Name: flow cytometric analysis of natural killer cell lytic activity in human whole blood
Uploaded: 2017-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood at JoVE.com

This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.

NOTA: Todos los procedimientos de recolección de sangre se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por la Universidad Estatal de los Apalaches (ASU) Junta de Revisión Institucional (IRB). 1. Extracción de sangre entera <ol><li> Tiene un flebotomista certificado extraer la sangre según las directrices de la Organización Mundial de la Salud. </li><li> Extraer la sangre en un tubo de recogida de sangre de 4 ml que contenía ácido etilendiaminotetraacético Di-Potasio (K 2 EDTA). Invertir tubo de recogida de sangre de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mantenga el tubo de recogida de sangre a temperatura ambiente en un agitador de sobremesa hasta la separación. </li></ol> 2. Preparación de células diana marcadas con DiO <ol><li> Crecer células K562 en completa Modificado de Iscove medio de Dulbecco (IMDM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina estreptomicina durante varias semanas antes del ensayo para garantizar la salud de las células. Ajuste el concentration de las células a 3 x 10 5 células / ml diariamente a través de la realización de un recuento de células y la subsiguiente paso de las células. Realizar un cambio de medio completo cada 2 a 3 días. </li><li> En el día del ensayo, realizar un recuento de células usando un 1: 1 hemocitómetro. <ol><li> Retire 10 l del matraz K562 y ponerlo en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Añadir 10 l de colorante azul de tripano en el mismo tubo de 1,5 ml para un factor de dilución de 1: 1. </li><li> Agitar suavemente el tubo para mezclar las células K562 y colorante azul tripano. </li><li> Permitir K562 colorante azul de tripano de células en incubación durante 1 min a temperatura ambiente. </li><li> Retire 15 l de células K562 manchadas de tubo. </li><li> Pipeta sobre hemocitómetro para el recuento de células. </li><li> Recuento de células en las cuatro esquinas, así como el cuadrado del medio para un total de cinco plazas. </li><li> Calcular el recuento de células mediante el uso de la ecuación: células totales / mL = Total de contado X (factor de dilución / Número de plazas) X 10.000 células / ml </li></ol></li&gt; <li> Resuspender las células diana K562 a una densidad final de 1 x 10 6 células / ml en medio de cultivo IMDM libre de suero. </li><li> Para las células diana K562 no teñidas, añadir 10 ml de células diana K562 a un tubo de 15 ml a una densidad de 1 x 10 6 células / ml para un total de 10 x 10 6 células K562. Colocar en una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2 hasta que esté listo para su uso. </li><li> Para las células diana K562 DiO manchada, agregar 10 ml de células K562 se dirige a un tubo de 15 ml a una densidad de 1 x 10 6 células / ml para un total de 10 x 10 6 células K562. <ol><li> Añadir 1 l de DiO solución de etiquetado de células por ml de suspensión celular en 15 ml de tubo designado para la tinción DiO y suavemente vórtice. Por ejemplo, añadir 10 l de solución de etiquetado celular DiO a 10 x 10 6 células / ml K562 en un volumen de 1 x 10 6 células / ml. </li><li> Incubar solución K562-DiO durante 20 min a 37 ° C con 5% de CO 2 en un tubo de 15 ml. </li></ol></li><li> Seguiring incubación, añadir 3 ml de solución salina tamponada con fosfato temperatura ambiente (PBS) a la solución K562-DIO que contiene 15 ml tubo. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 135 xg a temperatura ambiente. </li><li> Retirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular con una pipeta de 1000 l de volumen ajustable. </li><li> Añadir 10 ml de IMDM fresco a la celda que contiene 15 ml tubo de pellets. </li><li> Suavemente el tubo de vórtice para resuspender las células. </li><li> Repita los pasos 2.7 a 2.10 dos veces más. </li><li> Almacenar células en una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2 hasta que esté listo para su uso. NOTA: Las células pueden ser almacenados en la incubadora durante hasta 24 h, pero es preferible usarlos en el mismo día. </li></ol> 3. Preparación de los controles <ol><li> Transferir el siguiente en tubos de 1,5 ml separadas y debidamente etiquetados: <ol><li> Añadir 500 l de IMDM fresco que contiene volvió a suspender dio-etiquetados células K562 en el &quot;doble positivo&quot; marcado tubo de 1,5 ml. </li><li> Añadir 500 l de IMDM fresco que contiene volvió a suspender las células K562 marcadas con DiO en el &quot;DiO única&quot; etiquetados tubo de 1,5 