Los autores desean agradecer a todos los miembros del laboratorio Dumenil, particularmente Silke Silva para la lectura crítica del manuscrito. El departamento de cirugía del Hôpital Européen Georges-Pompidou (HEGP), Dr. David Maladry. Michael Hivelin y el Dr. Patrick Bruneval, Departamento de Patología en HEGP. El Bioterio del PARCC, dirigido por Elizabeth Huc. Este trabajo fue apoyado por las siguientes agencias de subvención Marie Curie IEF comunión no. 273223 (KM), ATIP-Avenir Beca de INSERM, subvención equipos CODDIM (Ile de France Región), FRM (Fondation pour la recherche médicale) subvención equipo, el Laboratorio IBEID del consorcio excelencia, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) subvención &quot; Insecto-en-flow &quot;. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, la decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.

1. Riesgos y Permisos <ol><li> Los comités de ética locales deben aprobar todos los protocolos de los animales. Este protocolo se realizó de conformidad con las directrices establecidas por la normativa francesa y europea para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Decrets 87-848, 2001-464, 2001-486 y 2001-131 y Directiva Europea 2010/63/UE) y aprobado por el comité de ética local Comité d&#39;Ethique en Materia de Expérimentation Animale, Université Paris Descartes, Paris, Francia. No: CEEA34.GD.002.11. </li><li> Para la piel humana, fue obtenido por escrito el consentimiento informado del paciente y se realiza todos los procedimientos de acuerdo con las directrices nacionales franceses y aprobado por el comité de ética local, Comité d&#39;Evaluación Ethique de l&#39;INSERM IRB 00003888 FWA 00005881, Paris, Francia Opinión: 11-048 . </li><li> N. meningitidis es un patógeno humano potencialmente dañino y todas las precauciones necesarias se deben tomar al manipular el organismo. Estas precauciones incluyen la vacunación y que trabaja bajo nivel de Bioseguridad 2 condiciones. </li></ol> 2. Injerto de Piel <ol><li> Recoger la piel humana tan cerca de injerto tiempo como sea posible. La mayor parte de la piel en este trabajo proviene de las operaciones de cirugía plástica que involucran el área abdominal. Otras fuentes, como pecho, piernas e incluso la cara se han utilizado con éxito. </li><li> Preparar la muestra de piel humana mediante la limpieza de la superficie de la piel con EtOH al 70% y acostado en posición horizontal sobre una superficie bien limpia, preferiblemente bajo una campana de flujo. </li><li> Cortar 200-400 micras rodajas de la parte superior de la piel usando un dermatoma con grosor preestablecido. </li><li> Compruebe las rebanadas de la piel para la integridad y cortarlas en 2 cm x 2 cm cuadrados, y echarlo en PBS (sin cationes divalentes) si el injerto de forma inmediata o bien a 4 ° C en DMEM con 10% de suero para el almacenamiento a corto plazo (3-12 hr ). </li><li> Anestesiar 6-8 semanas de edad ratones SCID.bg (aproximadamente 20 g) con ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) injected ip </li><li> Una vez que los ratones se anestesiaron, comprobar la respuesta al dolor mediante la realización de una pizca dedo del pie, un método uniforme para dar reflejo doloroso. Aplicar gel para ojos para evitar el secado de la córnea y rasura el lado izquierdo del animal detrás del hombro, donde se colocará el injerto. Mantenga caliente del ratón sobre una almohadilla de calor todo el procedimiento. </li><li> Después de preparar el ratón para la cirugía, limpie la zona afeitada con EtOH al 70%. </li><li> Aplicar anestésico local por vía tópica para el sitio del injerto (Tronothane) y preparar el sitio del injerto mediante la eliminación cuidadosamente la capa superficial de la piel del ratón con un par de tijeras curvas. Tenga cuidado de no perturbar la vasculatura subyacente. </li><li> Quite la piel en una zona un poco más pequeña que el área de la rebanada de la piel humana. </li><li> Retire piel rebanada de PBS (o DMEM) y colocar sobre lecho del injerto, lo que garantiza el lado de la epidermis hacia arriba. Pasos 2.8 a 2.10 se debe realizar lo antes posible, lo que garantiza el lecho del injerto no se seque. </li><li> Alinear una de las esquinaso el borde y fijar con adhesivo tisular. Colocar cuidadosamente el resto de la piel rebanada de lecho del injerto, la colocación de pequeñas cantidades de goma de tejido alrededor de los bordes. Siempre corte la piel humana a tamaño en lugar de hacer que el lecho del injerto más grande. </li><li> No tire de la piel demasiado ajustado sobre el lecho del injerto como la piel del ratón es muy flexible. </li><li> Asegúrese de que el injerto se fija con pegamento de tejido en cada esquina. </li><li> Limpie el área con una solución de yodo. </li><li> Aplicar una curita con el área cojín sobre el injerto. Asegúrese de que el curita es firme pero no apretado y que la respiración del animal no se ve afectada. </li><li> Fijar el curita con cinta vestidor. </li><li> Permita que el animal se recupere en una superficie caliente. </li><li> Una vez despierto, devolver el animal a su jaula. Los animales se alojan 2-3 por jaula. </li><li> Compruebe regularmente los ratones durante la recuperación para detectar signos de dolor o angustia. 