Este protocolo permite realizar nuevas pruebas preclínicas de hipertermia dirigida al tumor en combinación con fármacos termosensibles, que se pueden aplicar para mejorar la supervivencia y reducir la toxicidad sistémica en pacientes con sarcoma. La principal ventaja de esta técnica es que la liberación de quimioterapia se limita a la región calentada, maximizando la liberación del fármaco dentro del tumor mientras se minimiza la liberación sistémica del fármaco en el tejido sano. Nuestros métodos se pueden traducir clínicamente para tratar sarcomas.
Además, nuestro trabajo está aprendiendo cómo la hipotermia localizada puede incitar al sistema inmunológico a ayudar al cuerpo a atacar el cáncer junto con la quimioterapia estándar. Warren Foltz, el físico principal de resonancia magnética en el Centro de Innovación Star, el Dr. Adam Waspe, el físico principal de HIFU en el Hospital para Niños Enfermos, y Suzanne Wong, graduada de maestría en ciencias aplicadas del Laboratorio Drake en el hospital para niños enfermos en Toronto. Para comenzar, afeite la pata trasera del ratón restringido con tijeras y límpielo con etanol al 70%.
Aspirar aproximadamente 10, 000 células en 10 microlitros de solución de suspensión celular usando una jeringa de microlitros. Extienda la pata trasera derecha del ratón e inyecte la suspensión celular en un movimiento constante en la musculatura del muslo con una jeringa de microlitros con una aguja de calibre 26. La aguja debe insertarse paralela al fémur hacia la rodilla, teniendo cuidado de no golpear el nervio ciático.
Retire la aguja y devuelva el ratón a una segunda jaula. Evalúe a los animales diariamente y controle sus extremidades posteriores para detectar el crecimiento del tumor a través de la palpación. Imagen del ratón anestesiado usando el escáner de resonancia magnética.
En la imagen ponderada T2, tome nota de las dimensiones planas y el número de cortes axiales en los que aparece el tumor. Tenga en cuenta la ubicación del tumor en referencia al fémur y la superficie lateral del muslo donde entraría la onda de ultrasonido. Para preparar el sistema HIFU de pequeño calibre, encienda el generador, coloque la membrana en el transductor y llene el transductor con suficiente agua desionizada hasta que la membrana se expanda debajo del transductor.
Pero no tan firme como para comprimir el ratón. Desgasifique el agua en el circuito del transductor durante 30 minutos para eliminar el oxígeno disuelto del medio. Después de anestesiar al ratón y transferirlo a un cono nasal, aplique un lubricante corneal en los ojos para evitar daños debido a la falta de reflejo de parpadeo bajo anestesia.
Afeite la extremidad trasera derecha del ratón. Aplique crema depilatoria en el área afeitada, incluida toda la extremidad posterior derecha. Coloque el ratón bajo una lámpara de calor mientras está en el gabinete de bioseguridad para ayudar con la regulación térmica.
Y retirar el vello y la crema depilatoria un minuto después de la aplicación. Mueva el mouse a un cono nasal compatible con MRI en el trineo de MRI y coloque el mouse con el lado sin cojinete del tumor hacia abajo y el tumor superior dentro de un soporte de mouse impreso en 3D en el trineo. Coloque una lámpara de calor cerca del ratón para mantenerlo caliente.
Si es necesario, corte un segmento comprimido de almohadilla de gel de ultrasonido para colocar debajo del mouse que recubre la parte inferior del soporte con un grosor para nivelar el tumor hasta la parte superior del soporte. Coloque la pierna no involucrada lejos de la pierna del tumor, ya sea debajo del ratón o extendida con la pierna tumoral flexionada. Asegúrese de que los pies no estén en el campo cercano o lejano del tumor y la trayectoria del haz de ultrasonido.
Para insertar la sonda de temperatura esofágica, pase la sonda esofágica a través del cono de la nariz y frote el cuello del ratón. Incline la nariz del ratón hacia arriba para crear una línea desde su boca directamente hasta su estómago extendiendo la cabeza. Deslice la sonda térmica por encima de la lengua unos 0,5 centímetros en el esófago del ratón y reemplace el cono de la nariz alrededor de la nariz del ratón.
Asegure la sonda esofágica y el cono de la nariz en la parte superior del trineo. A continuación, inserte la sonda de temperatura rectal y asegúrela con cinta adhesiva. Inserte otra almohadilla de gel si es necesario y aplique lubricante para los ojos o gel de ultrasonido alrededor de la extremidad posterior derecha para llenar cualquier vacío.
Inserte un catéter de vena de cola de aguja de mariposa calibre 27 en una vena lateral de la cola conectada a un microtubo con 40 microlitros de espacio muerto y cinta adhesiva de forma segura. Coloque el monitor respiratorio con el cable de conexión hacia la cabeza del ratón para que no interfiera con la colocación del transductor de ultrasonido, asegure con cinta adhesiva. Use dos personas para llevar el ratón preparado, el trineo del ratón, la línea de anestesia, la línea respiratoria, el catéter de la vena de la cola y los cordones de la sonda térmica en el escáner de resonancia magnética y colóquelos en el soporte del trineo de resonancia magnética.
Todo el mundo ha sido examinado y no se ha introducido nada en la sala de RM, que es ferromagnético o podría dañarse dentro del fuerte campo magnético del sistema. Después de que el operador del software HIFU mueva el menisco del transductor directamente sobre el tumor para una alineación inicial, aplique lubricante ocular o gel de ultrasonido desgasificado a la piel sin vello por encima del tumor y acople el transductor HIFU al área del tumor. Conecte la línea de administración de fármacos desde la bomba automática al catéter de la vena de la cola y calcule la cantidad de espacio muerto en la línea de la vena de la cola y la línea de conexión.