ml. </li><li> Añadir 500 l de IMDM fresco que contiene células K562 no marcados se volvieron a suspender en el &quot;yoduro de propidio (PI) sólo se&quot; etiquetan tubo de 1,5 ml. </li></ol></li><li> Ponga el cable positivo y doble chispa solamente tubos en un baño de agua a 55 ° C durante 5 min. </li><li> Una vez transcurrido el 5 minutos, retirar y limpiar los tubos con un 70% de etanol. </li><li> Añadir 10 l de PI a la doble positivo y PI sólo tubos de 1,5 mL. </li><li> Coloque los tres controles de células diana K562 en la incubadora a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Después de la incubación de 30 min ha transcurrido, de centrífuga de los tres controles de células diana K562 durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Retirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. </li><li> Resuspender cada control con 20 l de medio de cultivo fresco de células IMDM, y dejar en el incubador a 37ºC con 5% de CO 2 durante al menos30 min para la señal de DiO óptima. NOTA: Los controles son ahora listo para ser ejecutado a través del flujo de imágenes citómetro. </li></ol> 4. Separación de Células NK automatizada <ol><li> A su vez en el separador de células y permitir que el ciclo de arranque hasta el final. </li><li> Asegúrese de que todas las botellas de líquido iluminaciones son de color verde y que la botella de residuos está vacía. </li><li> Obtener una temperatura de 15 ml soporte de tubos de habitación. NOTA: La selección se basa en los volúmenes de muestra. Por ejemplo, para un volumen de menos de 3 ml utilizan un soporte de tubos de 15 ml y para un volumen de más de 3 ml utilizan un bastidor 50 ml tubo. </li><li> tubos de muestra de la etiqueta en consecuencia (por muestra Repetir / participante): Participante 1 muestra de sangre entera; Participante 1 fracción negativa; Participante 1 fracción positiva. </li><li> pipeta suavemente 1,5 ml de sangre total desde el paso 1.2 en tubo de 15 &quot;muestra de sangre&quot; ml. </li><li> Coloque debidamente etiquetado tubo de 15 ml &quot;muestra de sangre&quot; de Paso 4.5 y etiquetado 15 ml &quot;Fracción Negativo&quot; ytubos &quot;fracción positiva&quot; de Paso 4.4 en el bastidor de tubo. Utilice thefollowing muestra estante configuración: Fila (R1) A: muestra de sangre entera, Fila (R2) B: Negativo, la fracción no marcado, Fila (R4) C: Positivo, fracción y marcadas magnéticamente. </li><li> Introduzca la rejilla separadora sobre la MiniSampler para autolabeling. </li><li> Seleccione &quot;Reactivo&quot; en el menú y resaltar la posición donde se colocará el vial en el bastidor separador. </li><li> Seleccione &quot;Leer Reactivo&quot; para activar el lector de códigos 2D. </li><li> Colocar el vial reactivo apropiado delante del lector de códigos 2D entre 0,5-2,5 cm de la cubierta del lector de código. NOTA: Por ejemplo, el reactivo necesario para la separación de células NK es CD56. </li><li> Mantenga vial de reactivo en un ángulo delante del lector de código 2D de lectura óptima. </li><li> Colocar el vial de reactivo en la posición adecuada bastidor separador. </li><li> Poner de relieve las posiciones deseadas en la pestaña de separación en la pantalla. </li><li> En el submenú etiquetado, asignar una autolabeling programa. </li><li> Asignar las microperlas de separación de células CD56 Reactivo para acumular las posiciones 1, 2, 3, y 4. </li><li> Seleccione el programa de separación &quot;posselwb&quot;. </li><li> Seleccione el programa &quot;aclarado&quot; lavado. </li><li> Insertar un volumen de muestra de 1.500 l en el submenú &quot;Volumen&quot; con el teclado numérico. </li><li> Seleccionar la opción &quot;Enter&quot; en el teclado. </li><li> Seleccione &quot;Ejecutar&quot; para iniciar la separación de células. </li><li> Seleccione &quot;OK&quot; para confirmar que se dispone de suficiente memoria intermedia para el procesamiento de todas las muestras. </li></ol> 5. Recuento de Células NK Separación Después de la célula <ol><li> Inmediatamente después de la separación de células con el separador de células, recuperar la fracción positiva. Dejar a temperatura ambiente. Esta fracción contiene la población de células NK puro deseado. </li><li> Para cada muestra individual, realice un recuento de células usando un hemocitómetro acuerdo con el paso 2.2. <ol><li> Después de los cálculos, registrar el recuento de células. </li&gt; </ol></li></ol> 6. Ensayo de citotoxicidad Preparación de la muestra <ol><li> Preparar y etiquetar tubos de 1,5 mL de cada muestra / participante en consecuencia. </li><li> Pipeta proporción de células NK y células K562 labled-DiO deseada en cada tubo. NOTA: Por ejemplo, la relación deseada de las células diana K562 y células efectoras NK es de 1: 5. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 135 x g. </li><li> Retirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. </li><li> Resuspender NK-DiO etiquetados mezcla de células K562 en 500 l de medio de células NK sin la interleucina-2 (IL-2) y 2-mercaptoetanol (2-ME) (incompleto medios de cultivo de las células NK). NOTA: El medio de cultivo celular incompleta NK es esencial mínimo de Eagle Medium con bicarbonato de sodio, sin L-glutamina, ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos. </li><li> Añadir 5 l de PI a cada tubo. </li><li> Centrifugar durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Después de 2 h de incubación, centrifuge durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Retirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. </li><li> Resuspender las células en 25 l incompleta medios de cultivo de las células NK. </li></ol> 7. Preparación de espontánea ( &quot;S&quot;) Muestra <ol><li> Pipeta 500 l de células K562 marcadas con DiO (concentración de 1 x 10 6 células / ml) en 1,5 ml de tubo. </li><li> Añadir 10 l de PI a cada tubo. </li><li> tubo de centrifugación durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Después de 2 h de incubación, se centrifuga durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Retirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. </li><li> Resuspender las células en 25 l incompleta medios de cultivo celular alfa medio esencial mínimo (α-MEM). </li></ol> 8. Adquisición de Datos de Imagen con citómetro de flujo <ol><li> Pulse el botón verde dentro de la puerta principal de la formación de imágenes citómetro de flujo para encender el instrumento. </li><li> Encienda coll equipos asociados con la formación de imágenes citómetro de flujo. </li><li> Poner en marcha el flujo de imágenes citómetro de software. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Inicio&quot; para limpiar el sistema y preparar la línea de muestreo. </li><li> Una vez que el &quot;inicio&quot;, cierre la ventana &quot;calibraciones&quot;. </li><li> Asignar canales: en la parte superior izquierda, haga clic en cada canal con el fin de asignarlos. </li><li> En el lado derecho, haga clic en el botón gráfico de dispersión para crear diagramas de dispersión 4: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Crudo Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Crudo Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 y FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01. </li><li> Comenzar a analizar las muestras utilizando primero el control &quot;Doble positivo&quot;. <ol><li> Haga clic en &quot;Cargar&quot;. </li><li> Coloque el tubo de 1,5 ml con la muestra &quot;Doble positiva&quot; de los pasos 3.4 a 3.9 en el cargador de muestras. </li><li> Seleccione el objetivo de 40X en la pestaña &quot;aumento&quot;. </li><li> Encienda el 405 mW y642 láseres MW. </li><li> Activar el canal &quot;campo claro&quot;. </li><li> Haga clic en &quot;Seleccionar intensidad.&quot; </li><li> Sobre la base de la &quot;doble positivo&quot; muestra de control, determinar la intensidad deseada para el láser 405 mW por lo que el detector no está sobrecargado. Nota: Por ejemplo, la intensidad óptima para este experimento se fijó en 11 mW. </li></ol></li><li> Después de lograr la configuración deseada, la adquisición de datos. <ol><li> En la pestaña &quot;File Adquisición&quot;, introduzca el nombre de archivo en un texto personalizado. Seleccione una carpeta para guardar el archivo (s) de datos. </li><li> Introduce el número de células de adquirir junto a &quot;Suma&quot;. Normalmente, este número varía entre 1.000 a 10.000. </li><li> Haga clic en &quot;Adquirir&quot;. NOTA: Una vez que se adquiere el número deseado de células, el archivo de datos se guarda automáticamente en la carpeta seleccionada previamente. </li></ol></li><li> Una vez finalizada la adquisición, cargue la siguiente muestra de control - DiO único control. </strong&gt; <ol><li> Haga clic en &quot;Cargar&quot;. </li><li> Coloque el tubo de 1,5 ml con la &quot;única DiO&quot; muestra en el cargador de muestras. </li><li> Deje el objetivo de 40X en la pestaña &quot;aumento&quot; seleccionado. </li><li> Deje el láser de 405 mW encendido. </li><li> Deben apagar el láser de 642 mW y el canal &quot;campo claro&quot;. NOTA: Ahora que la configuración deseada se ha logrado, los datos pueden ser adquiridos. </li><li> En la pestaña &quot;File Adquisición&quot;, introduzca el nombre de archivo en un texto personalizado y seleccione una carpeta para guardar el archivo (s) de datos. Introduce el número de células de adquirir junto a &quot;Collect.