10-14 días después del injerto, quitar la tirita, teniendo cuidado de no perturbar el injerto. En nuestra experiencia, el dolor postoperatorio es pequeñomal. Sin embargo los animales deben ser controlados cada día en particular, en los pocos días siguientes operaciones. Criterios para el dolor o angustia son los siguientes. <ul><li> La pérdida de peso con el 10% </li><li> La apariencia física, piel, posición jorobada, ojos </li><li> El aumento de las tasas de respiración o del corazón </li><li> Disminución o inusuales movimientos. </li><li> Aumento de la temperatura corporal </li><li> Paracetamol En caso de que se detectaron signos de dolor se administra por vía oral (300 mg / kg, cada 4 horas). Puntos finales Humane se cumplan estrictamente si el dolor persiste. </li></ul></li><li> Si el injerto se ve seca se aplica el aceite de bebé cada 2-3 días para mantener la piel flexible. </li><li> El injerto está listo para la experimentación 21 días después del injerto. </li></ol> 3. Infección <ol><li> El día antes de la infección, preparar cepa bacteriana mediante extensión en placas de agar GCB con los antibióticos apropiados. Crecer durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Preparación bacterias <ol&gt; <li> Bacterias y renovar la siembra en 5 ml de medio SFM endotelio humano con 10% de suero a un OD 600 de 0,05. </li><li> Incubar mientras se agita durante 2 horas en una incubadora (37 ° C en 5% de CO 2) con la tapa suelta, hasta una densidad bacteriana de aproximadamente OD 600 0,1. </li><li> Centrifugar las bacterias durante 3 min 15.000 rpm. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender en PBS y centrifugar de nuevo. </li><li> Repita el paso de lavado (2.2.4-2.2.5) dos veces. </li><li> Resuspender sedimento bacteriano en PBS. </li><li> Mida OD 600. </li><li> Hacer una cultura de cualquiera de OD 600 0,1 (10 8 UFC / ml), o OD 600 1,0 (10 9 UFC / ml). De esta concentración conocido, diluir a 10 7 UFC / ml. Trate de preparar las bacterias lo más cercano a tiempo de inyección como sea posible. </li></ol></li><li> Ratones <ol><li> Pesar ratones. </li><li> Anestesiar ratones con ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) inyectado ip </li><li> Una vez dormido, cdiablos que la respuesta del dolor está ausente por un dedo del pie-pinch, mantenga el ratón cálido con una almohadilla de calor y poner ungüento para los ojos a evitar que se sequen. </li><li> Dar cada ratón 8 mg de transferrina humana, se resuspendieron en solución salina o PBS, inyectó ip </li><li> Tomar una pequeña gota de sangre de la cola y se extendió sobre una placa de agar sangre para comprobar es estéril antes de la infección. </li><li> Inyectar 100 l 10 7 UFC / ml de cultivo bacteriano (10 6 CFU total) por vía intravenosa a través de la vena retro-orbital o la cola. Las mediciones de la CFU tomadas 5 min después de la inyección son consistentes independientemente del lugar de la inyección. </li><li> Después de unos pocos minutos, cortar el extremo de la cola y se extendió muestra de sangre en placas de agar con antibióticos apropiados con una dilución de 10 veces para establecer UFC sangre inmediatamente después de la infección. </li><li> Selle la cola con adhesivo tisular. </li><li> Después de la inyección, diluir el inóculo bacteriano y se extendió sobre placas de agar con antibióticos apropiados para establecer CFU. </li><li> Permitir a los ratonespara recuperar en una almohadilla de calor hasta que se levanten y se muevan </li><li> A las 6 horas después de la infección dibujar una pequeña cantidad de sangre de la cola, se diluye y la placa para establecer CFU a las 6 horas. </li><li> Incubar todas las placas de agar a 37 ° C en 5% de CO 2 durante la noche. </li></ol></li></ol> 4. Sacrificio <ol><li> En el momento elegido de la infección, anestesiar a los ratones con ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) inyectado ip </li><li> Una vez dormido, mantener caliente el ratón con una almohadilla de calor. </li><li> Cuando el reflejo del dolor se ha ido (toe-pinch), corte final de la cola y extraer la sangre. </li><li> Corre la sangre en placas de agar con antibióticos apropiados; dilución 1:10 5 l directa y 10 l para establecer CFU. </li><li> Sacrificar el ratón por dislocación cervical. </li><li> Después de sacrificar el ratón de acuerdo con todas las directrices institucionales y éticos relevantes, confirmar la muerte por la falta de ritmo de corazón. Haga una incisión en la línea media, cortar a través de la caja torácica, y hacer una