Los autores desean agradecer a Vertex Pharmaceuticals y al Premio a la Innovación en Investigación de la Fibrosis Quística por financiar a R. Quinn y al NIH / NIAID por la subvención 1 U01 AI124316-01, un enfoque de biología de sistemas para el tratamiento de patógenos resistentes a múltiples fármacos. También queremos agradecer al Departamento de Ingeniería Mecánica y Aeroespacial del curso de diseño superior de ingeniería mecánica de UCSD para facilitar la colaboración con los aspectos de ingeniería de este trabajo.

1. Preparación de existencias para el medio de esputo artificial <ol><li> Crear una solución de mucina al 5%. Añadir 1,0 g de mucina estomacal deshidratada de cerdo a 20 ml de agua desionizada. Autoclave la solución resultante. NOTA: La esterilización de la mucina destruirá su estructura inherente; Otros métodos para esterilizar la mucina en su forma seca incluyen esterilización UV e irradiación. Sin embargo, estos métodos no se han utilizado ampliamente para el sistema WinCF. </li><li> Añadir 2,2 g de KCl a 50 ml de agua desionizada y permitir la disolución. Añadir 5,0 g de NaCl a 50 ml de agua desionizada y permitir la disolución. Autoclave estas dos soluciones. </li><li> Añadir 100 mg de ADN de esperma de salmón a 10 ml de agua estéril desionizada. Calentar esta solución a unos 85 ° C en un baño de agua durante unas horas para asegurar la disolución. </li><li> Añadir 5,0 mg de ferritina a 5,0 ml de agua desionizada estéril. </li></ol> 2. Preparación del medio de esputo artificial <ol><li> CombinarLos siguientes componentes: 16 ml de solución madre de mucina, 2,0 ml de solución madre de KCl, 2,0 ml de solución madre de NaCl, 200 μl de emulsión de yema de huevo, 5,6 ml de solución madre de ADN, 120 μl de solución madre de ferritina, 5,78 ml de solución madre esencial Aminoácido, 5,78 ml de solución de aminoácidos no esenciales y 2,44 ml de agua estéril. <ol><li> Si aparecen pequeñas cantidades de sedimento, agite suavemente para mezclar. </li><li> Pipetee 5,0 mL de medio en ocho tubos de centrifugación estériles de 15 mL. NOTA: Las condiciones químicas de cada tubo pueden ser manipuladas como se desee. Por ejemplo, se pueden añadir soluciones tampón e indicadores de pH a cada tubo con el fin de comparar el comportamiento microbiano a distintos niveles de pH. Una demostración de esto se muestra en la sección de resultados representativos con 8 niveles de pH distintos, de 5,0 a 8,5 en 0,5 incrementos de pH. </li></ol></li><li> Una vez que las condiciones químicas de los medios se manipulan con éxito, congelar para su uso posterior. Los medios permanecerán establesZen a -20 ° C durante varios meses. Vórtice al descongelar. </li></ol> 3. Preparación de un recorrido de control de los tubos capilares <ol><li> En una biopsia estéril, llenar ocho tubos de microcentrífuga estériles con 250 μl de medio cada uno. </li><li> Adquiera ocho tubos de centrífuga más estériles de 15 ml, correspondiendo cada tubo a un tubo de microcentrífuga mencionado en el paso 3.1. <ol><li> Esterilizar una toalla de papel con solución de etanol al 70% y dejar secar. Una vez seco, lágrima la toalla en pedazos alrededor de cuatro pulgadas cuadradas cada uno, y arrugue cada pieza en el fondo de un tubo de centrífuga de 15 ml. Para tubos adicionales, rocíe y seque las toallas de papel adicionales según sea necesario. </li><li> Con un manojo de papel en la parte inferior de cada tubo de centrífuga, humedezca ligeramente cada capa de papel con aproximadamente 1,0 ml de agua estéril para crear un ambiente húmedo. </li></ol></li><li> Obtener tres tubos capilares de vidrio para cada tubo de microcentrífuga preparado en el paso 3.1 y un bloque de tubo capilar seala sealaNuevo Testamento. </li><li> Para cada tubo de microcentrífuga, llene tres tubos capilares con medios a unos 5 mm del marcador azul cerca de la parte superior del tubo. <ol><li> Llene con un extremo del tubo en el tubo de microcentrífuga e inclínelo hacia la orientación horizontal, permitiendo que la acción capilar guíe el medio dentro del tubo (ver Figura 1 ). </li><li> Detenga el relleno colocando suavemente un dedo enguantado sobre el extremo abierto del tubo y, a continuación, cierre el otro extremo del tubo presionándolo hacia abajo en el bloque de sellador. </li></ol></li><li></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig1.jpg" /> Figura 1: Ejemplo de gradiente de pH, tubo capilar de relleno con medio de esputo artificial. El medio se añade insertando un extremo del tubo en el líquido e inclinándolo para facilitar la acción capilar. La coloración media en este ejemplo se debe al indicador de pH añadido para ayudar al demonioLos cambios potenciales en la acidez después de la incubación. