The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.

Nota: El siguiente protocolo se diseñó para la purificación de un complejo de 4 l de cultivo de células, aproximadamente 40 g de peso húmedo de células. Una vez preparada, todos los tampones deben almacenarse a 4 ° C y utilizarse dentro de un mes de su preparación. Los inhibidores de la proteasa y de agentes reductores sólo se incorporan al tampones justo antes de su uso. 1. Preparación del extracto de células enteras para Tandem Purificación por Afinidad <ol><li> El crecimiento de S. Las células cerevisiae <ol><li> Pasar la derivación deseada etiquetada S. cerevisiae cepa de almacenamiento (-80 ° C) en una solución de dextrosa de levadura peptona (YPD) plato. Incubar durante 3 - 5 días (30 ° C), hasta que las células de levadura aparecen en blanco y esponjoso. </li><li> Inocular una racha de aproximadamente 2 mm 2 de las células frescas de la placa en 10 ml de medio YPD en un tubo de centrífuga de polipropileno cónico de 50 ml. Agitar el tubo a 180 revoluciones por min (rpm) durante la noche (30m ° C). </li><li> Inocular 2 ml de la máscultura noche por litro de medio YPD en un Erlenmeyer de 2 L o frasco cónico. Se agita a 180 rpm (30 ° C). Monitor de crecimiento celular a una densidad óptica de 600 nm (OD 600) hasta la fase logarítmica tardía, OD 600 de 1,8 a 2, típicamente 20 a 24 hr. </li></ol></li><li> La recolección S. Las células cerevisiae <ol><li> Cosecha células por centrifugación a 5.400 xg durante 15 min (4 ° C). </li><li> decantar rápidamente el sobrenadante y mantener las células a 4 ° C o en hielo. </li><li> Suspender cada litro de sedimento celular con 2 ml refrigerados tampón de lisis (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 300 mM; KCl 10 mM; 0,2 mM de EDTA, pH 8,0; imidazol 5 mM, pH 8,0; 10% de glicerol; 0,1% v NP-40 / v). Suspender las células agitando el recipiente y / o repetición de pipeteado utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Nota: La importancia de NP-40 en lo que respecta a la calidad del complejo y el análisis posterior a la purificación se discuten a continuación. </li><li> Transferir la suspensión de células en un vacío de 50 ml cónico de polipropileno tubo de centrífuga kEPT en el hielo. Lavar cada botella de centrífuga con un adicional de 2 ml de tampón de lisis enfriado y añadir a la suspensión de células en el tubo de 50 ml. </li><li> Determinar el peso húmedo de sedimento celular pesando el tubo y restando el peso del tubo vacío, así como el añadido tampón de lisis. Nota: Un litro de cultivo celular que tiene un OD 600 de 1,8 es de aproximadamente 10 g. </li><li> Crear un baño de nitrógeno líquido en un tubo de centrífuga cónico de polipropileno de 50 ml. Dibuje células suspendidas en una jeringa de 5 ml. Conectar una aguja 16 G a la jeringa. Congelación de la suspensión de células haciéndolo pasar a través de la jeringa / aguja para generar células &quot;gotas&quot;. Velocidad de congelación debe ser de aproximadamente 1 min / ml. </li><li> Almacenar las gotitas de células congeladas (-80 ° C) o proceder a la lisis. </li></ol></li><li> Las células de lisis y clarificación de lisado <ol><li> Lyse las células de levadura utilizando un molinillo de café. lisar células de ocho a nueve veces con 25 segundos de molienda ráfagas, mientras se agita la cmolinillo de offee. Antes de su uso, pre-enfriar el molinillo de café con nitrógeno líquido. Cada dos rondas de molienda, añaden una capa superficial de nitrógeno líquido para el molino y deje que se evapore. </li><li> Remover con una espátula de nitrógeno líquido refrigerado, según sea necesario para mantener las células se agrupen. Tenga precaución para evitar la descongelación de las células, lo que puede dar lugar a la formación de grumos de células. Las células deben aparecer como un polvo blanco fino después de la lisis. Un sedimento celular máximo de 4 L de cultivo de levadura (~ 40 g) se puede moler a la vez. Nota: Observaciones de método de lisis se discuten a continuación. </li><li> Evaluar el grado de lisis celular utilizando un hemocitómetro o método de recuento celular alternativo. Para proporcionar un análisis adecuado, tome las siguientes muestras: (1) antes de la lisis; (2) después de cuatro rondas de lisis; y (3) después de