&quot;. Normalmente este número es de 1.000. </li><li> Haga clic en &quot;Adquirir&quot;. NOTA: Una vez que se adquiere el número deseado de células en el archivo de datos se guarda automáticamente en la carpeta seleccionada previamente. </li></ol></li><li> Repita el paso 8.10 para el &quot;PI única&quot; muestra de control. Las muestras experimentales ya están listos para ser recogidos. </li><li> Manejar las remaining muestras experimentales, incluyendo los &quot;espontáneos de procedencia &#39;S&#39;&quot; de la siguiente manera: <ol><li> Deje el objetivo de 40X en la pestaña &quot;aumento&quot; seleccionado. </li><li> Encienda el 405 mW y 642 mW láseres. </li><li> Activar el canal &quot;campo claro&quot;. </li><li> Haga clic en &quot;Ajuste de intensidad.&quot; </li><li> En la pestaña &quot;File Adquisición&quot;, introduzca el nombre de archivo en un texto personalizado y seleccione una carpeta para guardar el archivo (s) de datos. Introduzca el nombre de archivo en un texto personalizado. </li><li> Introduce el número de células de adquirir junto a &quot;Suma&quot;. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Adquirir&quot;. NOTA: Una vez que se adquiere el número deseado de células en el archivo de datos se guarda automáticamente en la carpeta seleccionada previamente. </li></ol></li><li> Repita el paso 8.12 para todas las muestras experimentales. </li><li> Después se han recogido todos los datos y archivos experimentales, haga clic en el botón de &quot;apagado&quot; para esterilizar el sistema. </li></ol> 9. ImaginAnálisis de las muestras g citómetro de flujo <ol><li> Abrir el flujo de imágenes citómetro de aplicación de software de análisis. </li><li> En &quot;Archivo&quot;, abrir un archivo .RIF experimental. </li><li> Construir una nueva matriz usando los archivos .RIF un solo color (DIO-únicamente controlan y control PI-solamente, creado durante los pasos de 8.10 y 8.11) seleccionando la opción &quot;Crear una nueva matriz&quot; en la pestaña de Compensación en el flujo de imágenes citómetro de software. NOTA: El software le pedirá para la selección de los archivos de un solo color y unirlos para crear un archivo de la matriz (extensión de archivo .ctm), que ha de ser seleccionada para aplicar la compensación de canal. </li><li> Crear gráficos de puntos mediante el uso de la función &quot;bloques de construcción&quot; del software. <ol><li> Crear un punto de parcelas (BrightFieldGradient_RMS vs frecuencias) con puerta de las células enfocadas. Llamar a la puerta &quot;Focus&quot; (Figura 1A). </li><li> El uso de la puerta &quot;Focus&quot;, crear un gráfico de puntos de la zona de campo brillante vs Campo Claro Relación de aspecto ag<html> comieron las células singlete. Llamar a la puerta &quot;Single&quot; (Figura 1B). </li><li> El uso de la puerta &quot;individual&quot;, crear un gráfico de puntos de Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Utilice este diagrama para identificar y células doble positivas (objetivos, muertas) Puerta dio-positivo sólo las células (objetivos, viva) y PI-DIO (Figura 1C). NOTA: Todas las parcelas descritas en los pasos 9.4.1, 9.4.2, 9.4.3 y se pueden crear mediante el uso de la función &quot;bloques de construcción&quot; del software. </li></ol></li><li> Haga clic en la función de las estadísticas del gráfico de puntos para acceder a los números de células de cada puerta. </li><li> Calcular el porcentaje de objetivos muertos en la muestra espontánea y las muestras experimentales utilizando la siguiente fórmula: % blancos muertos en la muestra = (objetivos #DEAD x 100) / (# viven Objetivos + #DEAD objetivos) </li><li> Calcular la citotoxicidad utilizando la siguiente fórmula: % De citotoxicidad = [(Experimental-muertos muertos espontánea) / (100-muertos espontánea)] x100 </li></ol>_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54779/54779fig1.jpg" /> Figura 1: histogramas, gráficos de dispersión representativos e imágenes para el análisis de la actividad citotóxica. Análisis (A) de células de enfoque. (B) Análisis de una sola célula. Análisis (C) la tinción de células objetivo. Todas las determinaciones se realizan con la imagen adjunta a cada evento. Esto se puede acceder en el software de análisis simplemente haciendo clic en el evento en los gráficos. (D) la imagen representativa de un evento doblete, mostrando una célula apoptótica NK y un objetivo K562 vivo. CH01, campo claro. CH02, Dio. CH05, PI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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The authors have nothing to disclose.

