 semanas antes del tratamiento de calentamiento. </li></ol></li></ol> 4. Diseño, AssemCalibración blea y de un Conformal Laser Entrega iluminador En Vivo Calefacción <ol><li> Lograr el calentamiento del tejido usando un láser de diodo de 763 nm acoplado a un iluminador conformal utilizando una fibra óptica. <ol><li> El iluminador proporciona uniforme iluminación láser superficial del tumor de xenotrasplante. Se compone de un mm bloque de material altamente reflectante que contiene tres luz contiguo integración de esferas de cámara con una cámara en el medio (16 mm de diámetro) y 2 pequeñas cámaras a cada lado (16 mm de longitud y 5 mm 30 x 20 x 17 de diámetro) (Figura 1). </li><li> A fin de que la luz pase desde una cámara a la otra, dos agujeros de pequeño diámetro 5 mm se cortaron entre las pequeñas cámaras exteriores y la cámara central más grande. Light se entrega desde el láser en las cámaras exteriores utilizando una fibra de corte de extremo 400 micras conectado al láser que se pasa a la cámara a través de un agujero 600 m de diámetro. </li><li> Debido a la naturaleza de la luz interaction con las paredes de la cámara, luz entregado en una de las pequeñas cámaras es espacialmente homogeneizada a continuación, pasa a través de los puertos interiores en la cámara más grande donde es más espacialmente homogeneizada. Light entonces sale del puerto de diámetro 10 mm en la cámara intermedia. </li></ol></li><li> Calibrar el suministro de luz iluminador con respecto al ajuste de la potencia del láser utilizando un NIST calibrado 50 mm esfera de integración para medir la potencia suministrada. <ol><li> Calcular la distribución de la luz en el tumor utilizando simulaciones de Monte Carlo en base a una geometría simplificada del tumor. Generar el código de Monte Carlo en un algoritmo personalizado escrito con un paquete comercial de software computacional y la base en el código estándar de Monte Carlo modelación de transporte de la luz en los tejidos de múltiples capas de Jacques et al. 14. </li><li> Modelar el tumor como un hemisferio acostado en una línea de la piel plana con un diámetro que coincida con el tumor dimensión media de 7 mm en la superficie de la piel y un élvuelo de 5 mm. Iluminación homogénea Modelo de la superficie con el lanzamiento al azar fotones en todo el hemisferio expuesto y directa en el centro de la esfera. </li><li> Utilice las propiedades ópticas incluyendo la absorción, mu una dispersión = 0.025 mm -1,, μ s = 10 mm -1, el factor de anisotropía, g = 0,9 y el índice de refracción, n = 1,4. Utilice un millón de fotones en el cálculo. </li><li> Realizar estas medidas antes de cualquier experimentos de calentamiento in vivo sin modificaciones adicionales después de la calibración inicial. </li></ol></li></ol> 5. Conforme Calefacción del tumor usando diseñada personalizada Configuración Cámara Láser <ol><li> Conectar un extremo de una fibra de láser para el dispositivo láser y el otro extremo a la iluminador. </li><li> Anestesiar el animal usando 5% isofluorano. Inserte un G catéter de inyección 27 en la vena lateral de la cola del ratón. Insertar un catéter de 22 G en el centro del tumor. Coloque una temperatura pr fibra ópticaobe en el catéter hueco para monitorear los cambios de temperatura. </li><li> Cubrir todo el tumor con el iluminador (Figura 2). En primer lugar establecer el poder de 0,8-1 W. Encienda el láser y esperar a que la temperatura aumente. Mantener la temperatura del tumor a 42 ° C ajustando manualmente la potencia del láser entre 0,1 a 0,8 W. </li></ol> 6. Temperatura Distribución evaluada a través de la RM termometría (MRT) <ol><li> Medir la distribución de la temperatura del tumor se calienta utilizando la configuración de calentamiento a base de láser a través de cambio de frecuencia de resonancia de protones (PRF-shift) MRT en un sistema de formación de imágenes MR preclínica 7 Tesla 15 en conjunción con las mediciones de la sonda de temperatura de fibra óptica. </li><li> Adquirir imágenes de termometría a intervalos de 10 seg utilizando una secuencia de pulsos 2D-FLASH (tiempo de eco 4,5 mseg; tiempo de repetición 156,25 mseg) con 312 x 312 micras en el plano de resolución y 2 mm grosor de corte en una sola rebanada en el nivel de la fibra óptica pro temperaturaser. </li></ol> 7. MR Monitoreo de Agente de lanzamiento <ol><li> Realizar T1-ponderada de imágenes antes y 20 minutos después de la administración de Gd-HTLC. </li><li> Implante dos tumores, uno en cada una de las extremidades traseras, de un ratón SCID hembra utilizando el método descrito anteriormente en la Sección 3 para la implantación. Precalentar el tumor en la extremidad posterior izquierda durante 5 min a 42 ° C antes de la inyección de Gd-HTLC a una dosis de 66,3 mg / kg Gd-HP-DO3A y 1,4 mg / kg de CDDP, a continuación, calentar el tumor para un adicional de 20 min después de la inyección. Realizar la inyección durante el tratamiento de calentamiento. Utilice el tumor en la extremidad posterior derecha como un control sin calefacción. </li><li> Adquirir imágenes dinámicas MR (36 x 20 mm campo de visión, 200 x 200 micras en el plano de resolución, grosor de corte 2 mm; MR protocolo de secuencia) para supervisar la liberación Gd-HP-DO3A a intervalos de 12 seg para toda la 20 min después de la administración de Gd-HTLC, comenzando 30 segundos antes de la inyección. </li><li> El contorno del tumor (con calefacción y sin calefacción) y los volúmenes musculares.Calcular la media de la señal MR de todos los voxels dentro de cada volumen contorneada. </li></ol>