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="5"><li> Coloque cada conjunto de tres tubos capilares en tubos de centrífuga de 15 mL llenos de toallas de papel completamente humedecidas con agua estéril, con el lado sellado con masilla. Tape el tubo y la etiqueta. Estos tres tubos capilares son para la replicación de cada condición de control. </li><li> Cuando todos los tubos de centrífuga de 15 mL se llenen con sus tubos capilares designados, coloque los tubos en un soporte. Coloque la rejilla de manera que los tubos se incuban horizontalmente (para atrapar las burbujas de gas) (ver Figura 2 ). Incubar los tubos capilares en el interior de los tubos de centrífuga (que contienen los trozos de papel humedecidos) a 37 ° C durante 48 h. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig2.jpg" /> Figura 2: Ejemplo de Gradiente de pH, Tubos Capilares Listo para Incubación. Una vez que se han llenado y sellado tres tubos capilares, se colocan en un tubo de centrífuga con una toalla de papel húmeda en la parte inferior. Este tubo se tapa y se coloca en un estante. La rejilla debe estar orientada lateralmente durante la incubación, como se muestra en la imagen, de modo que se puede observar la producción de gas una vez que se ha completado la incubación. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 4. Imágenes de los tubos capilares de control después de la incubación <ol><li> Retire la rejilla de los tubos de centrífuga de la incubadora, asegurándose de mantener los tubos horizontales. Deslice cuidadosamente los tubos capilares de los tubos de centrífuga, manteniendo cada conjunto de tres separados de otros conjuntos. </li><li> Coloque los tubos capilares uno junto al otro sobre una caja de luz, todos alineados de modo que el contenido de los tubos sean visIluminado. Deje un hueco cada tres tubos para separar diferentes condiciones químicas. </li><li> Con los tubos alineados y la caja de luz encendida, fotografíe directamente desde arriba. (Ver Figura 3 ) </li></ol><img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig3.jpg" /> Figura 3: Ejemplo de gradiente de pH, ensayo de control, preincubación, no se añadió esputo. Medio de esputo artificial después de ser añadido a los tubos capilares en grupos de tres, aumentando el pH de izquierda a derecha. La combinación de indicadores añadidos al medio dan como resultado que los tubos más ácidos aparezcan más amarillos, mientras que los tubos menos ácidos se vuelven más morados. Los tubos están dispuestos horizontalmente y están iluminados desde abajo, fotografiados desde arriba. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="4"><li> Deshágase delControl de materiales en residuos biológicos peligrosos. </li></ol> 5. Inoculación de los tubos capilares WinCF con una muestra de esputo <ol><li> En una biofunción estéril, llenar ocho tubos de microcentrífuga estériles con 225 μl de medio cada uno. </li><li> Homogeneizar la muestra de esputo retirando y expulsando el esputo repetidamente con una jeringa de 3 ml (una jeringa de plástico sin la aguja). Haga esto hasta que el esputo sea de consistencia lisa. </li><li> Añadir 25 μl de esputo homogeneizado a cada tubo de microcentrífuga (dilución 1/10 en medio ASM) preparado en el paso 5.1. A continuación, vórtice los tubos durante 30 s para mezclar lo suficiente. </li><li> Añada el medio a los tubos capilares siguiendo el mismo procedimiento descrito en los pasos 3.2 a 3.5. </li></ol> 6. Imágenes de tubos capilares de muestra después de la incubación <ol><li> Después del tiempo de incubación de 48 h, retirar e imitar los tubos capilares siguiendo el mismo procedimiento que los pasos 4.1 a 4.3. </li><li> Si las burbujas están presentes en los tubos,de que las fotografías tomadas claramente representan la