incisión en el corat. </li><li> Recoge la mayor cantidad de sangre posible desde el corazón / cavidad torácica y colocar en un tubo estéril. </li><li> Eliminar órganos (por ejemplo, hígado, bazo, cerebro) en una placa de estéril. </li><li> Retire el injerto de piel y una sección de piel de ratón en la placa estéril. </li><li> Deseche el cuerpo del ratón. </li><li> Después de la sangre recogida se ha permitido para coagular durante 15 minutos, centrifugar que 15 min a 3000 rpm. </li><li> Extraer el plasma de la sangre y se almacena a -80 ° C para el análisis posterior, por ejemplo para la detección de citoquinas por los métodos basados ​​en ELISA o FACS. </li></ol> 5. Condes de órganos UFC <ol><li> Pesar homogeneizar tubos que contienen 500 l de uno PBS antes de la toma de muestras de biopsia. </li><li> Tomar 4 mm muestras de biopsia de cada tejido utilizando un punzón de biopsia estéril. </li><li> Coloque las biopsias en tubos de homogeneización previamente pesado que contienen 500 l de PBS. Homogeneizar las muestras de piel con 2 cuentas mm, utilice bolitas más pequeñas para otros órganos. </li><li> Coloque el resto de tproblemas en el 4% paraformaldehído (PFA) y se almacena a 4 ° C para microscopía (ver más abajo). </li><li> Pesar homogeneizar tubos que contienen las biopsias para determinar el peso de biopsia (para el cálculo posterior de tejido CFU / mg). </li><li> Homogeneizar las muestras. <ol><li> Homogeneizar el hígado, el bazo y el cerebro, a 6000 rpm durante 30 seg. </li><li> Homogeneizar las muestras de piel a 6.000 rpm durante 30 segundos y repita si es necesario. </li></ol></li><li> Spread diluciones de cada tubo homogeneizar en placas de agar y crecer durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2 para establecer recuentos de CFU de órganos. </li></ol> 6. Histología / inmunohistoquímica <ol><li> Fijación <ol><li> Corrija los tejidos en PFA al 4% durante la noche a 4 ° C. El paso de fijación puede ser más largo, si el almacenamiento durante períodos más largos colocar los tejidos en 0.25% PFA. </li><li> Enjuague los tejidos en PBS y luego se coloca en solución de sacarosa al 20% y volver a 4 ° C durante la noche o hasta que los tejidos se han hundido en la solución. </li><li> Lave los tejidos en PBS, cortado a la medida y el lugar en solución octubre (ya sea en un molde de tejido o se han adherido a una placa base). </li><li> Congelar rápidamente los tejidos en una placa de Petri que flota en nitrógeno líquido. </li><li> Después de la congelación, poner los tejidos en hielo seco antes de la transferencia a -80 ° C para su almacenamiento. </li></ol></li><li> Rebanar <ol><li> Quite los tejidos de -80 ° C y deje que se equilibre a -20 ° C en un criostato. </li><li> Tejidos Slice con un espesor de aproximadamente 10 a 15 micras y colocan en portaobjetos de microscopio recubiertos. </li><li> Tienda desliza a -20 ° C hasta que se necesite. </li></ol></li><li> La tinción <ol><li> Permitir a las diapositivas de la temperatura ambiente. </li><li> Dibuja alrededor de la rebanada en la diapositiva con un lápiz hidrofóbico. Espere 5-10 min. </li><li> Rehidratar / rebanada de lavado en PBS durante 5 min, repetir dos veces. </li><li> Permeabilizar rebanada en 0,1% de Triton en PBS durante 10 min. </li><li> Lave en PBS 2-3x durante 5 min. </li><li> Bloquear en PBS0,1% de Triton 1% de BSA durante entre 10-60 min dependiendo del anticuerpo o la mancha para ser utilizado. </li><li> Retire el amortiguador de bloqueo y añadir el anticuerpo primario diluido como se requiere en la memoria de secuencia. Incubar durante determinado tiempo. (A menudo 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C). </li><li> Lave en PBS 2-3x durante 5 min. </li><li> Aplicar el anticuerpo secundario diluido según sea apropiado en tampón Bock; DAPI se incluye típicamente en este paso. Incubar durante determinado tiempo, a menudo 1-2 horas la temperatura ambiente, en la oscuridad. </li><li> Lave en PBS 2-3x durante 5 min. </li><li> Monte en fade proteger los medios de montaje con una cubierta de vidrio y selle con barniz de uñas. </li><li> Imagen portaobjetos teñidos inmediatamente o se almacenan a 4 ° C. </li><li> Realice imágenes con una microscopía confocal fluorescente o configurado con filtros / láseres adecuados para fluoróforos utilizados. </li></ol></li><li> Histología <ol><li> Permitir a las diapositivas que se utilizarán para la histología a la temperatura ambiente. </li><li> Diapositivas de la mancha utilizando comoprotocolo de tinción hematoxilina tandard / eosina. <ol><li> Colocar los portaobjetos en parrilla corrediza. </li><li> Transferencia de rack con desliza entre las soluciones en el orden siguiente: </li><li> 2 segundos en agua corriente del grifo. </li><li> 3 min en solución de hematoxilina filtrada. </li><li> 10 segundos en agua corriente. </li><li> 10 segundos en agua destilada. </li><li> 10 segundos en etanol al 100%. </li><li> 2 seg en eosina filtrada. </li><li> 10 segundos en agua corriente. </li><li> 10 segundos en etanol 100% </li><li> 2 min en xileno x 3 (baño I, II, III). </li><li> Transferir inmediatamente y añadir unas gotas de pegamento de la fijación en cada portaobjetos, coloque la cubierta deslizante en la parte superior, eliminar las burbujas de aire, dejar secar durante un par de horas. </li><li> Imagen desliza bajo un microscopio de luz blanca estándar. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Davis, C. E., Arnold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+meningococcal+endotoxin+in+Meningococcal+purpura.">Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura.</a> J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).</li><li>Mairey, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier.">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J. Exp. Med. 203, 1939-1950 (2006).</li><li>Brandtzaeg, P., van Deuren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+pathogenesis+of+meningococcal+infections.">Classification and pathogenesis of meningococcal infections.</a> Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).</li><li>Guarner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+diagnosis+of+human+meningococcal+disease+using+immunohistochemical+and+PCR+assays.">Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays.</a> Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).</li><li>Hill, W. R., Kinney, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cutaneous+lesions+in+acute+meningococcemia;+a+clinical+and+pathologic+study.">The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study.</a> J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).</li><li>Capecchi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+NadA+is+a+new+invasin+which+promotes+bacterial+adhesion+to+and+penetration+into+human+epithelial+cells.">Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).</li><li>Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+pili+of+pathogenic+Neisseriae+elicit+cortical+plaque+formation+in+epithelial+cells.">Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).</li><li>Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesive+property+of+the+type+IV+pilus-associated+component+PilC1+of+pathogenic+Neisseria+is+supported+by+the+conformational+structure+of+the+N-terminal+part+of+the+molecule.">The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule.</a> Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).</li><li>Taha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+induces+the+expression+of+the+TNF-alpha+gene+in+endothelial+cells.">Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells.</a> Cytokine. 12, 21-25 (2000).</li><li>Kirchner, M., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PilC+adhesin+of+the+Neisseria+type+IV+pilus-binding+specificities+and+new+insights+into+the+nature+of+the+host+cell+receptor.">The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor.</a> Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).</li><li>Mikaty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress.">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, (2009).</li><li>Johansson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD46+in+meningococcal+disease.">CD46 in meningococcal disease.</a> Science. 301, 373-375 (2003).</li><li>Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD46-independent+binding+of+Neisserial+type+IV+pili+and+the+major+pilus+adhesin,+PilC,+to+human+epithelial+cells.">CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).</li><li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria.">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li><li>Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptors+for+transferrin+in+pathogenic+bacteria+are+specific+for+the+host's+protein.">Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host's protein.</a> Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).</li><li>Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+utilising+human+transferrin+to+study+protection+against+Neisseria+meningitidis+serogroup+B+induced+by+outer+membrane+vesicle+vaccination.">A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).</li><li>Zarantonelli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+human+transferrin+as+a+model+for+meningococcal+infection.">Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection.</a> Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).</li><li>Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Neisseria+meningitidis+to+dermal+vessels+leads+to+local+vascular+damage+and+purpura+in+a+humanized+mouse+model.">Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li><li>Murray, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cell-mediated+destruction+of+allogeneic+dermal+microvessels+in+a+severe+combined+immunodeficient+mouse.">Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).