El método descrito en este estudio mide directamente la actividad específica de las células NK de un individuo en respuesta a estímulos (en este caso particular, el ejercicio prolongado). Típicamente, las células NK están aisladas de la propia sangre usando gradientes de densidad o clasificación de células mediante el uso de una combinación de marcadores. Aunque se utilizan ampliamente estos métodos, que tienen muchos inconvenientes: son mucho tiempo, implican múltiples manipulaciones, y son en gran medida d...

Las células asesinas naturales son un elemento esencial del sistema inmune innato. Mientras que están muy regulados, que tienen la capacidad de reconocer y eliminar las células anormales a través del contacto de célula a célula y sin activación previa 1. Como tales, forman una línea rápida de defensa contra las infecciones. El ejercicio, especialmente intenso, se ha demostrado que deprimen de forma transitoria el sistema inmune 2, 3, 4, 5. Las células NK son particularmente propensos a este efecto 4, 6, 7, creando una ventana de aumento de la sensibilidad a la enfermedad. Por lo tanto, el estudio de las intervenciones antes, durante o después del ejercicio intenso, con el objetivo de reducir su impacto sobre la función de las células NK es de particular interés para el bienestar de los atletas después de los concursos. 8, en torno a 1% del compartimiento de glóbulos blancos; 2) Las células NK son muy sensibles al estrés y se basan en la exposición constante a las condiciones fisiológicas para seguir siendo viable y estable durante la experimentación; y 3) ensayos estándar para determinar la citotoxicidad de células NK, tales como gradientes de Ficoll 9 y liberan los ensayos 10, son poco fiables e inconsistente. La variabilidad inherente de las muestras de humanos sólo agravan estos problemas. muestras humanas frescas recogidas durante las intervenciones son bastante regulado y difíciles de conseguir, al menos en comparación con muestras de animales o líneas celulares inmortalizadas. Esto reduce las oportunidades para repetir los experimentos o añadir participantes a la cohorte del estudio para llegar a los umbrales estadísticos significativos. En conjunto, estas cuestiones apoyan la necesidad de un protocolo optimizado que permite for tanto de alto rendimiento y un análisis de alta fiabilidad de la actividad lítica de las células NK en muestras humanas. Hemos establecido un flujo de trabajo que acorta el tiempo necesario para identificar, aislar y células NK prueba de la sangre entera humana y reducir al mínimo la exposición a factores externos. El método optimiza el uso de dos instrumentos, un clasificador basado en magnética celular y un flujo de imágenes citómetro, y un, T optimizado ensayo específico: relación E para permitir la detección de las disminuciones o incrementos de la citotoxicidad de células NK.

