Este trabajo fue apoyado por el MRC, UE FP7, ARUK, Wellcome Trust y Parkinson UK. También nos gustaría agradecer a la Sra. Johanna Buchler por su aportación de imágenes confocales y los miembros del laboratorio por su aportación constructiva en el manuscrito y la metodología de.

todos los experimentos con ratones y ratas fueron aprobados y llevó a cabo utilizando procedimientos Anexo 1 cubiertos bajo la ley de domicilio animales (procedimientos científicos) de 1986. La receta de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) se puede encontrar en la tabla 1.
 1. aguda Hippocampal rodaja preparación <ol><li>quitar el cerebro del ratón tan rápido como sea posible, con una espátula y afiladas tijeras para cortar el cráneo y se coloca en helada, oxigenada (95% O 2, 5% CO 2), alta sacarosa ACSF (~ 100 mL).</li>
	<li>Poner el cerebro de ratón en una caja Petri y quite el cerebelo y una pequeña sección de la corteza frontal con un bisturí antes de hemisecting hacia abajo de la línea media del cerebro.</li>
	<li>Colocar los dos hemisferios en la parte que era solo corte y pegue cada hemisferio en el escenario de un vibratome.</li>
	<li>Corte secciones de 200-300 μm de espesor de la región de información de interés. En el caso del hipocampo, se deben obtener aproximadamente 3 a 4 rebanadas por hemisferio.</li>
	<li>Con una pipeta Pasteur plástica, transferir las rebanadas a una cámara sumergida en oxigenada (95% O 2, 5% CO 2) ACSF. Mantener a 34 ° C durante 30 minutos 
	Nota: El tratamiento de las rebanadas con agentes farmacológicos activos, tales como proteínas recombinantes de Dkk1, puede realizarse en esta etapa mediante la adición de los agentes a la cámara slice.</li>
	<li>Retire las rebanadas de la cámara con un pincel, colocar en una placa de 24 pocillos y arreglar por 20 min a 1 h en paraformaldehído al 4% (sacarosa PFA)/4% a temperatura ambiente (RT). 
	PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico, usar protección adecuada.</li>
	<li>Lavar las rodajas de tres veces en 1 X PBS (10 min). 
	Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí por 1-2 días, como las rodajas se mantienen a 4 ° C en 1 X PBS.</li>
</ol> 2. Inmunofluorescencia para marcadores sinápticos Nota: las recetas de todos los búferes utilizados pueden encontrarse en la tabla 2.
<ol><li>Reemplazar el PBS con tampón de bloqueo/permeabilizing (tabla 2) en los pozos de la rebanada e incube a TA por 4-6 h.</li>
	<li>Diluir el anticuerpo policlonal conejillo de Indias contra vGlut1 en una dilución de 1:2,000 en buffer de bloqueo/permeabilización. 
	Nota: vGlut1 es un marcador pre sináptica excitatoria visualización terminal. Para la identificación de sinapsis excitatoria postsináptica, utiliza un anticuerpo policlonal contra el PSD-95 y diluido 1: 500 en la misma solución. Utilizar un volumen mínimo de 300 μL en cada pocillo. Para identificar la localización anatómica del hipocampo, utilizan un anticuerpo que también puede identificar la estructura neuronal, como MAP2 o tubulina. Trabajar la correcta concentración de los anticuerpos primarios para los marcadores sinápticos de elección (pre y postsinápticos) y diluido en buffer de bloqueo/permeabilizing fresco.</li>
	<li>Incubar las rebanadas en la solución de anticuerpo primario durante la noche (o por 1-2 días) a 4 ° C. Utilice una plataforma de agitación con el vigoroso movimiento.</li>
	<li>Lavar las rodajas de tres veces en PBS (10 min).</li>
	<li>Diluir los correspondientes anticuerpos secundarios 1: 500 en solución amortiguadora de bloqueo. Por ejemplo, cuando se utiliza el anticuerpo de conejillo de Indias vGlut1, aplicar un anticuerpo secundario que reconoce el componente de conejillo de Indias (p. ej., burro anti-guinea-pig) conjugado con un fluoróforo específico. Cuando se utiliza el anticuerpo de conejo PSD-95, aplique un anticuerpo secundario que reconoce el componente de conejo (por ejemplo, burro anti-conejo) conjugado con un fluoróforo específico diferentes.</li>
	<li>Incubar las láminas en esta solución durante 2-3 h a RT. Asegúrese que las rebanadas están protegidas de la luz, como los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz.</li>
	<li>Lavar las rodajas de tres veces en PBS (10 min).</li>
	<li>Cuidadosamente retire las rebanadas de la placa de 24 pozos con un pincel y colóquelos uniformemente en portaobjetos de vidrio etiquetadas. Añada una gota de medio de montaje encima de cada rebanada y luego colocar suavemente un cubreobjetos de vidrio encima de las rebanadas. Evitar la formación de burbujas de aire. Tenga cuidado de usar suficiente medio de montaje (300-400 μL), como una cantidad insuficiente puede llevar a secar rodajas de.</li>
	<li>Dejar secar por un mínimo de 1-2 días a temperatura ambiente y guardar las diapositivas de la luz.</li>
	<li>Guardar las diapositivas a 4 ° C en el corto plazo, pero para el almacenamiento a largo plazo, mantener a -20 ° C.</li>
</ol> 3. Análisis y adquisición de la imagen confocal <ol><li>proyección de imagen usando microscopía de láser confocal.