</li><li>Nassif, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+of+pilin+regulates+adhesion+of+Neisseria+meningitidis+to+human+epithelial+cells.">Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).</li><li>Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+meningococcus+genome+by+gene+disruption:+resistance+to+complement-mediated+lysis.">Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis.</a> Genome Res. 13, 391-398 (2003).</li><li>Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Plasmodium+falciparum-endothelium+interactions+in+human+microvasculature:+mimicry+of+leukocyte+recruitment.">Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment.</a> J. Exp. Med. 192, 1205-1211 (2000).</li></ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Los modelos animales son muy importantes para la investigación patogénesis bacteriana. Es imposible imitar completamente el medio ambiente in vivo en cultivo celular y se hace evidente que la interacción huésped-patógeno se ve influida por muchos factores dinámicos. La especificidad humana de algunos patógenos clínicamente importantes, como N. meningitidis, VIH, VHC, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes, y Salmonella typhi ha limitado el uso de modelos in vivo para estas infecciones. Sin embargo, a medida que empezamos a entender qué pasos infecciosos están implicados en la especificidad, se están desarrollando modelos humanizados. El protocolo descrito aquí es una demostración de este con la introducción de microvasos humanos en ratones, lo que permite extensa infección in vivo con N. meningitidis, lo que resulta en el daño vascular y en ocasiones el desarrollo de erupciones purpúricas. Utilizando este modelo,hemos sido capaces de definir que las propiedades adhesivas de la PTF están involucrados en la colonización vascular in vivo mediante el uso de mutantes bacterianos y que el daño vascular se reduce en la ausencia de adhesión 18. Anteriormente, que circulan productos bacterianos han sido implicados en este daño, pero nuestros resultados sugieren un papel decisivo para la adhesión local y la colonización vascular. Esto abre nuevas posibilidades para el desarrollo de los objetivos de tratamiento novedoso. Si la adherencia de las bacterias patógenas podría ser bloqueado farmacéuticamente posiblemente podría prevenir el desarrollo de lesiones dérmicas y dar lugar a mejores resultados para los sobrevivientes de meningococo en términos de necrosis tisular, desbridamiento y amputaciones. El trabajo también ha demostrado la complejidad de la infección y la participación de la respuesta inmune y la cascada de la coagulación. Se identificaron la señalización de citoquinas humana en el suero de los ratones infectados a pesar de la relativamente pequeña cantidad de endotelio humano presente 18.Esto indicó una respuesta significativa de citocinas, junto con la infiltración de ratón poblaciones de células inmunes en la zona. Los modelos animales pueden, por supuesto, nunca replicar completamente la enfermedad humana y todos los resultados obtenido de ellos debe ser considerado con esto en mente. Por ejemplo, en este modelo, la sangre y las células circulantes son de origen murino y no podemos descartar que puedan comportarse de manera diferente a las células humanas. Una ventaja de esto, sin embargo, como se demuestra en nuestra publicación reciente 18, es la capacidad de diferenciar de señalización de origen desde el endotelio humano de la de las células de ratón circulantes. El fondo inmunocomprometido de los ratones utilizados en este modelo también permitiría la transferencia alogénico de poblaciones de células inmunes humanas, la adición de un aspecto adicional &quot;humanización&quot;. Sin embargo, el fondo de los ratones inmunocomprometidos puede enmascarar un papel para las células NK, T o B, que están ausentes o defectuosas en este modelo. El relativamente short plazo (24 horas) que se utiliza en este modelo se refiere principalmente a la respuesta innata, sino por infecciones a largo plazo y el desarrollo de la inmunidad otras opciones puede necesitar ser exploradas. La piel es un sitio importante para la infección por N. meningitidis, pero que tiene una cantidad relativamente pequeña de los vasos humanos también significa que la extrapolación de los datos a una infección sistémica que afecta numerosos órganos es difícil. Si bien este modelo permite el estudio del desarrollo de la lesión cutánea, no se incluyen los pasos importantes de la infección meningocócica, como epitelial y hematoencefálica cruce. Se necesita más desarrollo de estos modelos humanizados para tratar estos otros aspectos de la infección. Sin embargo, este modelo ofrece un gran potencial para numerosos patógenos específicos humanos, en particular los dirigidos a los vasos sanguíneos.

