Este trabajo fue parcialmente apoyado por la Región Toscana y la Comunidad Europea en el marco de la burbuja ERA-NET + Proyectos LUS y BI-TRE.

Nota: Todas las concentraciones de oro nanorods se expresan en términos de molaridad Au nominales. Para la comparación con otras obras, tenga en cuenta que 1 M Au corresponde aproximadamente a 20 M nanobastones de oro, en nuestro caso. 1. Preparación de Oro catiónico Nanorods Nota: El método comienza con la síntesis de bromuro de cetrimonio (CTAB) -capped nanorods de oro por la reducción autocatalítica de HAuCl4 con ácido ascórbico, de acuerdo con el protocolo establecido por Nikoobakht et al 25 y adaptado según Ratto et al 26... Entonces estos nanorods de oro se modificaron con el fin de ganar más biocompatibilidad y afinidad por las membranas plasmáticas, por la combinación de polietilenglicol hebras 10, 11, 27, 28 y 22 compuestos de amonio cuaternario. <ol><li> Purificar 24 ml nanobastones oro coronadas de CTAB en una concentration de 450 M Au mediante dos ciclos de centrifugación (12.000 xg, 30 min) y decantación. Asegúrese de que la relación del volumen muerto al volumen inicial es de alrededor de 1/200 o más bajo de todos los pasos de centrifugación en este protocolo. Utilice CTAB 500 M acuosa como una solución de lavado y, finalmente, transferir las partículas en tampón de acetato de 6 ml 100 mM a pH 5 que contiene 500 mM CTAB y polisorbato 20 0,005% (v / v). </li><li> Añadir 30 l 10 mM acuoso alfa-metoxi-omega-mercapto-poli (etileno glicol) (MW ~ 5000) y dejar reaccionar durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Añadir 30 l de 100 mM (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N bromuro de trimetilamonio en dimetilsulfóxido y dejar en reposo durante 24 horas a 37 ° C. </li><li> A continuación, añadir 18 ml 0,005% (v / v) de polisorbato 20 en agua y purificar estas partículas de cuatro ciclos de centrifugación (12.000 xg, 30 min) y decantación. Utilice 0,005% (v / v) de polisorbato 20 en agua como solución de lavado y, finalmente, transferir las partículas en 2,4 ml de PBS estéril a pH7.4. La concentración nominal final del oro es de 4,5 mm. </li></ol> 2. La carga de macrófagos murinos con oro Nanorods <ol><li> Utilice la línea celular de monocitos / macrofágica J774A.1 y DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, glutamina 1 mM, 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina como medio de cultivo. Placa de 5 x 10 5 células en cuatro placas de Petri de 60 mm de diámetro y les permiten crecer durante 24 horas, a fin de ser subconfluentes en el momento de la separación (véase el paso 2.2). <ol><li> Durante todo el protocolo, mantener las células bajo condiciones de cultivo estándar (37 ° C, 5% de CO 2, 95% de aire y 100% de humedad relativa). Utilizar una cabina de flujo laminar y equipo de protección personal adecuado para manipular las células. </li></ol></li><li> Después de 24 horas, cargar las células con nanobastones oro catiónicos y prepararlos para ser embebido en películas de quitosano: <ol><li> Con el fin de permitir que las partículas sean absorbidos por las células, añadir una alícuota de 4,5Au mM nanobastones oro catiónico en PBS a cada placa de Petri, con el fin de lograr una concentración final de 100 mM de Au. Deje las placas de Petri en la incubación durante 24 horas. </li><li> A continuación, observar las