la lisis. Para comprobar estas muestras, tomar una pequeña cantidad de células con una espátula de nitrógeno líquido refrigerado y colocar en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Una vez que se descongelan las células, de pipeta 5 l de célulasy mezclar con 495 l de agua. Si el 40 - 60% se observó lisis de las células, continúe con el siguiente paso en el protocolo. Nota: Observaciones de efecto de largos períodos de lisis se discuten a continuación. </li><li> , almacenar células lisadas Una vez que se observa lisis adecuada (-80 ° C) o proceder al siguiente paso. </li><li> Preparar dos 50 ml tubos de centrífuga de polipropileno cónico de 15 ml cada uno con tampón de lisis, incluyendo 1 mM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF), ditiotreitol 1 mM (DTT), y un cóctel disponible en el mercado de los inhibidores de la proteasa. Nota: Si se observa la proteólisis significativa, considere el uso de una cepa deficiente en proteasa. </li><li> Use una espátula de nitrógeno líquido refrigerado para sacar el polvo de células lisadas congelada en los preparados tubos de 50 ml. Añadir el polvo de células / sólido de forma incremental al tampón de lisis, que contiene tanto un reductor y el inhibidor (s) proteasa. </li><li> Rotar los tubos de 50 ml suavemente a TA con el fin de descongelar / disuelva las células, sino también para evitar la formación de burbujas. UNEs el polvo celular / sólido se disuelve, añadir celular adicional sólido / polvo. </li><li> Llene cada uno de los dos tubos de 50 ml hasta que cada una tiene aproximadamente 20 g de células o todas las células añadidas. Continuar descongelación / disolución hasta que no haya grumos de células congeladas se observan en los tubos de 50 ml. Esto debe tomar aproximadamente 50 minutos. </li><li> Centrifugar el lisado de células en suspensión durante 20 minutos a 25.000 xg (4 ° C). células lisadas bien pueden exhibir una pequeña cantidad de precipitado negro. </li><li> La transferencia de los 50 ml de sobrenadante a tubos de policarbonato ultra-centrífuga (26,3 ml tubos utilizados) y añadir 10 l de PMSF 200 mM a cada tubo completo. </li><li> Centrifugar durante 1 hora a 100.000 xg (4 ° C). Cuatro capas deben ser visibles, de abajo hacia arriba: (1) un sedimento duro clara, que contiene complejos ribosómicos; (2) una pastilla suave rica en lípidos; (3) una gran capa de color amarillo teñido transparente que contiene la mayor parte de las proteínas y los complejos solubles de la célula; y (4) una &#39;escamas&#39; capa superior que consiste en lípidos. </li><li> Realizar todos los subsequent pasos en una habitación fría (4 ° C). Eliminar la mayor cantidad de la capa de lípidos top &#39;escamas&#39; como sea posible usando una pipeta de 1 ml y desechar. Utilice una pipeta serológica de 10 ml a recuperar la mayor parte de la capa amarilla, clara. </li><li> Recuperar los últimos ml de esta capa usando una pipeta de 1 ml para no molestar a las dos capas inferiores. De 40 g sedimento celular húmedo, aproximadamente 48 ml de la capa del medio es típicamente recuperados y 8 ml de capa lipídica eliminan / desechado. Nota: La purificación en columna de flujo se ve obstaculizado en gran medida por la presencia de lípidos, que también pueden reducir la calidad del complejo, se discute a continuación. </li></ol></li></ol> 2. Columna etapa de purificación 1: Cromatografía de IgG <ol><li> Resina de equilibrado y Encuadernación <ol><li> Preparar un 300 l IgG Sepharose suspensión de 40 g de sedimento celular. Cortar el extremo de una punta de pipeta 1 ml de facilitar pipeteando la suspensión. Wash / equilibrar la resina IgG tres veces, cada vez con 5 ml IgGD150 Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 150 mM; 1 mM MgCl 2; imidazol 5 mM, pH 8; 0,1% v / v de NP-40; DTT 1 mM; una tableta de inhibidor de la proteasa por 50 volumen ml). <ol><li> Centrifugado para sedimentar a 160 xg (4 ° C) entre los lavados y eliminar el sobrenadante. </li></ol></li><li> Girar la resina de IgG con el sobrenadante de fase media y dos tabletas de mini inhibidores de la proteasa por 40 g de células, utilizando un rotador apropiado, por 2 hr (4 ° C). Esta es la solución de proceso por lotes IgG. </li><li> Preparar dos 10 ml columnas poli-de preparación para el uso