Sepsis meningocócica es una infección de la sangre nacido con frecuencia mortal causada por la bacteria patógena Neisseria meningitidis. Pacientes sepsis meningocócica a menudo presentan una erupción petequial o purpúrico en la piel que ha sido previamente asociado con la destrucción vascular causada por bacterias circulantes y productos bacterianos 1. Las biopsias de piel de pacientes clínicos muestran bacterias asociadas con los microvasos, a menudo llenando los vasos 2. Además de la fuga de las bacterias, trombosis extensa, la coagulación, la congestión vascular y se ve en las regiones purpúricas 3-5. Este daño vascular puede dar lugar a una extensa necrosis de la piel y los tejidos circundantes, lo que resulta en el desbridamiento e incluso la amputación en los sobrevivientes de meningococo. La comprensión de cómo la infección que causa este daño vascular es importante optimizar las estrategias de prevención y tratamiento. La mayoría de las investigaciones sobre la sepsis meningocócica se ha realizado in vitro sobrelíneas celulares humanas, debido a la especificidad humana de N. meningitidis. Muchos aspectos de la infección se han estudiado in vitro incluyendo la adhesión bacteriana, la respuesta de la célula huésped, así como la respuesta de citoquinas 6-9. Tipo IV pili (PTF) ha sido implicado como el principal orgánulo adherencia para N. meningitidis tanto en células epiteliales y endoteliales 10. También se ha demostrado que la adhesión de N. meningitidis a las células huésped es el estrés de cizalla dependiente y, por tanto, se cree que está relacionada con las tasas de flujo de sangre en la microvasculatura 11. Esto sugiere que los esfuerzos dinámicos de las bacterias se enfrentan en vivo son esenciales para la patogénesis. Sin embargo, es muy difícil para modelar el microambiente de los vasos pequeños in vitro. El receptor de adhesión para Neisseria Tfp aún se desconoce y, por tanto, las estrategias de knock-in para lograr la adhesión bacteriana en un modelo animal no se puede plantear en este momento. CD46 se sugirió a ser el receptor de la PTF y el animales transgénicos fueron producidos para actuar como modelos de ratón. Sin embargo, la infección en estos animales no conduce a la extensa infección o a la erupción cutánea 12,13 desarrollo. Otros modelos animales que han sido descritas para el aspecto bacteriemia de infección por Neisseria tienen en cuenta la preferencia bacteriana para la transferrina humana como una fuente de hierro 14,15. Ya sea que se completa la transferrina humana o expresarlo de un transgén que se traduce en un aumento de la carga bacteriana en el torrente sanguíneo durante un periodo de tiempo prolongado, pero este modelo no muestra adhesión bacteriana o desarrollo erupción 16,17. En este protocolo, se describe un modelo de ratón humanizado en el que la piel humana, incluyendo la microvasculatura dérmica, es trasplantado en ratones inmunocomprometidos 18,19. Esto resulta en vasos humanos funcionales, perfundidos con la circulación del ratón. En combinación con la administración de suplementos de transferrina humana, este mOdel representa al menos dos de los aspectos específicos humanos de N. meningitidis, es decir, endotelio humana y transferrina humana, en un ambiente in vivo. N. meningitidis introdujo por vía intravenosa en este modelo se adhieren específicamente a la endotelio humano, la producción de una patología que es similar a lo que se informa en los pacientes clínicos, incluyendo el daño vascular y el desarrollo erupción purpúrico 18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">31885-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10010-056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ketamine 500</td>
			<td style="width:161px;">Virbac France&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">LOT N&#176;VAL4243</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylazine</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Bayer Healthcare</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">AMM N&#176; FR/8146715 2/1980</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">LOT N&#176; KPO809S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">(Rompun 2%)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:247px;">Optigel&#160;&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Europhta</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">Medicament autoris&#233; N&#176;3400933521134</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lacrigel&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tronothane</td>
			<td style="width:161px;">Lisa Pharma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:247px;">GC agar Base</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Conda</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">1106</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human endothelium SFM media</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11111</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:161px;">P A A</td>
			<td style="width:119px;">A15-101</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human transferrin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3309</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">UEA lectin - rhodamine</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">RL-1062</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Eosin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4009&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylene</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">534056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Equiptment Name</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sober Hand Dermatome</td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Animal housing</td>
			<td style="width:161px;">Innovive</td>
			<td style="width:119px;">M-BTM-C8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Biopsy punch (4 mm)</td>
			<td style="width:161px;">Dominic Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">30737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fast-Prep lysing matrix M tubes</td>
			<td style="width:161px;">MP Bio</td>
			<td style="width:119px;">116923050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer Green Beads</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358941001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vectashield mounting media</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vetbond</td>
			<td style="width:161px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1469SB</td>
			<td>Tissue Glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">OCT tissue tek</td>
			<td style="width:161px;">Sakura</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature

De Neisseria meningitidis provoca una sepsis grave, con frecuencia mortal cuando entra en el torrente sanguíneo humano. La infección produce una extensa daño de los vasos sanguíneos resulta en fuga vascular, el desarrollo de erupciones purpúricas y necrosis tisular eventual. El estudio de la patogénesis de esta infección se limitó previamente por la especificidad humana de las bacterias, lo que hace difícil en modelos in vivo. En este protocolo, se describe un modelo humanizado para esta infección en la que la piel humana, que contiene vasos sanguíneos dérmicos, se injerta en ratones inmunocomprometidos. Estos vasos se anastomosan con la circulación del ratón, manteniendo sus características humanas. Una vez introducido en este modelo, N. meningitidis se adhieren exclusivamente a los vasos humanos, lo que resulta en el daño vascular extensa, la inflamación y en algunos casos el desarrollo de la erupción purpúrico. Este protocolo describe los pasos del injerto, infección y evaluación de este modelo en el conteXT de N. infección meningitidis. La técnica se puede aplicar a numerosos patógenos humanos específicos que infectan el torrente sanguíneo.

UFC cuenta El N. cepa meningitidis utilizado en estos resultados representativos es N. meningitidis 8013 clon 12, un serogrupo C aislado clínico, expresando una clase I SB pilina, Opa - OPC -, PilC1 + / PilC2 + 20. La cepa había sido diseñado para expresar la proteína fluorescente verde (GFP) a partir de una inserción cromosómica 18. Formadoras de colonias bacterianas recuentos de unidades se establecen contando el número de colonias en las placas de agar y el cálculo de cualquiera de UFC / ml de sangre o de CFU / mg de tejido a partir de los volúmenes conocidos chapados. Los recuentos sanguíneos mostraron que 5 minutos después de la inyección iv de 10 6 bacterias CFU había un promedio de 1,5 x 10 5 UFC / ml que circula en la sangre (Figura 1A). Después de 6 horas, el recuento promedio de 4,8 x 10 4 UFC / ml. Por 24 horas los recuentos promedio fueron 2.4 x 10 4 UFC / ml, pero en este grupo de 10 ratones, 5 teníanno detectable bacterias circulantes, mientras que los otros 5 tenían relativamente altas cuentas (Figura 1A). Los recuentos de CFU tomadas de las muestras de piel muestran la mayoría de los ratones que tienen recuentos considerables en la piel humana, con un promedio de 2,1 x 10 4 CFU / mg de tejido a las 6 horas y 4,4 x 10 2 UFC / mg de tejido en 24 horas (Figura 1B) . Las muestras de piel de ratones contralateral no mostraron recuentos bacterianos a las 24 horas, y sólo un número muy bajo a las 6 horas, lo que demuestra la fuerte preferencia por N. meningitidis a los vasos humanos en la piel injertada (Figura 1B). En general los recuentos bacterianos fueron muy bajos para no detectable en los otros órganos incluidos en la muestra, aunque 2 animales que sí mostró recuentos de lo que puede atribuirse a la contaminación de la sangre, ya que correlacionan con alta circulando el número de bacterias (Figura 1C). El modelo también se puede utilizar para determinar el papel de los factores de virulencia in vivo, por ejemplo, la PI de tipo IVli. Cepas bacterianas con mutaciones definidas en el gen PILD 21, lo que resulta en una cepa carente de Tfp, así como el gen pilC1 8, que carece de la propuesta Tfp &#39;adhesina&#39; se introdujeron en el modelo. Estas mutaciones producen ninguna adhesión bacteriana en el injerto de piel humana, lo que confirma el papel crucial Tfp está jugando en la adhesión in vivo (Figura 1D). La inmunohistoquímica / Histología En estos experimentos se utilizó N. meningitidis cepas que expresan la proteína de fluorescencia verde (GFP) para permitir la detección fluorescente sin la necesidad para la tinción secundaria. Vasos Humanos se tiñeron utilizando un marcador de endotelio humano, ya sea CD31 (PECAM-1) o la lectina Ulex europaeus aglutinina (UEA) 18,22. El UEA fue conjugado con rodamina permitiendo la tinción de un solo paso (figuras 2A-C). Los núcleos celulares se pueden tiñened con DAPI para ayudar a identificar las estructuras de tejido (Figuras 2A-B). Histología se realizó utilizando una tinción de hematoxilina / eosina estándar. El borde de la epidermis / dermis de la piel era claramente identificable. La inflamación, la trombosis vascular y fugas se concentraron a las embarcaciones cerca de esta frontera de 24 horas después de la infección (Figura 2D). Trombosis fue visible en varios vasos dérmicos pequeños, a menudo acompañada por la congestión y la inflamación. La fuga de las células rojas de la sangre hacia los tejidos podría ser visto, lo que indica un amplio nivel de daño de los vasos. La histopatología de la piel injertada en ratones no infectados parecía normal, sin inflamación distinguibles 18. En aproximadamente 30% de las infecciones de la adhesión bacteriana en la piel conduce al desarrollo de la púrpura macroscópicamente detectable (Figuras 2E y 2F). <img alt="Figura 1" fo:content-width=<html> &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. UFC cuenta. (A) Bacterial UFC recuentos por ml de sangre a los 5 minutos, 6 horas y 24 horas después de la infección. (B) Bacterial CFU cuenta a partir de muestras de piel que comparan la piel humana (SA) y la piel del ratón (MS), tanto en 6 horas y 24 horas después de la infección. (C) Bacterial CFU cuenta de otros órganos tomadas 24 horas después de la infección. (D) La comparación de los recuentos de UFC de bacterias a partir de muestras de piel humana y de ratón tomadas a la infección 24 h después de los ratones infectados con el tipo salvaje de N. mancha meningitidis 2C43 (WT), una cepa con una mutación en el gen PILD (PILD) o una cepa con una mutación en el gen pilC1 (pilC1). Todos los gráficos se muestran como datos sin procesar con la mediana. La figura es una modificación de Melican et al. 18&quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> Figura 2. Microscopía. (A) Proyección de una pila confocal que muestra una microvasos humano teñido con lectina UEA (rojo) cerca de la dermis (d) de la epidermis (e) frontera. El recipiente está infectado con N. meningitidis (verde) 2 h después de la infección. (B) Una división óptica y una proyección rebanada (C) que muestra N. infección microcolonias meningitidis (verde) de una nave humana (UEA - rojo) dentro de una infección de la piel del injerto 2 h después. (D) Hematoxilina / Eosina tinción de injerto de piel humana infectada durante 24 horas con N. meningitidis. El epidérmico (e), dérmica (d) la frontera es claramente la trombosis y la congestión de microvess visible y extensaels (flechas) se ve en la dermis. La inflamación y algo de fuga vascular (punta de flecha) también pueden ser identificados. (E) injerto de piel humana antes de la infección. (F) El mismo injerto de piel después de la infección hr (E) 24 con N. meningitidis mostrando regiones purpúricas (flechas). Figuras 2B, 2D, 2E, 2F y sean modificados de Melican et al. 18 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature at JoVE.com