células bajo un microscopio óptico para confirmar sus buenas condiciones y la carga. Las células deben exhibir su morfología normal y un número de vesículas intracelulares oscuros. Separar las células por un rascador, fusionar los de dos placas de Petri, con el fin de lograr una cantidad adecuada de células para los siguientes pasos (al menos 2 x 10 6 células), y centrifúguelas (120 xg, 6 min) para eliminar cualquier el exceso de oro nanorods catiónicos. El sedimento celular debería ser casi negro. </li><li> Suspender el sedimento en 2 ml de PBS y contar las células por el uso de una cámara de Bürker. Centrifugar una suspensión que contiene 2 x 10 6 células (120 xg, 6 min) y fijar su sedimento en 2 ml 3,6% (w / v) de formaldehído en PBS durante diez minutos a temperatura ambiente. Por último, lavar esta pastilla tres veces por centrifugation (120 xg, 6 min) con el fin de eliminar el fijador. Utilice PBS como solución de lavado. </li></ol></li></ol> 3. Integración de los macrófagos en quitosano Films Nota: Las propiedades peculiares de quitosano 26, 27, 28, 29 son explotados para producir fantasmas biomiméticos que contienen macrófagos teñidos con oro nanorods catiónicos. Con respecto a otros hidrogeles tales como agarosa, quitosán permite películas que son mucho más fuertes y más delgada, lo cual es crítico para la PA 6 microscopía. La fabricación de estos fantasmas se lleva a cabo de acuerdo con protocolos anteriores 29, 30, 31, con algunas modificaciones como se prescribe en las siguientes 30. <ol><li> Preparar un acidificada (pH 4,5, que se obtiene por la adición de ácido acético) y viscoso 3% (w / v) de quitosano de bajo peso molecular (PM medio 120 kDa) solución, mezclar bien ydejar que homogeneizar durante 24 horas a 40 ° C. </li><li> A continuación, la mezcla macrófagos murinos contienen nanorods oro catiónico (2 x 10 6 células) con 500 l de solución de quitosano. </li><li> Con el fin de obtener ~ 50 micras de espesor fantasmas, verter 250 mg de la mezcla en 1,91 cm 2 moldes de poliestireno y dejarlos bajo una corriente de nitrógeno durante 24 hr. Después de ello, el tratamiento de estas muestras con NaOH 500 l 1 M, con el fin de inducir la reticulación, y enjuague con 10 ml de agua ultrapura. </li></ol> 4. Prueba de la estabilidad de fotoacústica Conversión Nota: La estabilidad de la conversión PA se investigó por medio de experimentos de PA con la configuración de fabricación casera que se describe en la referencia 6. <ol><li> Suspender una película de quitosano que contiene los macrófagos en agua DI, por ejemplo por el uso de un soporte de plástico sumergida en una placa de Petri, a fin de mantener una distancia de ~ 5 mm desde la parte inferior de la placa. Ponga esta placa en una etapa XY micrométricocon el fin de controlar la posición de la muestra. </li><li> Enfocar un haz láser con ~ 5 duración nseg pulso en resonancia con la banda plasmónica longitudinal de los nanorods de oro (por ejemplo, a partir de un oscilador paramétrico óptico bombeado por el tercer armónico de un Q-switched Nd: YAG con la gama de longitud de onda de 400 - 2500 nm y duración del pulso de 5 nseg) perpendicular a la superficie de la película con un diámetro de punto ~ 300 micras. <ol><li> Colocar un atenuador en frente de la salida de láser para sintonizar la fluencia del láser y el uso de un divisor de haz para enfocar parte