al cortar el extremo de la columna para producir un corte plano. Para acelerar el embalaje y el lavado de la columna por flujo de gravedad, cargar un máximo de 200 l de resina de IgG acondicionamiento o de ~ 25 ml de la solución de lote IgG por 10 ml de la columna. </li><li> Se vierte la solución de lotes de IgG en la columna y dejar sedimentar por gravedad. Si la sedimentación tarda más de 30 minutos, no era más probable la contaminación de lípidos cuando se recupera la fase media de la centrífuga tUBE. </li><li> Se lava la columna rellena con cuatro sucesivos volúmenes de 10 ml de Tampón IgGD150. </li></ol></li><li> La escisión en la columna TEV <ol><li> Sellar la parte inferior de la columna y se añade 1 ml de tampón de IgGD150 y 100 l de proteasa TEV (0,6 mg / ml de stock, la variante mutante S219V de TEV de producción propia). Sellar la parte superior de la columna y se mezcla durante 20 min (18 ° C) usando un mezclador térmico, agitando a 750 rpm. Resuspender resina y mezclar de nuevo durante 20 min, repita una vez más para un total de 1 h de incubación. Nota: Es muy importante para mantener el tiempo de incubación a un mínimo. </li><li> Volver la columna a 4 ° C y se eluye la proteína / complejo por la gravedad. Eluir el volumen muerto con un 200 l adicionales de tampón de IgGD150. </li></ol></li></ol> 3. La purificación en columna Paso 2: cromatografía de afinidad calmodulina <ol><li> Resina de equilibrado y Encuadernación <ol><li> Preparar 200 l de resina de afinidad de calmodulina por 40 g de célulasbolita. La resina se lava tres veces, cada vez con 5 ml de calmodulina tampón de unión (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; 1 mM MgCl 2; imidazol 5 mM, pH 8; 2 mM CaCl 2; 0.1 % v / v de NP-40; 10 mM β-mercaptoetanol), centrifugando a 160 xg (4 ° C) para sedimentar para cada lavado. </li><li> Para cada 1 ml de eluido IgG, añadir 3 volúmenes de tampón de unión de calmodulina. Para mantener constante el nivel de calcio, añadir CaCl2 y β-mercaptoetanol para dar cuenta de la falta de estos componentes en la elución de IgG. Las concentraciones finales deben ser 2 mM CaCl 2 y 10 mM β-mercaptoetanol. </li><li> Añadir la muestra a la resina de calmodulina y se unen para 1 hr (4 ° C) utilizando un rotador tubo. </li></ol></li><li> Embalaje y que eluye de la resina de calmodulina <ol><li> Preparar una columna de poli-prep 2 ml por 100 l de suspensión calmodulina cortando el extremo de la columna para crear una abertura plana. No cargue más de 100 l calmodulina suspensión por columna para reducir al mínimo la cantidad de resina de la muestra entra en contacto con durante la elución. </li><li> Paquete de la columna por gravedad y se lava la resina en la columna tres veces con 5 ml de calmodulina tampón de unión. </li><li> Eluir la proteína con la adición de 200 l calmodulina tampón de elución (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; 1 mM MgCl 2; imidazol 5 mM, pH 8,0; EGTA 4 mM, pH 8,0; 0,08% v / v NP-40; 10 mM β-mercaptoetanol). Repita seis veces la adición de 200 l de tampón de elución calmodulina. </li><li> Para eluciones 1 a 3, aplicar el volumen a la columna y recoger el eluido inmediatamente. Para la elución 4, sellar la parte inferior de la columna y se incuba con tampón de elución para 2,5 min y luego quitar el sello y permitir que para eluir por gravedad. Para la elución 5, incubar durante 5 min y luego quitar el sello y eluir. Para la elución 6, incubar durante 10 min y luego quitar el sello y eluir. Nota: La integridad del complejo puede variar entre eluciones / fracciones (ver sección de resultados representativos) &lt;./ Li&gt; <li> Dializar eluciones 2-6 individualmente durante la noche utilizando un método de diálisis micro apropiado. Se dializa contra las fracciones diálisis Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; 1 mM MgCl 2; imidazol 5 mM, pH 8; 10 mM β-mercaptoetanol). Nota: NP-40 no pasa sensiblemente, en todo caso, a través de la membrana de diálisis. </li></ol></li></ol> 4. Los análisis post-purificación para evaluar la calidad del Complejo <ol><li> Nativo del gel y tinción con plata <ol><li> Preparar un 4 - gel nativo prefabricado 16% para el análisis del complejo según las instrucciones del fabricante. Utilice un patrón de proteína de peso