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Los liposomas se desarrollaron por primera vez en la década de 1960 como vehículos de administración de fármacos que transportan fármacos hidrófilos en su volumen acuoso interno y fármacos hidrofóbicos en su bicapa lipídica 2. Además de utilizar en aplicaciones terapéuticas, los liposomas han sido exploradas para aplicaciones de diagnóstico cuando están marcados con radionucleidos o cargado con agentes de contraste de formación de imágenes 17. En los últimos años, teranóstica y pa...

La fisiopatología de los tumores sólidos resultados en la permeabilidad mejorada y retención (EPR) de los sistemas de nanoescala. Esto ha llevado al desarrollo de muchos sistemas de administración de fármacos que se aprovechan de este efecto para apuntar el tejido tumoral, mientras que se minimizan los efectos secundarios sistémicos 1. Tecnologías de entrega liposomal han sido ampliamente investigados por sondas de drogas o de imagen 2. Aunque los liposomas han reducido significativamente la toxicidad sistémica en comparación con la quimioterapia convencional, ha habido pocas mejoras en 3,4 eficacia clínica. Los estudios han demostrado que la eficacia es limitada debido a la falta de liberación del fármaco desde el soporte de 4,5. Como resultado, el desarrollo de liposomas que se activan para liberar el fármaco encapsulado en respuesta a estímulos externos ha atraído una atención considerable. La hipertermia se ha empleado durante décadas como una modalidad de tratamiento relativamente seguro para los pacientes de cáncer 6. Por tanto, el desarrollo deción de liposomas termosensibles con el calor como un disparador externo ha sido una combinación lógica con un potencial significativo para la traducción clínica. De hecho, la formulación que contiene lisolípido-liposoma termosensible de la doxorrubicina, conocido como LTSL-DOX, ha llegado ahora a la evaluación clínica 7. Datos clínicos recientes con LTSL-DOX ha demostrado que el protocolo para la entrega de calor es un factor crítico que puede influir fuertemente en los resultados del paciente 8. En los seres humanos, los transductores de radiofrecuencia, microondas, láser y ultrasonido se utilizan para aplicar la hipertermia local en los sitios tumorales 9. En los estudios preclínicos que requieren calentamiento de tumores subcutáneos, catéteres calefacción 10,11 y baños de agua 12,13 más a menudo se emplean. En este manuscrito, presentamos un nuevo método para calentar tumores subcutáneos utilizando una configuración de calefacción basado en láser diseñado a medida, lo que permite un calentamiento más de conformación del volumen tumoral. Usando ma compatible MRteriales, la configuración es lo suficientemente pequeño como para caber dentro de la perforación de un pequeño generador de imágenes MR animal, lo que permite la monitorización en tiempo real de los cambios en la temperatura del tejido durante el calentamiento de láser. El agente de contraste MR, gadoteridol (Gd-HP-DO3A), fue co-encapsulado con CDDP en una formulación de liposoma termosensible de CDDP (HTLC), conocido como D-os-HTLC, en tiempo real el seguimiento y evaluación de calor guiado por imagen de RM activado por la liberación del fármaco y la validación del protocolo de calentamiento. Nuestros resultados demuestran que el aparato de calentamiento basado en láser de manera eficiente activa la liberación de los agentes encapsulados de la formulación de Gd-HTLC mientras se supervisa a través de la RM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Heidolph Instruments GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td>Laborota 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure extruder</td>
			<td>Northern Lipids Inc.</td>
			<td>T.001</td>
			<td>10 mL thermobarrel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating circulator</td>
			<td>VWR International LLC.</td>
			<td>11305</td>
			<td>Connected to extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605;110606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential scanning calorimeter (DSC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Q100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer (ICP-AES)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Optima 7300DV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd.</td>