del haz de láser a un contador de energía (por ejemplo, un detector piroeléctrico) y controlar las fluctuaciones de fluencia. Mantener la fluencia óptica por debajo de ~ 1 mJ / cm 2 por impulso durante la alineación. Utilizar gafas de seguridad del láser adecuada cada vez que el láser está encendido. </li></ol></li><li> Sumergir un transductor de ultrasonidos (rango de frecuencia de 1 - 20 MHz) en la placa de Petri ~ 2 mm fuera de la superficie de la película y ajustar su posición mediante el uso de traducciones micrométricasy las etapas de rotación para maximizar la señal emitida PA de la película. </li><li> Determinar una fluencia sonda F LO que no dañe la muestra 6: <ol><li> Irradiar un punto de la muestra aleatoria a una fluencia alrededor de 1 mJ / cm 2 por impulso durante por lo menos 500 pulsos. Para cada pulso, adquirir la señal PA correspondiente del transductor de ultrasonidos y fluencia del láser desde el contador de energía con un osciloscopio. Nombrar la fluencia de la media, como prueba F LO. </li><li> Calcular la intensidad de la señal de PA como su amplitud de pico a pico como una función del número de impulsos. Con el fin de contrapeso las fluctuaciones de intensidad de láser, normalizar la amplitud de cada señal de PA a la relación de su propia influencia a juicio F LO. Analizar la tendencia de la intensidad de PA normalizado como una función del número de impulsos y verificar su estabilidad en el tiempo. </li><li> En el caso de inestabilidad, repita los pasos 4.4.1 a 4.4.3 con un menor valor de F LO <sarriba&gt; juicio. En el caso de la estabilidad, repetirlas con un valor de ensayo F LO superior en ~ 10%, hasta una pérdida de estabilidad surge. Ajuste la sonda de fluencia F LO como el segundo valor más alto de la prueba F LO que garantice la estabilidad. </li></ol></li><li> Medir una fluencia de umbral de la remodelación: <ol><li> Elegir otro punto de la muestra aleatoria y la sonda una intensidad media PA (I LO a) a más de 500 pulsos a F LO. </li><li> Establecer una fluencia nominal superior F LO y entregar 50 pulsos. Nombrar a su fluencia promedio como F exc. </li><li> Sondear una intensidad media PA (I LO b) a más de 500 pulsos a F LO una vez más. Se calcula la relación R = I LO b / I LO a. Un valor de R inferior a la unidad da evidencia de un cambio irreversible de las propiedades ópticas de la muestra. </li><li> Usar la plataforma XY micrométrico para mover la película y cambiar el point de la muestra al azar. Repita los pasos 4.5.1 a 4.5.4 con diferentes valores de F exc, a fin de tener unos valores de R por debajo, alrededor y encima de la unidad. 15 puntos son razonables. </li><li> Parcela R como una función de F exc e identificar el umbral de remodelación de fluencia F TH como que el valor cuando R comienza a diferir de un más allá de incertidumbre estadística. 6 </li></ol></li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La idea de orientar los macrófagos asociados a tumores se está convirtiendo en un concepto de gran alcance para combatir el cáncer 34, 35, 36. Aquí, en lugar de su destrucción, estas células son reclutados como vehículos celulares para llevar nanobastones de oro en un tumor, por la explotación de su tropismo. Esta perspectiva requiere un cuidadoso diseño de las partículas, su integración en las células y su caracterización. Hemos encontrado que la fotoe...