	<ol><li>Identificar la región del hipocampo al ser fotografiada (por ejemplo, el cornu ammonis 1 y 3 (CA1, CA3) o el giro dentado (DG)) por medio de un objetivo de 20 x o 10 x.</li>
		<li>Cambio a 40 x o x 63 objetivo de inmersión en aceite para asegurarse de que la anatomía de la rebanada intacta identificando neurites continuados y organizada estructura. Use un marcador neuronal, como la MAP2, como referencia ( figura 1A).</li>
		<li>Posteriormente, cambie una 60 x objetivo de inmersión en aceite (NA = ~1.3 - 1.4) y ajustar la configuración para cada canal para obtener óptima de la señal y el contraste. Ajustar la intensidad de cada láser para evitar la saturación de los píxeles mediante una opción de alto y bajo contraste. 
		Nota: Estos se dependen del microscopio utilizado, pero se refieren a la Tabla de materiales para la configuración de energía de láser utilizado en la figura 2, figura 3, y Figura 4. Para mejores resultados, utilice una resolución de 1024 x 1024 píxeles. La configuración debe permanecer constante a lo largo de las diferentes condiciones del experimento mismo. Puede aplicar zoom adicional si es necesario.</li>
		<li>Evaluar la profundidad donde la coloración es uniforme y adquirir pilas de imagen de por lo menos 8 equidistante (250 nm) planos. Luego tomar 3 pilas adyacentes imágenes representativas de la misma área de interés por rebanada. 
		Nota: La profundidad puede variar de un sector a otro, pero siempre debe ser aproximadamente 2-5 μm de la superficie de la rodaja.</li>
		<li>Repetir la adquisición de al menos 3 rebanadas por condición y de 6-8 animales por grupo de tratamiento.</li>
	</ol></li> <li>Análisis de imagen. 
	Nota: Utilice un software de análisis de imagen automatizado (véase la Tabla de materiales). Tenga en cuenta que algunos sistemas requieren una licencia, mientras que otros son gratis, como el ImageJ. El software utilizado debe analizar las imágenes en 3D, teniendo en cuenta todos los planos de la pila de imágenes. Consulte la Tabla de materiales para los detalles de los programas utilizados en el análisis de la imagen ( figura 1).
	<ol><li>Uso un protocolo de umbral de intensidad basado en el costumbre para identificar todos los puncta sináptica y marcadores neuronales, que son manualmente optimizados y seleccionados dentro del software [véase Tabla de materiales para el software específico utilizado en este Protocolo]. 
		Nota: El software identifica una intensidad mínima y máxima para cada fluoróforo y asocia un porcentaje de intensidad para cada objeto reconocido. Tenga en cuenta que el porcentaje de intensidad variará de acuerdo al fluoróforo que se utiliza y el anticuerpo contra el marcador sináptico.</li>
		<li>Para marcadores sinápticos, asegúrese de que tamaño filtros (&#62; 0.1µm 3 y &#60; 0.8µm 3) seleccionados dentro del software y aplicar a la imagen. Ajustar los parámetros para asegurar que los objetos seleccionados no se solapan. Para excluir cualquier objeto que es demasiado grande o demasiado pequeño para ser considerado puncta sináptica (ver figura 2B). 
		Nota: Una vez optimizado, los mismos valores de umbral luego son aplicados en todas las imágenes dentro de un experimento dado.</li>
		<li>Cuantificar el número, intensidad y volumen de puncta sináptica individual (pre- o postsináptica) utilizando los protocolos optimizados umbral seleccionados dentro del software. Normalizar el número de orificio para el volumen del campo imagen (más o menos 16.928 μm 3 en el sistema de aquí). Normalizar la intensidad sináptica puncta a la intensidad del marcador neuronal referencia. 