			<td>Nano-ZS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>NuAire Inc.</td>
			<td>NU-5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip wound clip applier</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>427630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip wound clip remover</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>427637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>427631</td>
			<td>9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>763 nm Laser device</td>
			<td>Biolitec</td>
			<td>Ceralas CD 403 laser</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser probe</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td>FT400EMT</td>
			<td>With SMA and flat cleave connectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectralon (illuminator)</td>
			<td>Labsphere Inc.</td>
			<td>FAST-SL-5CMX5CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CSTM-SL-5CMX5CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 Tesla prelinical magnetic resonance (MR) imaging system</td>
			<td>Bruker Corporation</td>
			<td>Biospec 70/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic temperature sensor</td>
			<td>LumaSense Technologies Inc.</td>
			<td>Luxtron FOT Lab Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrating sphere</td>
			<td>Newport Corporation</td>
			<td>819C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>Newport Corporation</td>
			<td>1830-R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

custom-designed laser-based heating apparatus for triggered release of cisplatin from thermosensitive liposomes with magnetic resonance image guidance

Los liposomas se han empleado como sistemas de administración de fármacos para atacar tumores sólidos a través de la explotación de la permeabilidad mejorada y retención (EPR) efecto resultante en reducciones significativas en la toxicidad sistémica. Sin embargo, la liberación insuficiente del fármaco encapsulado de liposomas ha limitado su eficacia clínica. Liposomas sensibles a la temperatura han sido diseñados para proporcionar una liberación específica de sitio de la droga con el fin de superar el problema de la biodisponibilidad del fármaco tumor limitado. Nuestro laboratorio ha diseñado y desarrollado una formulación activado por calor termosensible de liposomas de cisplatino (CDDP), conocido como HTLC, para proporcionar la liberación desencadenada de CDDP en tumores sólidos. Suministro de calor activado in vivo se logró en modelos murinos utilizando un aparato de calefacción basado en láser hecha a la medida que proporciona un patrón de calentamiento conformal en el sitio del tumor según lo confirmado por MR termometría (MRT). Un dispositivo de monitorización de la temperatura de fibra óptica se utilizó para medir la temperatura en tiempo realdurante todo el periodo de calentamiento con ajuste de línea de suministro de calor por la alternancia de la potencia del láser. El suministro de fármacos se optimizó con resonancia magnética (MR) de guiado por imagen por la co-encapsulación de un agente de contraste MR (es decir, gadoteridol) junto con CDDP en los liposomas termosensibles como un medio para validar el protocolo de calentamiento y para evaluar la acumulación de tumor. El protocolo de calentamiento consistió en un período de precalentamiento de 5 min antes de la administración de HTLC y 20 min de calentamiento post-inyección. Este protocolo de calentamiento resultó en la liberación efectiva de los agentes encapsulados con el cambio más alto de la señal MR observado en el tumor se calienta en comparación con el tumor sin calefacción y el músculo. Este estudio demostró la aplicación exitosa del aparato de calentamiento basado en láser para el desarrollo preclínico liposoma termosensible y la importancia de la validación guiada por RM del protocolo de calentamiento para la optimización de la administración de fármacos.