delimitación entre las burbujas y los medios de comunicación en los tubos. Si biopelícula está presente, asegúrese de que las fotografías pueden mostrar claramente su presencia también. </li></ol> 7. La eliminación de los medios de comunicación para aplicaciones posteriores <ol><li> Para facilitar el análisis de aguas abajo, eliminar los medios de comunicación de los tubos capilares después de formación de imágenes. Las aplicaciones potenciales incluyen el cultivo y el ADN / ARN secuenciación y perfilado metabolomic. Precaución: Los tubos capilares de vidrio llenas de agentes patógenos son un peligro biológico significativo, por lo tanto, estas medidas debe hacerse con mucho cuidado con el equipo específico. Si tubos capilares se rompen, disponer en un recipiente adecuado de riesgo biológico de objetos punzantes. </li><li> Utilice agujas extremos romos de calibre 25 y de 0,5 pulgadas de longitud para eliminar los medios de comunicación. Insertar la aguja de extremo romo en el extremo enchufado del tubo para romper el sello. </li><li> Después de romper el sello, gire el tubo capilar al revés y los medios de comunicación gotear desde la parte superior. yoSi el medio no se escurre fácilmente, use una pipeta con una punta de 200 μL y expulsar el medio del tubo presionando el émbolo de la pipeta cuando se inserta en el extremo del tubo capilar. Recoja el medio del tubo expulsado en un recipiente apropiado (tubo de centrífuga de 1,5 ml). NOTA: Para el análisis transcriptómico u otro análisis de ARN, los medios pueden ser expulsados ​​directamente a tampones estabilizadores de ARN. </li></ol> 8. El sistema WinCF FLUD NOTA: El sistema de dispositivo de carga de fluidos WinCF (FLUD) es un conjunto opcional de dispositivos complementarios diseñados para optimizar el rendimiento del sistema WinCF. El sistema WinCF FLUD se compone principalmente de materiales imprimibles en 3D. La fabricación impresa 3D permite el reemplazo rápido y fácil de los materiales para asegurar el tiempo de inactividad mínimo para los investigadores así como requisitos mínimos de la fabricación. Diseños, archivos stl, instrucciones de impresión en 3D y el manual WinCF FLUD están disponibles en el suplemento en líneaNuevo Testamento. <ol><li> Preparación de medios para la carga de tubos capilares <ol><li> En una biofundidad estéril, llenar ocho tubos de microcentrífuga estériles de 2 mL con 900 μl de medio cada uno. </li><li> Homogeneizar cualquier muestra de esputo retirando y expulsando el esputo repetidamente con una jeringa de 3 ml (una jeringa de plástico sin la aguja). Haga esto hasta que el esputo sea de consistencia lisa. </li><li> Añadir 100 μl de esputo homogeneizado a cada tubo de microcentrífuga (dilución 1/10 en medio) preparado en el paso 8.1.1. A continuación, vórtice los tubos durante 30 s para mezclar lo suficiente. </li><li> Introduzca los tubos de microcentrífuga llenos y abiertos en el soporte del tubo rotatorio orientado de modo que los tubos sean verticales. </li></ol></li><li> Colocación de tubos capilares <ol><li> Recuperar tres tubos capilares para cada tubo de microcentrífuga en el paso 8.1. </li><li> Introduzca tres tubos en el soporte de goma para que se alineen con los tubos de microcentrífuga en el otro extremo del aparato.Asegúrese de que los extremos marcados de los tubos estén afuera de los tubos de microcentrífuga. Coloque los tres orificios en la parte inferior de la cuna correctamente sobre los tres pernos en el soporte de la cuna. </li><li> Con los tubos capilares colocados que descansan en sus canales de guía en el aparato, coloque el tampón de goma sobre sus midsections con seguridad para evitar el cambio. (Ver Figura 4 ) </li></ol></li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig4.jpg" /> Figura 4: El sistema FLUD completamente cargado con tubos capilares asegurados por el caucho Tamp sobre su Midsections. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="3"><li> Carga de medios en los tubos capilares <ol><li> Con cuidado use una mano para agarrar el extremo del aparato donde están los tubos capilaresADED, y utilizar la otra mano para sostener el bastidor de los rotadores en el que se cargan los tubos de microcentrífuga. </li><li> Delicadamente girar el bastidor de microcentrífuga de modo que los tubos de microcentrífuga son casi horizontal y proceden a empujar lentamente la cremallera hacia los tubos capilares. (Ver Figura 5) </li><li> Cuando los extremos de los tubos capilares hacen contacto con los medios de comunicación en los tubos de microcentrífuga, garantizar que la acción capilar comienza inmediatamente el llenado de los tubos capilares. Para ajustar la tasa de relleno y el nivel de llenado, gire suavemente el aparato como un todo. Mientras hace esto, tenga cuidado de no derramar el material fuera de los tubos de microcentrífuga. (Ver Figura 6) </li><li> Cuando los tubos capilares se llenan a los niveles deseados, colocar el nivel de aparato sobre una superficie y cuidadosamente todavía tirar rápidamente el bastidor de tubos de microcentrífuga de los extremos de los tubos capilares para cesar el llenado. Los tubos de microcentrífuga ahora se pueden retraer todo el camino de vuelta a la posición vertical y se cerraron. </li><li> Sellar los extremos salientes de los tubos capilares pulsando un bloque sellante en cada conjunto por triplicado, sellando un conjunto a la vez hasta que todos los conjuntos están sellados. Para reducir el riesgo de contaminación, pulse una parte diferente del bloque sellante en cada conjunto por triplicado (Ver Figura 7). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig5.jpg" /> Figura 5: El Sistema Flud con medio Tubos desplegado en una orientación horizontal, listo para entrar en contacto con tubos capilares. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig6.jpg" /> Figura 6: El sistema de Flud con capilar tubos de carga con los medios de comunicación a través de la acción capilar. </strOng&gt; <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig7.jpg" /> Figura 7: Sellado de tubos capilares llenos en el sistema FLUD Un conjunto de triplicado a la vez usando un bloque de sellador. Este bloque sellante tenía plástico a lo largo de los bordes que se cortó para evitar el contacto con conjuntos triplicados vecinos durante el sellado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="4"><li> Incubación <ol><li> Retire el tapón de goma sobre las secciones del tubo y levante la base de goma del aparato principal. Esto debe tomar todos los tubos capilares con él. Ahora coloque la cuna y los tubos en el bastidor de imágenes. Esta raCk tiene tres talones que caben en la cuna, así como pequeños canales de guía para colocar los tubos en. </li><li> Coloque el bastidor de imágenes en su totalidad en la caja de incubación de plástico transparente. Sumerja pequeñas cantidades de toallas de papel estériles en agua estéril y colóquelas a lo largo de los dos lados más cortos de la caja para proporcionar humedad durante la incubación. (Ver Figura 8 ) </li><li> Cierre la caja completamente y colóquela en una incubadora a 37 ° C, asegurándose de mantener los tubos horizontales. Incubar durante 48 h. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig8.jpg" /> Figura 8: Tubos capilares en la cuna de goma transferida del sistema FLUD a un estante de imagen, que se ha colocado en una caja de incubación transparente junto a las toallas de papel húmedas para proporcionar humedad. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de</a>es figura. <ol start="5"><li> De imágenes y extracción <ol><li> Retire la rejilla de imágenes que sostiene los tubos de la caja de incubación y la puso en una caja de luz, iluminada desde abajo. Con ya los tubos en el bastidor de formación de imágenes, los conjuntos por triplicado estarán debidamente espaciados y dispuestos a imagen inmediatamente. </li><li> Enfoque la cámara en los tubos de tal manera que todos son visibles en el campo de visión y la luz de la caja de luz proporciona un contraste suficiente y visualización del color en los tintes de tubo. Fotografía directamente desde arriba. </li><li> Para extraer los contenidos de los tubos, retirar los tubos capilares de la goma base un conjunto de triplicados a la vez. levante suavemente los tubos hacia arriba y fuera de la cuna o deslice hacia fuera. </li><li> Para cada conjunto de triplicados, siga el procedimiento de extracción se detalla en los pasos 7.1 a 7.3. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