Durante la última década, diversas partículas plasmónicas como nanorods oro, nanocápsulas y nano-cajas, han recibido una atención considerable para aplicaciones en óptica biomédica 1, 2, 3, 4. En desacuerdo con nanoesferas de oro estándar, estas partículas nuevas resuenan en la ventana de infrarrojo cercano (NIR), que proporciona para la penetración más profunda óptica a través del cuerpo y mayor contraste óptico sobre componentes endógenos 1. Esta característica ha despertado interés para aplicaciones innovadoras, tales como la formación de imagen fotoacústica (PA) y la ablación fototérmica de cáncer. Sin embargo, varias cuestiones restringen la penetración clínica de estas partículas. Por ejemplo, su activación óptica tiende a inducir su sobrecalentamiento y modificar sus formas funcionales hacia perfiles más esféricas, que impulsa un fotoinestabilidad 5, 6, 7, 8 </sup&gt;, 9. Otro tema que domina el debate científico es su liberación sistémica en los tumores. En particular, nanobastones oro combinan tamaños que son ideales para impregnar los tumores que muestran una mayor permeabilidad y retención y la facilidad de conjugación con sondas específicas de marcadores malignos. Por lo tanto, su preparación para una inyección directa en el torrente sanguíneo se percibe como un esquema viable 10, 11, 12, 13. Sin embargo, esta ruta sigue siendo problemática, con la mayoría de las partículas de quedar capturado por el sistema de fagocitos mononucleares 10, 11, 12. Además, otra preocupación es la estabilidad óptica y bioquímica de las partículas después de la circulación a través del cuerpo 14. Cuando las partículas pierden su estabilidad coloidal y agregada, sus características plasmónicas y la dinámica de transferencia de calor pueden sufrir de acoplamiento plasmónica 15, </shasta&gt; 16, 17 y 18 a través del sobrecalentamiento. Más recientemente, el concepto de explotar el tropismo de macrófagos asociados al tumor ha surgido como una alternativa inteligente 19, 20, 21. Estas células tienen una capacidad innata para detectar e impregnar los tumores con alta especificidad. Por lo tanto, un punto de vista puede ser para aislar estas células de un paciente, cargarlos con nanorods de oro en vitro y luego inyectar de nuevo en el paciente, con la intención de utilizarlos como vehículos celulares responsables de la entrega. Otra ventaja sería contar con un mayor control sobre la estabilidad óptica y la bioquímica de las partículas, debido a que su interfaz biológica sería construida in vitro. Aún así, las prestaciones de estos vehículos celulares como agentes de contraste ópticos necesitan un análisis crítico. En este trabajo se describe la preparación y temas críticos de Cellular vehículos que contienen nanorods de oro para la formación de imágenes de cáncer de PA. Nanorods oro PEGilados se modifican con compuestos de amonio cuaternario 22, a fin de lograr un perfil catiónico que se espera para promover su interacción con las membranas plasmáticas 23, 24. Estas partículas se someten a la absorción eficiente y no específica de la mayoría de tipos celulares, es de esperar sin interferir mucho con sus funciones biológicas. macrófagos murinos se cargan con hasta un máximo de 200, 000 nanobastones oro catiónicos por célula, que quedan confinadas dentro de las vesículas de endocitosis apretados. Esta configuración debe surgir la preocupación, debido a la amenaza de acoplamiento plasmónica y transversal sobrecalentamiento dentro de estas vesículas. Por lo tanto, los macrófagos se incrustan en hidrogeles biopoliméricos que imitan los tejidos biológicos, con el fin de verificar que la mayor parte de la estabilidad de la conversión de PA de las partículas se retiene en la transferencia del medio de crecimiento a las vesículas de endocitosis. effectivcriterios de medición electrónicos se elaboran con el fin de medir la estabilidad de conversión de PA en condiciones de interés inmediato para obtener imágenes de PA. Un umbral de remodelación se establece en el mismo inicio de la inestabilidad óptica después de un tren de pulsos de láser 50 con la tasa de repetición típico de 10 Hz. Estamos seguros de que estos resultados pueden proporcionar el impulso para el desarrollo de nuevas estrategias para suministrar partículas plasmónicas a los tumores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H6269</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gold(III) chloride trihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">520918</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silver nitrate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5960</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium borohydride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanoseeds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MeO-PEG-SH</td>
			<td style="width:104px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PEG1171</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320099</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8750</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">733305</td>
			<td style="width:321px;">To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">276855</td>
			<td style="width:321px;">To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;&#160;Polysorbate 20</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td style="width:321px;">To centrifuge PEGylated gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-516F</td>
			<td style="width:321px;">To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">J774a.1</td>
			<td style="width:104px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-67</td>
			<td style="width:321px;">Monocyte/macrophage murine cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-707F</td>
			<td style="width:321px;">Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE14-801F</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-605E</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:104px;">NEST</td>
			<td style="width:119px;">705001</td>
			<td style="width:321px;">Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:104px;">EuroClone</td>
			<td style="width:119px;">ES7018</td>
			<td style="width:321px;">To detach cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:104px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">47630</td>
			<td style="width:321px;">To fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chitosan, low molecular weight&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">448869</td>
			<td style="width:321px;">75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium hydroxyde</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">306576</td>
			<td style="width:321px;">To insolubilize chitosan and generate the hydrogel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polystyrene cell culture plates</td>
			<td style="width:104px;">NEST</td>
			<td style="width:119px;">702011</td>
			<td style="width:321px;">Used as molds to fabricate chitosan hydrogels</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:104px;">Continuum, Santa Clara, USA</td>
			<td style="width:119px;">&#160;Surelite OPO plus</td>
			<td style="width:321px;">Source of optical excitation for photoacoustic tests</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pyroelectric detector&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Gentec, Quebec, Canada</td>
			<td style="width:119px;">QE8SP</td>
			<td style="width:321px;">To monitor optical fluence for photoacoustic tests</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Pre amplified needle hydrophone</td>
			<td style="width:104px;">Precision Acoustic, Dorset, UK</td>
			<td style="width:119px;">Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range</td>
			<td style="width:321px;">To measure photoacoustic signals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and photoacoustic analysis of cellular vehicles containing gold nanorods