molecular adecuado y la carga de 15 l de cada uno de los calmodulina de elución / fracciones dializadas en el gel. </li><li> La electroforesis el gel a 150 V durante aproximadamente 3 hr (4 ° C). </li><li> La tinción con plata del gel para evaluar la calidad de cada uno de los seis eluciones. Como alternativa, el uso comercial igualmente sensiblesmancha fluorescente (s). En esta etapa, es más probable por debajo del nivel de detección de tinción con azul de Coomassie de la concentración del complejo. </li></ol></li><li> Métodos adicionales análisis en gel <ol><li> Para detectar la proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western, resolver el complejo mediante SDS o PAGE nativa y, a continuación sondear el gel para el epítopo de unión al péptido La calmodulina (CBP) utilizando un anticuerpo tag TAP según las instrucciones del fabricante. </li><li> El uso de una mancha fluorescente específico (s), confirmar la presencia y la integridad de la proteína y / o ácido nucleico en un complejo TAP purificado. Tenga cuidado de que no se detecta ningún solapamiento espectral entre estas manchas. </li></ol></li><li> La visualización de la mancha negativa Microscopía Electrónica <ol><li> Utilizar rejillas continuas de carbono-resplandor descarga a -15 mA durante 30 segundos, a los 30 minutos de aplicación compleja. </li><li> Aplicar 3 l de complejo TAP purificado (típicamente a una concentración de 1 nM) a la red. Se incuba durante un minuto. f blotesde el lado de la parrilla para eliminar el exceso de tampón. </li><li> Lavar dos veces con 20 gotas l de agua desionizada. blot lateral entre lavados. </li><li> Aplicar cuadrícula a un 50 l gota de tinción negativa y se incuba durante un minuto. Se recomienda la tinción con acetato de uranilo (2%) o formato de uranilo (0,75%). Precaución: sales de uranilo y soluciones son débilmente radiactivos y contienen metales pesados. Estos deben ser manejados con cuidado y todo el material que entra en contacto con el mismo deberán eliminarse siguiendo las directrices de residuos recomendados estas soluciones institucionales. </li><li> Aplicar rejilla a un nuevo máximo de 50 l gota de tinción negativa, sin goteo. Se incuba durante un minuto, y luego por transferencia lateral, y finalmente secarse al aire y visualizar. </li></ol></li><li> Cryo Microscopía Electrónica (crio-ME) Visualización <ol><li> Realizar la crio-EM complejo con TAP purificado, aunque la optimización puede ser necesario, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Nota: La presencia de detergente en altas concentraciones may obstaculizan los avances y se discute a continuación. </li></ol></li></ol> 5. Complejo de almacenamiento <ol><li> Preparación de Complejo de almacenamiento <ol><li> Se concentra el complejo, si es necesario, usando un filtro centrífugo que tiene un peso molecular de corte apropiado para el complejo. Girar a 14.000 xg durante 1 min incrementos hasta que se alcanza la concentración deseada. Nota: la concentración de NP-40 se incrementará en la concentración durante la concentración, ya que no pasa a través de la membrana de filtro ni de diálisis. </li><li> Flash congelar el complejo en 30 ml de alícuotas en nitrógeno líquido o hielo seco se enfrió baño de etanol y luego se almacena a -80 ° C. </li></ol></li><li> La eliminación opcional post-purificación de detergente </li></ol> Nota: La presencia de un detergente tal como NP-40 y a una concentración por encima de su concentración micelar crítica pueda obstaculizar o inhibir el progreso para algunas aplicaciones. Las consecuencias de su retirada de la protocol así como la sustitución con otros aditivos o co-disolventes se discuten a continuación. Si no se desea NP-40, una opción es utilizar una aplicación comercial para la eliminación de, por ejemplo, Bio-perlas. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pre-Equilibrar disponibles en el mercado de detergentes de absorción de los granos en la diálisis de amortiguamiento. Mezclar cinco perlas por 30 l de complejo (por lo general en una concentración de 10 nM). </li><li> Incubar cuentas equilibradas desde el paso 5.2.1 con el complejo purificado TAP durante 15 minutos en hielo. Utilice complejo dentro de unas pocas horas después de la eliminación de detergente. </li></ol>