Los liposomas HTLC se fabrican utilizando métodos comunes, incluyendo la formación de película de lípidos, la hidratación, la extrusión y la diálisis. Durante los pasos que implican CDDP, se debe tener cuidado de no exponer CDDP a cualquier material de aluminio, como CDDP se desactiva a través de la formación de un depósito negro. Una ilustración de HTLC se muestra en la Figura 3. Las propiedades físico-químicas de HTLC se resumieron en un manuscrito publicado recientemente...

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Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Un aparato de calentamiento basado en láser de diseño personalizado compatible con MRI ha sido desarrollado para proporcionar calentamiento local de tumores subcutáneos con el fin de activar la liberación de agentes a partir de liposomas termosensibles específicamente a la región del tumor.

Diseño personalizado basado en láser máquinas de calentamiento para lanzamiento disparada de cisplatino de termosensible liposomas con Resonancia Magnética Orientación Imagen

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

custom-designed-laser-based-heating-apparatus-for-triggered-release

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.0K vistas.  University of Toronto.  Un aparato de calentamiento basado en láser de diseño personalizado compatible con MRI ha sido desarrollado para proporcionar calentamiento local de tumores subcutáneos con el fin de activar la liberación de agentes a partir de liposomas termosensibles específicamente a la región del tumor. 

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Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Metodología elastografía por resonancia magnética para la Evaluación de los tejidos Diseñado crecimiento Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Investigación

Bioingeniería

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

X-ray fluoroscopy-guided endovascular procedures have several significant limitations, including difficult catheter navigation and use of ionizing radiation, which can potentially be overcome using a magnetically steerable catheter under MR guidance.
	The main goal of this work is to develop a microcatheter whose tip can be remotely controlled using the magnetic field of the MR scanner. This protocol aims to describe the procedures for applying current to the microcoil-tipped microcatheter to produce consistent and controllable deflections.
	A microcoil was fabricated using laser lathe lithography onto a polyimide-tipped endovascular catheter. In vitro testing was performed in a waterbath and vessel phantom under the guidance of a 1.5-T MR system using steady-state free precession (SSFP) sequencing. Various amounts of current were applied to the coils of the microcatheter to produce measureable tip deflections and navigate in vascular phantoms.
	The development of this device provides a platform for future testing and opportunity to revolutionize the endovascular interventional MRI environment.

Current applied to an endovascular microcatheter with microcoil tip made by laser lathe lithography can achieve controllable deflections under magnetic resonance (MR) guidance, which may improve speed and efficacy of navigation of vasculature during various endovascular procedures.

Magnéticamente Asistencia Remota Controlada microcatéter desviación de la punta bajo la resonancia magnética

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of smart soft devices for biomedical applications. Although a number of magnetically-responsive drug delivery systems have demonstrated efficacies through either in vitro proof of concept studies or in vivo preclinical applications, their use in clinical settings is still limited by their insufficient biocompatibility or biodegradability. Additionally, many of the existing platforms rely on sophisticated techniques for their fabrications. We recently demonstrated the fabrication of biodegradable, gelatin-based thermo-responsive microgel by physically entrapping poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) chains as a minor component within a three-dimensional gelatin network. In this study, we present a facile method to fabricate a biodegradable drug release platform that enables a magneto-thermally triggered drug release. This was achieved by incorporating superparamagnetic iron oxide nanoparticles and thermo-responsive polymers within gelatin-based colloidal microgels, in conjunction with an alternating magnetic field application system.

We present a facile method to fabricate a biodegradable gelatin-based drug release platform that is magneto-thermally responsive. This was achieved by incorporating superparamagnetic iron oxide nanoparticles and poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) within a spherical gelatin micro-network crosslinked by genipin, in conjunction with an alternating magnetic field application system.