<table><tbody><tr><td>K-562 lymphoblasts</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Media</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential medium</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td>Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution 0.4%</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td>Tissue culture grade</td></tr><tr><td>Propridium Iodide Staining Solution</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Vybranto DiO cell-labeling solution</td><td>Vybranto</td><td>V-22886</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Washing Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Whole Blood CD56 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-875</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedbeads</td><td>Amnis Corporation</td><td>400030</td><td></td></tr><tr><td>0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer)</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Clenz</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>70% Isopropanol (Debubbler)</td><td>EMD Millipore</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Sheath fluid)</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B (1X)</td><td>No calcium or magnesium</td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Version Mark II, September 2013</td></tr><tr><td>Ideas Application Software</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Version 6.1, July 2014</td></tr></tbody></table>

flow cytometric analysis of natural killer cell lytic activity in human whole blood

la citotoxicidad de células NK es una medida ampliamente utilizada para determinar el efecto de la intervención exterior en función de las células NK. Sin embargo, la precisión y reproducibilidad de este ensayo pueden considerarse inestable, ya sea debido a errores del usuario o debido a la sensibilidad de las células NK a la manipulación experimental. Para eliminar estos problemas, un flujo de trabajo que les reduce al mínimo fue establecido y se presenta aquí. Para ilustrar, se obtuvieron muestras de sangre, en diversos momentos, desde corredores (n = 4) que fueron sometidos a una intensa sesión de ejercicio. En primer lugar, las células NK se identifican de forma simultánea y aislados mediante el etiquetado CD56 y la clasificación basada en magnético, directamente de la sangre entera y de tan poco como un mililitro. Las células NK según se retiran de cualquier anticuerpo reactivo o de tapado. Se puede contar con el fin de establecer un recuento de células NK precisa por mililitro de sangre. En segundo lugar, las células NK según (efectores células o E) se pueden mezclar con 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) etiquetada células K562 (células diana o T) en un ensayo-óptima 1: 5 T: relación de E, y se analizó usando un citómetro de flujo de imágenes que permite la visualización de cada evento y la eliminación de cualquier falso positivo o falsos negativos (tales como dobletes o células efectoras). Este flujo de trabajo se puede completar en aproximadamente 4 h, y permite obtener resultados muy estables incluso cuando se trabaja con muestras humanas. Cuando esté disponible, los equipos de investigación pueden probar varias intervenciones experimentales en sujetos humanos, y comparar las mediciones a través de varios puntos de tiempo sin poner en peligro la integridad de los datos.