		Nota: Las sinapsis son definidas como la colocalización entre marcadores previos y postsinápticos. Una vez que los protocolos de umbral h orificio pre y postsinápticaAve sido establecido, el software debe identificar la co-localización de puncta sináptica como la superposición de 1 píxel o más en un solo plano. 
		Nota: Para el análisis estadístico, confirmar que todos los conjuntos de muestras de seguir la normalidad y homogeneidad de la varianza, según Lilliefords y pruebas de χ2, respectivamente. Mostrando una distribución normal y homogeneidad de la varianza de las muestras deben analizarse con pruebas paramétricas, como se describe a continuación. Por ejemplo, análisis de puncta sináptica excitatoria deben realizarse utilizando un ANOVA unidireccional con la replicación y el bloqueo. Cada experimento individual debe considerarse como un bloque; por lo general, existen tres experimentos independientes, cada uno con 1-3 ratones de cada Estado.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> figura 1: Análisis de puncta sináptica mediante el análisis de imagen software (A) captura de pantalla de la personalización de protocolo de intensidad umbral. El ejemplo es para PSD-95, en el cual el orificio seleccionado tienen un tamaño definido de &#62; 0.1 μm 3 y &#60; 0,8 μm 3 y objetos superpuestos al mínimo actual. Tenga en cuenta que la imagen que se muestra es para que un plano confocal permitir la mejor visualización de puncta sináptica y selección de parámetro exacto. (B) captura de pantalla del análisis de la salida desde el software (después de la selección del protocolo optimizado). Un ejemplo de medidas número crudo puncta sináptica basado en el volumen. Estos valores luego son exportados a un software de hoja de cálculo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> figura 2: control de calidad de la rebanada y parámetro de configuración de puncta sináptica. (A) imágenes representativas de confocal (objetivo 40 x) de la región de interés: la CA1 estrato radiatum (sr) y estrato oriens (tan) de un segmento hippocampal se identifican por la coloración de la MAP2. Barra de escala = 2 μm. (B) las imágenes confocales (60 x objetivo y un 1.3 adicional X aumento en el software de adquisición) de la CA1 estrato radiatum, con los marcadores-vGlut1 (verde) y PSD-95 (rojo)-de rebanadas hippocampal. Tenga en cuenta la identificación de los puncta claro pre y postsinápticos. Orificio mayor a 0.8 μm 3 quedan excluidos de la cuantificación (flechas blancas). Barra de escala = 2 μm (C) Confocal imágenes (60 x objetivo y un 1.3 adicional X aumento en el software de adquisición) de la CA1 estrato radiatum, con los marcadores-vGlut1 (verde)-de criostato de corte secciones hipocampales del cerebro entero fija en PFA. Tenga en cuenta la presencia de orificios grandes y coloración irregular, agrupada vGlut1. Barra de escala = 2 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La evaluación precisa del número de sinapsis es fundamental en el campo de la neurociencia. Aquí, mostramos cómo evaluar la densidad de sinapsis en la región CA1 estrato radiatum rebanadas hippocampal como sistema modelo. La importancia con respecto a los métodos existentes se demuestra en nuestro reciente artículo de investigación sobre el efecto de la deficiencia de Wnt en el hipocampo y donde también se evaluó el número de sinapsis por la solo-sección EM10. La magnitud de la pérdida de sinapsis son similares entre la solo-sección EM y la rebanada de cerebro método descrito aquí10. Por lo tanto, este hallazgo demuestra la exactitud y fiabilidad de la técnica.
Lo importante, una limitación de la solo-sección EM y sinapsis de inmunotinción, tal como se presenta aquí, es la incapacidad para estimar con precisión el número de sinapsis absoluta para una región específica del cerebro. De hecho, es importante identificar cualquier cambio morfológico global, como cambios en el volumen total podrían tener un impacto número sináptica. Otra limitación es que ciertos anticuerpos son menos eficientes en la coloración de las regiones del cerebro intacto, parcialmente debido a la extrema densidad de conexiones sinápticas. Experimentamos mayor calidad coloración de vGlut1 y gephyrin usando esta rodaja preparación y subsiguiente fijación de PFA para un máximo de 1 h, en comparación con la fijación inmediata de todo el cerebro en PFA (figura 2). El último conducido a tinción sináptica agrupada, con agujeros en el tejido. Sin embargo, la penetración de anticuerpos vGlut1 todavía está restringida en ambos métodos (un par de decenas de micras). No superar esta limitación, incluso con el anticuerpo de mayor incubación, pero proporcionando la penetración de anticuerpos es mayor que la profundidad total que es reflejada, no debe ser influencia en el resultado final. Además, se debe tener especial cuidado para asegurarse de que la tinción es incluso a lo largo de toda la pila adquirida.