nanorods oro son atractivos para una variedad de aplicaciones biomédicas, tales como la ablación fototérmica y la formación de imagen fotoacústica de cáncer, gracias a su absorbancia óptica intensa en la ventana del infrarrojo cercano, baja citotoxicidad y el potencial para el hogar en los tumores. Sin embargo, su entrega a los tumores sigue siendo un problema. Un enfoque innovador consiste en la explotación de la tropismo de macrófagos asociados al tumor que se puede cargar con nanorods de oro en vitro. A continuación, se describe la preparación y la inspección de los vehículos fotoacústica celulares que contienen nanorods oro. nanorods oro PEGilados se modifican con compuestos de amonio cuaternario, con el fin de conseguir un perfil de catiónico. Tras contacto con los macrófagos de ratón en placas de Petri ordinarias, se encuentran estas partículas a someterse a la captación masiva en vesículas de endocitosis. A continuación, estas células se incrustan en hidrogeles biopoliméricos, que se utilizan para verificar que la estabilidad de la conversión fotoacústicade las partículas se retiene en su inclusión en los vehículos celulares. Estamos seguros de que estos resultados pueden proporcionar una nueva inspiración para el desarrollo de nuevas estrategias para suministrar partículas plasmónicas a los tumores.

En este caso, la viabilidad de los vehículos celulares que contienen nanorods de oro para la formación de imágenes de cáncer de PA se muestra junto con los resultados típicos del protocolo. Las imágenes TEM de la figura 1 muestran el aspecto habitual de las partículas después de la etapa 1 y sus vehículos celulares después de la etapa 2. La preparación de las partículas y de las células para obten...

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Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Análisis preparación y fotoacústica de Vehículos celulares que contienen oro Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K vistas.  Italian National Research Council. We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Preparación de las matrices de demanda para la cuantificación de la contracción celular

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Investigación

Bioingeniería

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Fabricación de micro-tejidos, utilizando los módulos de gel de colágeno las células que contienen

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

Preparación de las muestras, imágenes y análisis de protocolos para la microscopía de barrido filo de la navaja

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

La detección y aislamiento de las células de melanoma circulantes mediante Flujometría fotoacústica

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

La oftalmoscopia integrado fotoacústica y Spectral-tomografía de coherencia óptica de dominio

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Photoacoustic Cystography

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The risk of bladder cancers in children due to radiation exposure is more significant than many other cancers. Here we demonstrate the feasibility of nonionizing and noninvasive photoacoustic (PA) imaging of urinary bladders, referred to as photoacoustic cystography (PAC), using near-infrared (NIR) optical absorbents (i.e. methylene blue, plasmonic gold nanostructures, or single walled carbon nanotubes) as an optical-turbid tracer. We have successfully imaged a rat bladder filled with the optical absorbing agents using a dark-field confocal PAC system. After transurethral injection of the contrast agents, the rat's bladders were photoacoustically visualized by achieving significant PA signal enhancement. The accumulation was validated by spectroscopic PA imaging. Further, by using only a laser pulse energy of less than 1 mJ/cm2 (1/20 of the safety limit), our current imaging system could map the methylene-blue-filled-rat-bladder at the depth of beyond 1 cm in biological tissues in vivo. Both in vivo and ex vivo PA imaging results validate that the contrast agents were naturally excreted via urination. Thus, there is no concern regarding long-term toxic agent accumulation, which will facilitate clinical translation.

Photoacoustic cystography (PAC) has a great potential to map urinary bladders, a radiation sensitive internal organ in pediatric patients, without using any ionizing radiation or toxic contrast agent. Here we demonstrate the use of PAC for mapping urinary bladders with an injection of optical-opaque tracers in rats in vivo.

Cistografía fotoacústica

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Preparación y análisis de<em&gt; In Vitro</em&gt; Tres de mama Carcinoma de dimensiones Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

Fabricación y caracterización de tejido óptico fantasmas que contiene macroestructura

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Preparación, purificación y uso de liposomas que contienen ácidos grasos

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Análisis preparación y fotoacústica de Vehículos celulares que contienen oro Nanorods

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