Determinación del número de células NK Se midió el efecto de la pesada que se ejecuta en el recuento de células NK en la sangre total, utilizando el protocolo de ejercicio descrito en la figura 2. Las muestras de sangre fueron extraídas antes del ejercicio, inmediatamente después del ejercicio, 1,5 horas después del ejercicio, y, finalmente, 24 y 48 h después de la extracción de sangre inicial. La concentración de las células NK por mililitro de sangre...

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Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

flow-cytometric-analysis-natural-killer-cell-lytic-activity-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K vistas.  North Carolina A&T State University, North Carolina Research Campus. This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Video: Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Preparación y uso de VIH-1 en células CD4 infectadas Primaria + T-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Investigación

Inmunología e Infección

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of Human Natural Killer Cell Events Driven by Fc&#947;RIIIa Engagement in the Presence of Therapeutic Antibodies

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and cytotoxicity, driven by Fc&#947;RIIIa (CD16) expressed on natural killer (NK) cells. These observations have led to research focusing on methods to increase Fc receptor-mediated events, which include removal of a fucose moiety found on the Fc portion of the antibody. Further studies have elucidated the mechanistic changes in signaling, cellular processes, and cytotoxic characteristics that increase ADCC activity with afucosylated antibodies. Additionally, other studies have shown the potential benefits of these antibodies in combination with small molecule inhibitors. These experiments demonstrated the molecular and cellular mechanisms underlying the benefits of using afucosylated antibodies in combination settings. Many of these observations were based on an artificial in vitro activation assay in which the Fc&#947;RIIIa on human NK cells was activated by therapeutic antibodies. This assay provided the flexibility to study downstream effector NK cell functions, such as cytokine production and degranulation. In addition, this assay has been used to interrogate signaling pathways and identify molecules that can be modulated or used as biomarkers. Finally, other therapeutic molecules (i.e., small molecule inhibitors) have been added to the system to provide insights into the combination of these therapeutics with therapeutic antibodies, which is essential in the current clinical space. This manuscript aims to provide a technical foundation for performing this artificial human NK cell activation assay. The protocol demonstrates key steps for cell activation as well as potential downstream applications that range from functional readouts to more mechanistic observations.

A protocol for studying Fc&#947;RIIIa-driven events by therapeutic antibodies in human natural killer cells is described here. This artificial stimulation platform permits the interrogation of downstream effector functions such as degranulation, chemokine/cytokine production, and signaling pathways mediated by the Fc&#947;RIIIa and Fc portions of antibodies involved in binding.

Evaluación de los eventos de células asesinas naturales humanas impulsados por la participación de FcγRIIIa en presencia de anticuerpos terapéuticos

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and ...

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to promote survival, cellular proliferation, production of cytokines such as interferon gamma (IFN&#947;) and/or cytotoxicity programs. NK cell activation by cytokine stimulation requires a substantial remodeling of metabolic pathways to support their bioenergetic and biosynthetic requirements. There is a large body of evidence that suggests that impaired NK cell metabolism is associated with a number of chronic diseases including obesity and cancer, which highlights the clinical importance of the availability of a method to determine NK cell metabolism. Here we describe the use of an extracellular flux analyzer, a platform that allows real-time measurements of glycolysis and mitochondrial oxygen consumption, as a tool to monitor changes in the energy metabolism of human NK cells. The method described here also allows for the monitoring of metabolic changes after stimulation of NK cells with cytokines such as IL-15, a system that is currently being investigated in a wide range of clinical trials.

In this paper, we describe a method to measure glycolysis and mitochondrial respiration in primary human Natural Killer (NK) cells isolated from peripheral blood, at rest or following IL15-induced activation. The protocol described could be easily extended to primary human NK cells activated by other cytokines or soluble stimuli.