Deslice el trineo HIFU del ratón sobre los rieles de la resonancia magnética en el centro de la resonancia magnética y coloque el dispositivo de calentamiento por convección de aire en la configuración más cálida. Apunte el tubo que sopla aire hacia el ratón en el centro del orificio de resonancia magnética y asegúrelo con cinta adhesiva. El dispositivo de calentamiento se girará más tarde a su configuración más baja para evitar el sobrecalentamiento del mouse durante la sonicación.
Adquiera las imágenes de RM de la encuesta de axial y sagital para determinar la ubicación del tumor para la orientación de la sonicación, incluida la profundidad. Ajuste la posición del transductor en consecuencia utilizando el software HIFU insertando la distancia de movimiento deseada medida en la imagen y, a continuación, haciendo clic en la dirección de flecha para moverse. Además, tenga en cuenta la ubicación del tubo de deriva.
Repita según sea necesario. Determine la ubicación del punto focal del transductor en el plano cornal realizando una breve sonicación de disparo de prueba continua de 50 milivoltios durante cinco segundos durante la adquisición de la termometría de disparo de prueba. Alinee las imágenes de la encuesta MR con la vista cornal del punto focal dentro del software HIFU.
Revise las imágenes para la ubicación del tumor en relación con la estructura ósea y el recto, y revise el posicionamiento del transductor según se considere necesario. Repita la sonicación de la toma de prueba durante nueve imágenes térmicas de repetición para confirmar si hay un calentamiento uniforme y preciso en el volumen del tumor con un calentamiento mínimo fuera del objetivo. Ajuste la ubicación del corte, la ubicación del transductor y la profundidad de la dirección y confirme el rendimiento de calentamiento con tomas de prueba repetidas según se considere necesario.
Usando el software de monitoreo de tratamiento HIFU, defina la región de interés, o ROI, para el monitoreo de termometría dentro del perfil de calentamiento final midiendo la distancia a mover y luego alterando las coordenadas de la cuadrícula en el programa. Establezca un ROI dentro de la señal de fluido del tubo de deriva para la corrección de deriva de la salida de termometría . Si esta señal de fluido no está bien definida dentro de la imagen de planificación axial a nivel del tumor, entonces la salida directa de la sonda de temperatura de fibra óptica dentro del tubo de deriva se utiliza para la corrección de deriva.
Introduzca la temperatura de referencia en función de la temperatura de la sonda rectal para las mediciones de termometría . Abra las especificaciones de tratamiento de hipertermia de 20 minutos en el software e inicie la sonicación una vez que se recopilen las imágenes de RM de referencia y comience la termometría . Realice un tratamiento de 20 minutos durante la termografía utilizando el software de controlador derivado integrador proporcional incorporado, o PID.
Inyecte el medicamento seleccionado 1.5 minutos después de que la temperatura en el ROI se caliente a la temperatura deseada. Si la temperatura rectal aumenta rápidamente durante el tratamiento y supera los 40 grados centígrados, detenga la sonicación y permita que la temperatura rectal baje antes de reiniciar. Después de completar el tratamiento, retire el ratón del orificio de resonancia magnética, asegurando la hemostasia en el sitio de inserción del catéter de la vena de la cola y transfiéralo al gabinete de bioseguridad.
Lave el gel de ultrasonido y el lubricante de la pata trasera con agua. Transfiera el ratón a su jaula y supervise su recuperación. Apunte la lámpara de calor en un extremo de la jaula para ayudar con la regulación térmica durante la recuperación.
Usando este protocolo de hipertermia, los tumores en la extremidad posterior pudieron calentarse constantemente a la temperatura establecida deseada durante la duración del tratamiento. La temperatura monitoreada durante el tratamiento representativo se muestra en esta figura. Aquí se presentan las temperaturas promedio del percentil 10 superior y del percentil 90 superior de todos los vóxeles en el ROI.
Las temperaturas promedio durante el tratamiento dentro del ROI para cada ratón se probaron durante la fase de optimización con la desviación estándar. También se muestra la temperatura media general. Las tasas de éxito del tratamiento de la hipertermia también mejoraron con el tiempo.
El éxito del tratamiento dependió de los criterios de inclusión. Esa es la temperatura sistémica, la temperatura del tumor y la variación con el ROI y sin calentamiento distal. Aquí, la línea azul representa el porcentaje de ratones para los que el tratamiento fue exitoso y las barras naranjas representan el número de ratones tratados.
Cada tratamiento se refiere a una fecha separada en la que se realizaron los experimentos. Para determinar el tiempo óptimo de tratamiento con hipotermia para estudios adicionales, se probaron dos duraciones de tratamiento, 10 minutos y 20 minutos. Se utilizó cromatografía líquida de alta resolución y espectrometría de masas, o HPLC MS, para evaluar la cantidad de doxorrubicina en los tumores y cuantificar la diferencia en la acumulación de doxorrubicina entre las duraciones probadas.
Los resultados demuestran la importancia entre la cantidad de doxorrubicina en el tumor en el grupo de doxorrubicina liposomal termosensible de 20 minutos más hipertermia en comparación con el control normal de la termia. No se observaron diferencias en el tumor en los grupos de doxorrubicina libre. Al preparar y posicionar la masa, es imperativo que el haz HIFU no esté obstruido.
Se deben evitar las burbujas de aire en el gel o hueso en la trayectoria del haz. Recolectamos tejido y sangre para analizar la farmacocinética y los niveles de toxicidad en varios órganos, así como examinar la respuesta inmediata y retardada del sistema inmune al tratamiento.