En nuestro estudio, hemos querido distinguir excitatorio de la sinapsis inhibitorias. Por lo tanto, elegimos vGlut1/PSD-95 y vGAT/gephyrin, respectivamente, como estas proteínas son altamente expresadas en el hipocampo del ratón adulto y son específicas de cada sinapsis subtipo4,5. Otros marcadores sinápticos inhibitorias y excitatorias podrían se han utilizado para identificar cada sinapsis respectivos, tales como enriquecido en cada sinapsis, incluyendo receptores NMDA y de AMPA para los receptores excitatorios y GABAA Receptores de las sinapsis inhibitorias. Otros neurotransmisores o neuromoduladores pueden también identificarse con nuestro protocolo, garantizar que los anticuerpos específicos están disponibles, como se muestra para las sinapsis dopaminérgicas en el estriado22. Además, reduce el grosor de cada loncha a 120 μm puede superar parcialmente la baja cantidad de muestras obtenidas con láminas agudas, que es imprescindible para los estudios de las estructuras pequeñas del cerebro como la amígdala.
Futuras aplicaciones de nuestro protocolo podrían aplicarse en el estudio de diversas áreas del cerebro y trastornos. Por ejemplo, en el cuerpo estriado (una región del cerebro asociada con la enfermedad de Parkinson), una combinación de vGlut2/PSD-95 o vGlut1/PSD-95 se puede usar para diferenciar entre las sinapsis excitatorias de aferentes procedentes de la corteza o tálamo, y22.
En conclusión, hemos demostrado un método fiable para examinar el número de sinapsis en los tejidos del cerebro usando marcadores previos y postsinápticos para definir una sinapsis. Pasos críticos incluyen la preparación de buenas rebanadas hippocampal, un tiempo de fijación de hasta 1 hora en PFA, la aplicación suficiente de medio de montaje, el uso de anticuerpos confiables, ajustes de imagen apropiado de adquisición y detección rigurosas puncta sináptica. En última instancia, este método es relativamente rápido y es fácilmente reproducible por cualquier laboratorio que tienen acceso a un microscopio confocal.

El cerebro humano está compuesto por aproximadamente 1014 sinapsis. Número de sinapsis es estrictamente regulado durante el desarrollo y la maduración del sistema nervioso central (SNC). En todo el desarrollo, el número de sinapsis es modulada por la sinaptogénesis y la poda para formar redes neuronales funcionales. Aprendizaje y la memoria son compatibles con la regulación del número de sinapsis y la fuerza, un proceso conocido como potenciación sináptica y depresión1. Lo importante es la estabilización de la sinapsis Maduritas es esencial para mantener las conexiones de red neuronal. Además, se han reportado déficits en la densidad de sinapsis en las primeras etapas de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA)2. Por lo tanto, la capacidad de identificar con precisión y evaluar el número de sinapsis es fundamental para la evaluación de la patología y fisiología cerebral.
La extrema densidad y naturaleza compacta de sinapsis hacen difícil estimar su número preciso en áreas del cerebro intacto. Sinapsis químicas del sistema nervioso están hechas de dos neuronas en aposición estrecha, separados por una hendidura sináptica3. La terminal presináptica o bouton sináptico, surge de un axón y consiste en vesículas acumuladas, que contienen neurotransmisores que definen la especificidad de una sinapsis, es decir, glutamato y ácido gamma - aminobutírico (GABA) para excitatorios y inhibitorio sinapsis, respectivamente. Las membranas de las vesículas contienen vesiculares transportadores específicos para cada neurotransmisor: glutamato vesicular transportador (vGlut) para el glutamato y el transportador vesicular de GABA (vGAT) para GABA. La terminal postsináptica es una estructura muy densa compuesta por varias proteínas, incluyendo proteínas andamio, receptores y moléculas de adhesión. En las sinapsis excitatorias, proteína 95 densidad postsináptica (PSD-95) es el más abundante andamio proteína4, modulación excitatoria N-methyl-D-aspartate(NMDA-) y receptor del ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionico (AMPA) funcionar, mientras que gephyrin anclas receptores inhibitorios a la terminal postsináptica inhibitoria5. En general, la especificidad de las proteínas en compartimientos de pre- y postsinápticos ayuda en la diferenciación y la identificación de subtipos de sinapsis.
