Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología tumoral sobre los mecanismos moleculares de la metástasis. La principal ventaja de esta técnica es que el reclutamiento de células tumorales dentro de un órgano remoto puede ser la cantidad. Comience por usar un reactivo de disociación celular no enzimática para eliminar las células de carcinoma pulmonar Lewis que expresan proteínas fluorescentes, o LLC, de su recipiente de cultivo de acuerdo con los protocolos estándar.
Transfiera la solución celular resultante a un tubo cónico de 15 mililitros antes de la centrifugación, y centrifugar los pellets dos veces en cinco mililitros de PBS por lavado. Después del segundo lavado, filtre las células a través de un colador de células de poro de 40 micrómetros y diluya la suspensión a una de cada 10 a las seis células por concentración de mililitro. Luego cargue las células en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja del calibre 29 e inyecte 100 microlitros de células en la vena de la cola de cada ratón macho de ocho a 10 semanas de edad, C57-Negro-6.
En el punto final experimental adecuado, utilice tijeras para extraer la piel de la superficie ventral de cada ratón, y corte las costillas y el diafragma para exponer la cavidad torácica. Utilice una aguja de infusión alada de 25 calibres y un tubo para lavar 15 mililitros de PBS a través del ventrículo derecho, y retire el corazón y el timo. Agarrar la tráquea con fórceps, tirar hacia arriba, diseccionar los tejidos conectivos alrededor de la tráquea, para cosechar los pulmones.
Luego lave los pulmones en PBS y desprenda un lóbulo para la visualización de las células fluorescentes in situ bajo un microscopio de fluorescencia. Para digerir el tejido pulmonar, primero corta el lóbulo caudal con tijeras y coloca las piezas pulmonares en una jeringa de 10 mililitros. Cierre la jeringa con el émbolo y aspire cinco mililitros de solución de digestión en la jeringa, moviendo el émbolo dentro y fuera del eje de la jeringa hasta que el tejido pulmonar se disefunda a lo largo de la solución.
Dispensar la suspensión pulmonar en un tubo de 50 mililitros, y digerir el tejido en una coctelera recíproca durante 15 minutos a 37 grados Celsius y 150 rpm. Al final de la incubación, triturar el tejido restante hasta que las células pulmonares estén completamente dispersas, y devolver el tubo al agitador durante 30 minutos adicionales. Luego filtra las células a través de un colador de poro de 40 micrómetros, y recoge las células por centrifugación.
Para analizar las células pulmonares aisladas por citometría de flujo, resuspendir el pellet en dos mililitros de tólus de células sanguíneas rojas tampón durante un minuto a temperatura ambiente, y recoger las células por centrifugación. A continuación, centrifugar el pellet dos veces en cinco mililitros de PBS fresco complementado con 1%albúmina sérica bovina por lavado. Después de la segunda centrifugación, resuspender el pellet en un mililitro de PBS fresco más BSA, y filtrar las células a través de un nuevo colador de poro de 40 micrómetros para la cuantificación de las células tumorales por citometría de flujo.
Los pulmones presentan muchas células GFP-LLC dos horas después de la inyección, con la gran mayoría de las células desapareciendo de los pulmones dentro de las 24 horas. Tenga en cuenta que los puntos fluorescentes que se detectan dentro del filtro rojo deben excluirse del recuento de celdas. Para confirmar el número de GFP-LLC en los pulmones, uno de los lóbulos se puede utilizar para el análisis citométrico de flujo como se demuestra.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que un procedimiento de sección congelada es un método más preciso para observar la ubicación exacta de las células tumorales.