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	<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes.">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).</li><li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+A+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+recombinant+proteins+fused+to+calmodulin+or+to+calmodulin-binding+peptides.">Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides.</a> Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).</li><li>Braisted, A. C., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+a+binding+domain+from+protein+A.">Minimizing a binding domain from protein A.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).</li><li>Nallamsetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+processing+of+fusion+proteins+by+tobacco+vein+mottling+virus+protease+in+vivo+and+in+vitro.">Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro.</a> Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).</li><li>Ghaemmaghami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Howson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction,+verification+and+experimental+use+of+two+epitope-tagged+collections+of+budding+yeast+strains.">Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains.</a> Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).</li><li>Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells.">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells.</a> Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).</li><li>Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+partners+of+acyl+carrier+protein+detected+in+Escherichia+coli+by+tandem+affinity+purification.">New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification.</a> FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).</li><li>Tharun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+analysis+of+the+decapping+activator+Lsm1p-7p-Pat1p+complex+from+yeast.">Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast.</a> Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).</li><li>Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+method:+an+efficient+system+for+protein+complex+purification+and+protein+interaction+identification.">The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification.</a> Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).</li><li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+to+Single-Particle+Cryo-Electron+Microscopy.">A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li><li>Gottschalk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+U1+snRNP+reveals+five+novel+proteins.">A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins.</a> RNA. 4 (4), 374-393 (1998).</li><li>Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+proteins+of+the+yeast+U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+by+mass+spectrometry.">Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).</li><li>Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+purification+of+a+stable+form+of+recombinant+tobacco+etch+virus+protease.">Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease.</a> Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El método TAP utiliza dos etiquetas que equilibren la necesidad de más rigurosa y selectiva la unión a una resina de afinidad con el deseo de mantener cerca de condiciones de solución fisiológica. Este equilibrio sirve para preservar la interacción estable (s) de la proteína de la etiqueta con el factor de interacción (s) para la caracterización posterior a la purificación. Además, TAP individuo etiquetada ORFs están disponibles de una fuente comercial, de modo que se puede obtener cualquier cepa de levadura...