La composición microbiológica de un pulmón con CF contiene una gran variedad de organismos, pero las condiciones dentro del pulmón probablemente tienen una influencia significativa sobre qué tipos de microbios pueden sobrevivir y prosperar [ 13 , 15] . Los mecanismos específicos a través de los cuales estas condiciones cambian y los efectos exactos que tienen en el microbioma pulmonar son generalmente poco claros en la actualidad. En este método experime...

El método descrito en este manuscrito se llama el sistema WinCF 1. El objetivo general de WinCF es proporcionar un montaje experimental capaz de simular el ambiente de un bronquiolo de pulmón lleno de moco. Esto permitirá un sistema tratable para estudiar los patógenos microbianos de las enfermedades pulmonares con un fenotipo hipersecreción mucosa incluyendo la fibrosis quística (FQ), la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma y otros. El procedimiento fue diseñado específicamente para el estudio de CF, que se caracteriza por mutaciones que causan las secreciones pulmonares a convertirse espeso y difícil de limpiar, con el tiempo de llenado bronquiolos y otros pasos de pequeñas con mucosidad 2. Tales bloqueos en el pulmón inhiben el intercambio de gas, porque el aire inhalado ya no es capaz de alcanzar muchas alvéolos y también proporcionar un hábitat para la colonización bacteriana 3, 4. La incapacidad para prevenir el crecimiento microbiano en elExcesivo moco pulmonar eventualmente conduce al desarrollo de complejas infecciones crónicas de las vías respiratorias. Estas comunidades contienen una variedad de organismos, incluyendo virus, hongos y bacterias como Pseudomonas aeruginosa , que interactúan entre sí 5 , 6 , 7 , 8 . Se cree que la actividad del microbioma pulmonar de la FQ está implicada en brotes de síntomas llamados exacerbaciones pulmonares 1 , 9 , 10 , 11 . WinCF permite estudiar el comportamiento de la comunidad microbiana en torno a estas exacerbaciones y ahora se está expandiendo para actuar como un sistema experimental base para estudiar la ecología microbiana pulmonar. Tradicionalmente, las exacerbaciones se han estudiado a través del análisis directo de muestras tomadas del pulmón. Muchos factores de confusión hacen que el análisis directo de microbios bEl comportamiento en los pulmones desafiante, con el sistema WinCF, muchos de estos factores se eliminan y el comportamiento del microbioma pulmonar se puede estudiar más directamente, lo que permite un análisis más fino de la actividad bacteriana en un mucosidad taponada bronquiolos. El sistema WinCF proporciona un método para crecer y analizar las bacterias de una manera que imita eficazmente el ambiente pulmonar. Los métodos tradicionales para el cultivo de bacterias pulmonares a menudo implicaban el cultivo de muestras en placas de agar tradicionales. Estos métodos dejan las muestras abiertas al oxígeno atmosférico, dejando de lado las condiciones hipóxicas ya menudo anóxicas encontradas en los bronquiolos pulmonares taponados con moco 12 , 13 . El cultivo en agar bajo condiciones aeróbicas no es nada como el ambiente del pulmón de la FQ y puede inducir a error a los clínicos e investigadores sobre el comportamiento de los patógenos que tratan de tratar. Además, los nutrientes disponibles para las bacterias en placas de agarSon disímiles a los disponibles en el esputo real, que se explica en WinCF utilizando medios de esputo artificiales (ASM). Como se muestra por los cultivos de Pseudomonas en Sriramulu et al. 14 , ASM incluye un conjunto específico de componentes que imita los recursos disponibles para los microbios de esputo y también reproduce la consistencia física del esputo. Debido a que un pulmón enfermo tiene un microbioma específico, el estudio de tales microorganismos debería tener lugar idealmente en las condiciones específicas del pulmón también. El sistema WinCF permite un análisis rápido y una fácil manipulación de las condiciones experimentales para observar cambios microbianos similares a cómo ocurrirían en un bronquio pulmonar real. Esta técnica permite la inoculación de una miríada de tipos de muestras relacionadas incluyendo esputo, saliva, otras secreciones corporales y cultivos bacterianos puros o mixtos. La naturaleza de la configuración experimental permite la interpretación visual inmediata deel comportamiento de la comunidad microbiana y está diseñado para permitir una fácil aplicación aguas abajo de una multitud de procedimientos microbiológicos y ómicas. Tales estudios son importantes porque bacterianas cambios en la composición de la comunidad basados ​​en las condiciones fisicoquímicas de su entorno. Con WinCF las condiciones químicas de los medios de comunicación pueden ser manipulados para analizar los efectos sobre la actividad bacteriana. Por ejemplo, la acidez de los medios de comunicación puede ser alterada antes de la inoculación con una muestra. Después de la incubación, la actividad bacteriana en cada una de estas condiciones puede ser comparado directamente, y se pueden sacar conclusiones acerca de cómo las bacterias en las muestras de esputo se comportan en respuesta a la variación del pH. A continuación, describimos los procedimientos de aplicación del sistema de WinCF y ejemplos de cómo la química de los medios puede ser manipulado para estudiar los efectos sobre el microbioma de pulmón.