Análisis del metabolismo celular natural humano

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Profiling of the Human Natural Killer Cell Receptor-Ligand Repertoire

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells is regulated by their expression of germline-encoded inhibitory and activating receptors. The engagement of these receptors by their cognate ligands on target cells determines whether the intercellular interaction will result in NK cell killing. This protocol details the design and optimization of two complementary mass cytometry (CyTOF) panels. One panel was designed to phenotype NK cells based on receptor expression. The other panel was designed to interrogate expression of known ligands for NK cell receptors on several immune cell subsets. Together, these two panels allow for the profiling of the human NK cell receptor-ligand repertoire. Furthermore, this protocol also details the process by which we stain samples for CyTOF. This process has been optimized for improved reproducibility and standardization. An advantage of CyTOF is its ability to measure over 40 markers in each panel, with minimal signal overlap, allowing researchers to capture the breadth of the NK cell receptor-ligand repertoire. Palladium barcoding also reduces inter-sample variation, as well as consumption of reagents, making it easier to stain samples with each panel in parallel. Limitations of this protocol include the relatively low throughput of CyTOF and the inability to recover cells after analysis. These panels were designed for the analysis of clinical samples from patients suffering from acute and chronic viral infections, including dengue virus, human immunodeficiency virus (HIV), and influenza. However, they can be utilized in any setting to investigate the human NK cell receptor-ligand repertoire. Importantly, these methods can be applied broadly to the design and execution of future CyTOF panels.

Here we design two complementary mass cytometry (CyTOF) panels and optimize a CyTOF staining protocol with the aim of profiling the natural killer cell receptor and ligand repertoire in the setting of viral infections.

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells ...

Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by clearing pathogen-infected, malignant, and stressed cells. The ability of NK cells to eradicate cancer cells makes them an important tool in the fight against cancer. Several new immune-based therapies are under investigation for cancer treatment which rely either on enhancing NK cell activity or increasing the sensitivity of cancer cells to NK cell-mediated eradication. However, to effectively develop these therapeutic approaches, cost-effective in vitro assays to monitor NK cell-mediated cytotoxicity and migration are also needed. Here, we present two in vitro protocols that can reliably and reproducibly monitor the effect of NK-cell cytotoxicity on cancer cells (or other target cells). These protocols are non-radioactivity-based, simple to set up, and can be scaled up for high-throughput screening. We also present a flow cytometry-based protocol to quantitatively monitor NK cell migration, which can also be scaled up for high-throughput screening. Collectively, these three protocols can be used to monitor key aspects of NK cell activity that are necessary for the cells&#39; ability to eradicate dysfunctional target cells.

Evasion of natural killer (NK) cell-mediated eradication by cancer cells is important for cancer initiation and progression. Here, we present two non-radioactivity-based protocols to evaluate NK cell-mediated cytotoxicity toward hepatic tumor cells. Additionally, a third protocol is presented to analyze NK cell migration.

Medición de la citotoxicidad y migración mediadas por células asesinas naturales en el contexto de las células tumorales hepáticas

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

Medicina

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Source: McBride, J. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54779">Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the lytic activity of natural killer cells against fluorescently-stained target cells. The method enables NK cell-induced cytotoxicity measurement by staining dead cells and using a flow cytometer to quantify live and dead target cells.

Ensayo de citotoxicidad mediada por células asesinas naturales Preparación de muestras para análisis de citometría de flujo

1.&#160;Preparation of Controls

	Transfer the following into separate and appropriately labeled 1.5 ml tubes:
	
		Add 500 &#181;L of fresh IMDM ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Cellular Immunodiagnostics

An In Vitro Assay for Evaluating Natural Killer Cell Cytotoxicity against Cancer Cells

Source: Baik, C. H., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58961">A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates performing a lactate dehydrogenase release assay to determine the cytotoxicity of natural killer (NK) cells against the target cancer cells. The assay quantifies the release of the cytoplasmic lactate dehydrogenase enzyme from cancer cells by measuring the absorbance of the red-colored product formed.

Un ensayo in vitro para evaluar la citotoxicidad de las células asesinas naturales contra las células cancerosas

1. Cytotoxicity Assay: Assay Protocol

	Use a round bottom, culture treated 96-well plate to set up the plate as suggested in Table 1. This table shows ...

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

Resumen

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