Alternando microgeles de gelatina de campo híbrido-Responsive magnéticos para Controlled Drug Release

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

El rápido escaneo de electrones resonancia paramagnética abre nuevas vías para Imaging fisiológicamente parámetros importantes<em&gt; En Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

Guiada por imagen, fabricación basada en láser de Redes de microfluidos derivados-vascular

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Magnetic and Thermal-sensitive Poly(N-isopropylacrylamide)-based Microgels for Magnetically Triggered Controlled Release

Magnetically and thermally sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm)/Fe3O4-NH2 microgels with the encapsulated anti-cancer drug curcumin (Cur) were designed and fabricated for magnetically triggered release. PNIPAAm-based magnetic microgels with a spherical structure were produced via a temperature-induced emulsion followed with physical-crosslinking by mixing PNIPAAm, polyethylenimine (PEI), and Fe3O4-NH2 magnetic nanoparticles. Because of their dispersity, the Fe3O4-NH2 nanoparticles were embedded inside the polymer matrix. The amine groups exposed on the Fe3O4-NH2 and PEI surface supported the spherical structure by physically crosslinking with the amide groups of the PNIPAAm. The hydrophobic anti-cancer drug curcumin can be dispersed in water after encapsulation into the microgels. The microgels were characterized by transmission electron microscopy (TEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), and UV-Vis spectral analysis. Furthermore, magnetically triggered release was studied under an external high frequency magnetic field (HFMF). A significant &#34;burst release&#34; of curcumin was observed after applying the HFMF to the microgels due to the magnetic inductive heating (hyperthermia) effect. This manuscript describes the magnetically triggered controlled release of Cur-PNIPAAm/Fe3O4-NH2 encapsulated curcumin, which can be potentially applied for tumor therapy.

Magnetic and Thermal-sensitive PolyN-isopropylacrylamide-based Microgels for Magnetically Triggered Controlled Release

This manuscript describes the preparation of magnetic and thermal-sensitive microgels via a temperature-induced emulsion without chemical reaction. These sensitive microgels were synthesized by mixing poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm), polyethylenimine (PEI) and Fe3O4-NH2 nanoparticles for the potential use in magnetically and thermally triggered drug-release.

Poliuretano Magnético y Térmico<emN</em&gt; -isopropilacrilamida) para liberación controlada magnéticamente

Magnetically and thermally sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm)/Fe3O4-NH2 microgels with the encapsulated anti-cancer drug curcumin (Cur) were ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Apoyo metabólico de suprimidos, los tejidos de cerebro vivos durante la adquisición de la microscopía de resonancia magnética

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Preparación, purificación y uso de liposomas que contienen ácidos grasos

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

Aparato para la recolección de tejido Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading chemotherapeutic drugs, such as doxorubicin (DOX). To achieve this, an ethanolic lipid mixture and ammonium sulfate solution are injected into a staggered herringbone micromixer (SHM) microfluidic device. The solutions are rapidly mixed by the SHM, providing a homogeneous solvent environment for liposomes self-assembly. Collected liposomes are first annealed, then dialyzed to remove residual ethanol. An ammonium sulfate pH-gradient is established through buffer exchange of the external solution by using size exclusion chromatography. DOX is then remotely loaded into the liposomes with high encapsulation efficiency (&#62; 80%). The liposomes obtained are homogenous in size with Z-average diameter of 100 nm. They are capable of temperature-triggered burst release of encapsulated DOX in the presence of mild hyperthermia (42 &#176;C). Indocyanine green (ICG) can also be co-loaded into the liposomes for near-infrared laser-triggered DOX release. The microfluidic approach ensures high-throughput, reproducible and scalable preparation of LTSLs.

The protocol presents the optimized parameters for preparing thermosensitive liposomes using the staggered herringbone micromixer microfluidics device. This also allows co-encapsulation of doxorubicin and indocyanine green into the liposomes and the photothermal-triggered release of doxorubicin for controlled/triggered drug release.

Producción microfluídica de liposomas sensibles a la temperatura que contienen lysolipido

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...