Muchos de los principales procesos celulares se llevan a cabo por gran proteína y proteína-ARN complejos 1. Un cuello de botella significativo para la realización de estudios biofísicos y estructurales de tales complejos de ellos es la obtención de una calidad adecuada (es decir, homogeneidad) y a una concentración apropiada. El aislamiento de un complejo de una fuente nativa tiene muchas ventajas, incluyendo la retención de las modificaciones post-transcripcionales y / o traduccionales relevantes de subunidades y asegurar complejo montaje adecuado. Sin embargo, grandes complejos celulares están a menudo presentes en una célula en un bajo número de copias y la purificación deben ser altamente eficiente y producir en condiciones fisiológicas cerca para asegurar que se mantiene la integridad del complejo. La purificación de un complejo de una fuente eucariota es particularmente difícil y puede ser económicamente prohibitivo. Por lo tanto, es muy deseada estrategias o métodos que sean eficientes y producen un complejo homogéneo. Una estrategia que ha sidoéxito en la purificación de los complejos nativos de células eucariotas para su caracterización inicial es el tándem de purificación de afinidad (TAP) Método de 2,3. El método TAP fue ideado inicialmente para purificar una proteína nativa de la levadura en ciernes (S. cerevisiae) en el complejo con la interacción de los factores (s) 2. El método TAP utiliza dos etiquetas, cada etiqueta fusionado en tándem para la misma secuencia del gen codificante de la proteína. Las etiquetas fueron seleccionados a fin de equilibrar la necesidad de apretado y selectiva la unión a una resina de afinidad con un deseo de mantener cerca de las condiciones de solución fisiológica. Este equilibrio sirve para preservar la interacción estable (s) de la proteína de la etiqueta con el factor de interacción (s) para la caracterización posterior a la purificación. La etiqueta TAP genómicamente incorporada se coloca en el extremo (C-terminal) de un gen que codifica la proteína y consistía en una secuencia que codifica para un calmodulina de unión al péptido (CBP) seguido de proteína A - una adición de un poco más de 20 kDa a la etiquetado proteína. CBP es corta, 26 aminoácidos, y reconocidos por el ~ 17 kDa proteína calmodulina (CaM) en presencia de calcio con una K D del orden de 10 -9 M 4. La etiqueta de la proteína A es más grande, que consiste en dos repeticiones de 58 residuos con un enlazador corto entre las repeticiones. Cada repetición de 58 aminoácidos es reconocido por la inmunoglobulina G (IgG) con una K D ~ 10 -8 M 5. Entre estas dos etiquetas se incorporó un sitio de reconocimiento para la proteasa TEV, una endopeptidasa de la Virus del grabado del tabaco 6,7. Como se ilustra en la Figura 1, en ​​la primera etapa de afinidad del método de la TAP proteína marcada se une a una resina de IgG a través de la proteína A. La proteína marcada se eluye por escisión en la columna tras la adición de la proteasa TEV, específicamente en el sitio de escisión entre las dos etiquetas. Este es un paso necesario como la interacción de IgG y proteína A es muy fuerte y sólo puede ser perturbado adecuadamente bajo condiciones de solución de desnaturalización. A falta de un PrOtein Una etiqueta, la proteína se une a la resina de CaM en presencia de calcio y se eluyó de esta resina con adición de EGTA el quelante de iones metálicos (ácido etilen glicol) (Figura 1). Poco después de la introducción del método de TAP, que se utilizó en un estudio a gran escala para generar un &quot;mapa&quot; de las interacciones complejas en S. 8 cerevisiae. Es importante destacar que, como consecuencia de este esfuerzo una biblioteca entera del marco de levadura-TAP Tagged de lectura abierto (ORF), así como TAP individuo etiquetado ORFs 9 están disponibles de una fuente comercial. Por lo tanto, se puede obtener cualquier cepa de levadura con una proteína etiquetada para cualquier complejo de levadura. El método TAP también estimuló modificaciones o variaciones de la etiqueta TAP, incluyendo: su uso para la purificación de complejos de otros eucariotas, así como células bacterianas 10,11; el diseño de una &quot;etiqueta dividir&quot;, en el que la proteína A y CBP se colocan en diferentes proteínas de 12; y la tags cambiado, así como para dar cabida a la necesidad del investigador, tales como la sensibilidad del complejo de Ca 2+ o EGTA 13. Los recientes avances, tanto en instrumentación y metodología han dado lugar a avances significativos en la aplicación de la microscopía electrónica (EM) para la determinación de la estructura, que han conducido a alta, cerca de imágenes de resolución atómica de complejos macromoleculares 14. La resolución obtenible de un complejo por EM, sin embargo, sigue dependiendo de la calidad del complejo en estudio. En este estudio se ha utilizado la estrategia de etiquetas de TAP para purificar a partir de S. cerevisiae U1 snRNP, un joven de 18 subunidad (~ 0,8 MDA) bajo número de copias ribonucleoprotein complejo que forma parte de la spliceosome 15,16. Una serie de medidas se han adoptado para purificar este complejo tal que es homogéneo y de una concentración adecuada. Los problemas potenciales encontrados en diversas etapas de la purificación se describen y estrategias adoptadas para superar challEnges resaltados. Mediante la evaluación y optimización de las operaciones en la purificación cuidado, el U1 snRNP purificada es de una calidad y en cantidad adecuada para la tinción negativa y crio (crio-EM) los estudios de microscopía de electrones. Un protocolo TAP método optimizado para la purificación de complejos nativas para estudios estructurales se describe en este documento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae TAP tagged strain</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>YSC1177</td>
			<td>This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3&#916;1, leu2&#916;0, met15&#916;0, ura3&#916;0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coffee grinder</td>
			<td>Mr. Coffee</td>
			<td>IDS77</td>
			<td>Used for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer, Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3120</td>
			<td>Used to assess cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA 9.100 centrifuge rotor&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to harvest the yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA 20 fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to further clear the soluble cell extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>R5355</td>
			<td>Temperature controlled shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex gel system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0969-01</td>
			<td>Sepharose 6 fast flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin resin</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>214303</td>
			<td>Affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail, mini tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>589297</td>
			<td>Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail, large tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5892953</td>
			<td>cOmplete ultra EDTA-free tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolved in isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Bio-spin column</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>7326008</td>
			<td>Used to pack and wash the Calmodulin resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep column</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>7311550</td>
			<td>Used to pack and wash the IgG resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast native PAGE Bis-Tris gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>BN1002</td>
			<td>Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativeMark protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC0725</td>
			<td>Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 &#956;L for a silver stained gel and 5 &#956;L for a SYPRO Ruby stained gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDS PAGE Bis-Tris gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td>Unstained protein standard used for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS running buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>1x NuPAGE MOPS SDS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td>Primary antibody against CBP tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31341</td>
			<td>Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34042</td>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialaysis units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88401</td>
			<td>Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units, 100kDa MWCO</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC5100008</td>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent absorbing beads</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>1523920</td>
			<td>Bio-bead SM-2 absorbants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S-7564</td>
			<td>Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-12000</td>
			<td>Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>G400-CP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of native complexes for structural study using a tandem affinity tag method