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis es un patógeno específico humana que infecta a los vasos sanguíneos. En este protocolo microvasos humanos se introducen en un ratón mediante el injerto de piel humana en ratones inmunodeprimidos. Las bacterias se adhieren ampliamente a los vasos humanos, dando lugar a daño vascular y el desarrollo de la erupción purpúrica típicamente observado en casos humanos.

Humanizado modelo de ratón para el Estudio de Infecciones Bacterianas Targeting la microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

humanized-mouse-model-to-study-bacterial-infections-targeting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K vistas.  Paris Cardiovascular Research Centre.  Neisseria meningitidis es un patógeno específico humana que infecta a los vasos sanguíneos. En este protocolo microvasos humanos se introducen en un ratón mediante el injerto de piel humana en ratones inmunodeprimidos. Las bacterias se adhieren ampliamente a los vasos humanos, dando lugar a daño vascular y el desarrollo de la erupción purpúrica típicamente observado en casos humanos. 

Video: Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Luciferasa utilizando a las infecciones bacterianas de la imagen en ratones

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Investigación

Inmunología e Infección

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Small animal models such as mice have been extensively used to study human disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of information gained from these studies, the unique characteristics of mouse immunity as well as the species specificity of viral diseases such as human immunodeficiency virus (HIV) infection led to the development of humanized mouse models. The earlier models involved the use of C. B 17 scid/scid mice and the transplantation of human fetal thymus and fetal liver termed thy/liv (SCID-hu) 1, 2 or the adoptive transfer of human peripheral blood leukocytes (SCID-huPBL) 3. Both models were mainly utilized for the study of HIV infection.
One of the main limitations of both of these models was the lack of stable reconstitution of human immune cells in the periphery to make them a more physiologically relevant model to study HIV disease. To this end, the BLT humanized mouse model was developed. BLT stands for bone marrow/liver/thymus. In this model, 6 to 8 week old NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) immunocompromised mice receive the thy/liv implant as in the SCID-hu mouse model only to be followed by a second human hematopoietic stem cell transplant 4. The advantage of this system is the full reconstitution of the human immune system in the periphery. This model has been used to study HIV infection and latency 5-8.
We have generated a modified version of this model in which we use genetically modified human hematopoietic stem cells (hHSC) to construct the thy/liv implant followed by injection of transduced autologous hHSC 7, 9. This approach results in the generation of genetically modified lineages. More importantly, we adapted this system to examine the potential of generating functional cytotoxic T cells (CTL) expressing a melanoma specific T cell receptor. Using this model we were able to assess the functionality of our transgenic CTL utilizing live positron emission tomography (PET) imaging to determine tumor regression (9).
The goal of this protocol is to describe the process of generating these transgenic mice and assessing in vivo efficacy using live PET imaging. As a note, since we use human tissues and lentiviral vectors, our facilities conform to CDC NIH guidelines for Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+). In addition, the NSG mice are severely immunocompromised thus, their housing and maintenance must conform to the highest health standards (<a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a>).

The generation and characterization of tumor specific T cells using humanized mice is described here. Human thymic tissue and genetically modified human hematopoietic stem cells are transplanted into immunocompromised mice. This results in the reconstitution of an engineered human immune system allowing for in vivo examination of anti-tumor immune responses.

Uso del ratón humanizado BLT como un modelo de células madre del tumor Terapia génica basada en

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

El insecto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como un modelo de infección poderosa para investigar la patogénesis bacteriana

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Un modelo experimental para estudiar la tuberculosis-Malaria Coinfección sobre Transmisión Natural de Mycobacterium tuberculosis Y Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Métodos para el estudio de lípidos Las alteraciones en neutrófilos y la posterior formación de los neutrófilos extracelular Trampas

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

El modelo de WinCF - un microcosmos barato y tractable de un bronquio enchufado del moco para estudiar la microbiología de las infecciones pulmonares

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...