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	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Color-Coded Capillary Tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-260943</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cha-seal Tube Sealing Compound</td>
			<td style="width:93px;">Kimble-Chase</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mucin from porcine stomach</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M1778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ferritin, cationized from horse spleen</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified)</td>
			<td style="width:93px;">AppliChem Panreac</td>
			<td>A2159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:93px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM Amino Acids</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Egg Yolk Emulsion, 50%</td>
			<td style="width:93px;">Dalynn Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">VE30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P2157500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps</td>
			<td style="width:93px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps</td>
			<td style="width:93px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.0mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the wincf model - an inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections

Muchas enfermedades crónicas de las vías respiratorias resultan en el taponamiento de moco de las vías respiratorias. Los pulmones de un individuo con fibrosis quística son un caso ejemplar en el que sus bronquiolos taponados con moco crean un hábitat favorable para la colonización microbiana. Varios patógenos prosperan en este entorno interactuando entre sí y conduciendo muchos de los síntomas asociados con la enfermedad de los FQ. Como cualquier comunidad microbiana, las condiciones químicas de su hábitat tienen un impacto significativo en la estructura y dinámica de la comunidad. Por ejemplo, diferentes microorganismos prosperan en diferentes niveles de oxígeno u otras concentraciones de soluto. Esto también es cierto en el pulmón de la FQ, donde se cree que las concentraciones de oxígeno impulsan la fisiología y la estructura de la comunidad. Los métodos descritos aquí están diseñados para imitar el entorno pulmonar y producir patógenos de una manera más similar a la de la que causan la enfermedad. La manipulación del entorno químico de estos microbios se utiliza entonces para estudiar cómo el chemistry de infecciones pulmonares gobierna su ecología microbiana. El método, llamado el sistema WinCF, se basa en medio esputo artificial y tubos capilares estrechos destinados a proporcionar un gradiente de oxígeno similar a la que existe en los bronquiolos moco enchufado. La manipulación de las condiciones químicas, tales como el pH del medio del esputo o antibióticos presión, permite la visualización de las diferencias microbiológicos en estas muestras usando indicadores de color, en busca de la producción de gas o biofilm, o de la extracción y secuenciación de los contenidos de ácido nucleico de cada muestra.

crecimiento microbiológico a través de las diversas condiciones químicas inducidas dentro de las muestras varió dramáticamente en algunos casos y de manera más sutil en otros. Muchos cambios en la actividad fueron visual en la naturaleza, siendo fácilmente evidentes tan pronto como el período de incubación terminó. En el ejemplo de la manipulación del pH, las muestras de todo el espectro pH variaron en gran medida como se muestra por múltiples factores que se hicieron evident...

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The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

El moco enchufado vías respiratorias de la fibrosis quística (FQ) son un ambiente ideal para los patógenos microbianos para prosperar. El manuscrito describe un nuevo método para el estudio de la microbioma CF pulmón en un entorno que imita donde causan enfermedad y cómo alteraciones de condiciones químicas pueden conducir dinámica microbianas.

El modelo de WinCF - un microcosmos barato y tractable de un bronquio enchufado del moco para estudiar la microbiología de las infecciones pulmonares

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

the-wincf-model-an-inexpensive-tractable-microcosm-mucus-plugged

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9.0K vistas.  University of California, San Diego.  El moco enchufado vías respiratorias de la fibrosis quística (FQ) son un ambiente ideal para los patógenos microbianos para prosperar. El manuscrito describe un nuevo método para el estudio de la microbioma CF pulmón en un entorno que imita donde causan enfermedad y cómo alteraciones de condiciones químicas pueden conducir dinámica microbianas. 

Video: The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Las infecciones tratables con células de mamíferos Protozoarios cebados con bacterias

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Investigación

Inmunología e Infección

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Un modelo experimental para estudiar la tuberculosis-Malaria Coinfección sobre Transmisión Natural de Mycobacterium tuberculosis Y Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Humanizado modelo de ratón para el Estudio de Infecciones Bacterianas Targeting la microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Desarrollo de un modelo de colitis impulsado por el antígeno para el Estudio de la presentación de antígenos por células presentadoras de antígenos a las células T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

Metodología para el Estudio de la transferencia horizontal de genes en<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Llegado al lado de la luz: Vivo en monitoreo de Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecciones en las heridas crónicas en un diabético sin pelo modelo murino

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

Prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal, medición de función pulmonar y la fijación del pulmón para estudiar el impacto de la obesidad y metabolismo deteriorado de resultados pulmonares

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...