Estos métodos pueden proporcionar información mecanicista sobre la citotoxicidad de las células tumorales mediadas por células inmunitarias y el comportamiento invasivo en un entorno 3D. La principal ventaja de esta técnica es que este modelo de co-cultivo esferoides 3D no requiere la transferencia de esferoides para múltiples ensayos posteriores. Demostrando este procedimiento estará Apsra Nasir, una estudiante de doctorado de nuestro departamento.
Para generar los esferoides utilizando la técnica aséptica en una capucha de cultivo celular añadir 500 microlitros de agarosa fundida en un molde de caucho de 81 micropocillos teniendo cuidado de evitar burbujas. Cuando la agarosa se ha solidificado cuidadosamente flexionar el molde de goma para salir de la agarosa se funde en pozos individuales de una placa de 12 pozos. Para equilibrar los moldes añadir 2,5 mililitros de medio de cultivo celular complementado con 10%suero bovino fetal en cada pozo y colocar la placa en una incubadora de cultivo celular durante una hora.
Al final de la incubación inclinar la placa para eliminar el medio de cultivo celular en el entorno primero, luego en la cámara de siembra y cuidadosamente sembrar 190 microlitros de la célula tumoral suspensión gota a gota en cada cámara de siembra celular. Después de una incubación de 15 minutos en la incubadora de cultivo celular añadir a 2,5 mililitros de medio al exterior del yeso y devolver la placa a la incubadora durante 48 horas. Para establecer un co-cultivo de células T resuspendir el número adecuado de células T en 190 microlitros de cultivo inapropiado de células T, medio por pozo hasta el pozo 12 para permitir la eliminación del medio de cultivo celular que rodea la agarosa echada primero.
Luego, en la cámara de siembra, sin quitar los esferoides, utilice un microscopio de luz para comprobar si se ha aspirado algún esferoides y sosteniendo la pipeta cargada P200 aproximadamente medio centímetro por encima de cada yeso cuidadosamente sembrar las células T sobre los moldes de una manera gota sin desalojar los esferoides. Cuando todos los moldes han sido sembrados cuidadosamente devolvió la placa a la incubadora de cultivo celular durante 15 minutos antes de agregar medio de cultivo celular fresco complementado con suero bovino fetal al exterior de cada yeso para otra incubación de 48 horas. Para incrustar los co-cultivos 3D en colágeno diluido de colágeno tipo uno con base libre de suero medio a una concentración de trabajo final de tres miligramos por mililitro y añadir 11 microlitros de 10X PBS, añadir 1,2 microlitros de un hidróxido de sodio molar por 100 microlitros de colágeno.
Después de neutralizar la solución de colágeno en hielo durante una hora, retire el medio de cultivo celular que rodea y dentro de cada yeso como se ha demostrado. Añadir cuidadosamente el colágeno neutralizado una mezcla a cada moldeado de una manera dropwise, e inmediatamente devolvió el plato a la incubadora de cultivo celular durante cinco minutos antes de invertir el plato durante una hora adicional en la incubación. Al final de la incubación coloque la placa del lado derecho hacia arriba en la campana de bioseguridad y agregue lentamente un medio de cultivo celular fresco por el lado de cada pozo.
A continuación, devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante 48 horas. Para la tinción inmunofluorescente de los co-cultivos 3D incrustados fijar cada fundición de agarosa entera incluyendo los esferoides en 5.4% formalina durante la noche a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Al día siguiente, retire el formol que rodea el molde de agarosa y utilice pinzas de punta elegantes para agarrar la esquina de cada matriz de colágeno para permitir que los moldes se pelen de las cámaras de siembra en un solo movimiento fluido.
Coloque cada parche de colágeno en un solo pozo de un portaobjetos de cámara de ocho pozos y agregue 250 microlitros de 0,5% de octoxinol a cada pozo. Después de una hora a temperatura ambiente reemplace el octoxinol con 250 microlitros de solución de bloqueo. Después de una hora a temperatura ambiente añadir un 250 microlitros del cóctel de anticuerpos primario de interés para cada pozo y colocar un tobogán en una cámara húmeda oscura durante la noche a temperatura ambiente.
A la mañana siguiente, retire el anticuerpo primario de cada pozo y lave los pozos tres veces con 300 microlitros de Tampón IF durante cinco minutos a temperatura ambiente por lavado. Después del último lavado, agregue 250 microlitros de solución de anticuerpos secundarios inapropiadas a cada pozo durante una incubación de una hora a temperatura ambiente protegida de la luz. Al final de la incubación retire el anticuerpo y lave cada muestra tres veces con Tampón IF como se ha demostrado.
Después del último lavado enjuague las muestras con 300 microlitros de PBS por pozo y retire cuidadosamente las paredes del portaobjetos de la cámara. Para que sólo quede el tobogán de vidrio en la parte inferior. Añadir 200 microlitros de medio de montaje a la corredera de vidrio y dejar caer cuidadosamente el resbalón de cubierta en la muestra sin crear burbujas y luego almacenar las muestras montadas en un lugar oscuro seco durante la noche antes de la toma de imágenes por microscopía de fluorescencia confocal Aquí se pueden observar las configuraciones experimentales típicas para los ensayos y producen muestras representativas y analizables al final del experimento para cada protocolo.
La incorporación del cultivo 3D en colágeno tipo uno dentro de los micro pozos de un molde de agarosa permite el seguimiento y análisis de la invasión por imagen J.In este análisis de dos líneas celulares de cáncer de páncreas primarias y páncreas se observaron diferentes formas esferoides y comportamientos invasivos. La primera línea celular demostró una formación de esferoides más compacta e invasión puntiaguda similar a la observada para las invasiones de una sola célula. Mientras que la segunda línea celular formó esferoides que estaban más sueltos y demostró un patrón de invasión colectiva.
El co-cultivo se puede realizar con dos líneas celulares clonales tumorales diferentes sembradas al mismo tiempo o con tumor y células T tras la formación de esferoides tumorales o una evaluación posterior de la interacción del tumor en células T. Para una evaluación detallada del comportamiento invasivo, la tinción inmunofluorescente y las imágenes focales con se pueden realizar de una manera de alto rendimiento. El elenco de agarosa permite la inserción de todo el sistema de cultivo 3D en parafina para sección en serie y tinción de inmunohistoquímica para cuantificar la relación espacial entre el tumor y las células T.
Por ejemplo, la infiltración de células T se puede identificar y caracterizar por la tinción de marcadores de superficie celular. Esta técnica permite el análisis de muestras de pacientes, así como el uso de fármacos estimulantes y bloqueadores para sondear las interacciones de células T de células tumorales.