enfoques de purificación por afinidad han tenido éxito en el aislamiento de los complejos nativos para la caracterización proteómica. La heterogeneidad estructural y un grado de heterogeneidad de composición de un complejo por lo general no impiden el progreso en la realización de dichos estudios. En contraste, un complejo destinado a la caracterización estructural debe ser purificado en un estado que es a la vez de composición y estructuralmente homogéneo, así como a una concentración mayor que la requerida para la proteómica. Recientemente, se han producido avances significativos en la aplicación de la microscopía de electrones para la determinación de la estructura de grandes complejos macromoleculares. Esto ha aumentado el interés en los enfoques para purificar complejos nativas de calidad y cantidad suficiente para la determinación estructural mediante microscopía electrónica. El método de purificación de afinidad en tándem (TAP) ha sido optimizado para extraer y purificar un joven de 18 subunidad, ~ 0,8 ensamblaje ribonucleoproteína MDA a partir de levadura en ciernes (Saccharomyces cerevisiae) </em&gt; adecuado para la tinción negativa y microscopía electrónica de crio. En este documento se detalla las modificaciones introducidas en el método TAP, la justificación para hacer estos cambios, y los enfoques adoptados para el ensayo de un complejo de composición homogénea y estructuralmente.

Un método TAP modificado se utiliza para purificar a partir de S. cerevisiae, el U1 snRNP, un complejo de ribonucleoproteína 18 de la subunidad. Una purificación TAP inicial del complejo después de la 2,3 protocolo publicado produjo un complejo que apareció heterogénea, migrando como tres bandas en un plata manchadas gel de poliacrilamida nativo (Figura 2A). Múltiples rondas de optimización del método de TAP, produjeron un complejo que migró...

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Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

purification-native-complexes-for-structural-study-using-tandem

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K vistas.  Brandeis University. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies. 

Video: Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purificación y visualización de la gripe A ribonucleoprotein complejos virales

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Investigación

Biología

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Aislamiento y purificación de Drosophila Clasificación de las neuronas periféricas por bolas magnéticas

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Azul nativos electroforesis en gel de poliacrilamida (BN-PAGE) para el análisis de los complejos Multiproteinas de lisados ​​celulares

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificación de proteínas ortogonales Facilitado por un marcador de afinidad biespecíficos pequeños

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimiento de purificación de afinidad de proteínas marcadas con recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-Su purificación: A dos pasos Affinity Protocolo Purificación Cediendo largos proteínas purificadas

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...