La evaluación del número de sinapsis se puede realizar con diferentes técnicas. El más común es el uso de la microscopia electrónica (EM), que permite el análisis de la sinapsis en áreas del cerebro intacto y compacto con alta magnificación y resolución. Sin embargo, esta técnica es muy costosa, requiere preparación de muestras complicadas y es muy lento. Otras técnicas incluyen el uso de la matriz tomografía6, que tiene una gran desventaja en que requiere equipo especializado y costoso realizar el análisis. Además, líneas transgénicas expresando marcadores sinápticos específicos son útiles en evaluar la sinapsis número7, pero la generación de nuevas líneas puede ser restrictivo y costoso, y la sobreexpresión de proteínas puede resultar en no deseado fuera del objetivo fenotipos.
Debido a estas limitaciones y para simplificar, muchos investigadores evaluación número de sinapsis por examinar los niveles de la proteína sináptica total. Sin embargo, puede observarse pérdida de sinapsis antes de cambios sustanciales en la proteína, como estructural remodelación sináptica en la dispersión de aposición pre o postsináptica, con la no degradación de proteínas sinápticas. Además, en AD, los niveles de proteínas sinápticas son reducidas siguientes sinapsis degeneración o muerte neuronal8,9. La cuantificación de los niveles totales no permite esta distinción. Por lo tanto, es necesario desarrollar un método confiable, accesible y preciso para la evaluación del número de sinapsis en el cerebro.
En este artículo describimos cómo bien identificar y determinar el número de sinapsis usando microscopia de la inmunofluorescencia en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor. Las sinapsis son definidas por la colocalización de marcadores previos y post sinápticos que aparecen en una distribución de punteado. Demostramos la validez de esta técnica a través del estudio de Wnt de señalización en el cerebro. Wnts son proteínas de secreción importantes para la formación, eliminación y mantenimiento de las sinapsis. La inducción en vivo de un antagonista de la secretada de la cascada de Wnt, Dickkopf-1 (Dkk1), conduce a la pérdida sináptica excitatoria conservando las sinapsis inhibitorias en el hipocampo10. Ilustramos la identificación y conteo de sinapsis inhibitorias y excitatorias en rebanadas de hipocampales de un ratón adulto expresando Dkk1 y resaltar la transferencia de esta técnica a otros tipos de preparaciones de cultivo de tejidos.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5905</td><td>vGlut1 (1:2000)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-046</td><td>PSD-95 (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Synaptic Systems</td><td>131 004</td><td>vGAT (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Synaptic Systems</td><td>147011</td><td>Gephyrin (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td>MAP2 (1:10000)</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Jackson Laboratories</td><td>706-545-148</td><td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab175470</td><td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>SouthernBiotech</td><td>00-4958-02</td><td>Fluoromount-G</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>PerkinElmer</td><td>NA</td><td>Volocity</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>203</td><td>No 11</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Loctite</td><td>1446875</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BOC</td><td>NA</td><td>Cylinder</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Thermo</td><td>7107</td><td>08-1.0mm thick</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>iDkk1 mice</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&amp;alpha; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&amp;alpha; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for solutions:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Ca&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Mg&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma</td><td>K3375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid</td><td>Sigma</td><td>107360</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Millipore</td><td>S30-100ml</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

En el cerebro, las sinapsis son uniones especializadas entre neuronas, determinando la fuerza y la extensión de la señalización neuronal. El número de sinapsis es estrictamente regulado durante el desarrollo y maduración neuronal. Lo importante, déficit en el número de sinapsis puede conducir a la disfunción cognitiva. Por lo tanto, la evaluación del número de sinapsis es parte integral de la neurobiología. Sin embargo, como las sinapsis son pequeñas y muy compactas en el cerebro intacto, la evaluación del número absoluto es un reto. Este protocolo describe un método para fácilmente identificar y evaluar la sinapsis en el hipocampales rebanadas roedores usando microscopia de la inmunofluorescencia. Incluye un procedimiento de tres pasos para evaluar las sinapsis en imágenes de microscopía confocal de alta calidad mediante el análisis de colocalización de proteínas pre- y postsinápticas en rebanadas hippocampal. También explica cómo el análisis se realiza y da ejemplos representativos de sinapsis tanto excitatorias como inhibitorias. Este protocolo proporciona una base sólida para el análisis de las sinapsis y se puede aplicar a cualquier investigación investigar la estructura y función del cerebro.

Pérdida de sinapsis ocurre en enfermedades neurodegenerativas como el anuncio y la enfermedad de Parkinson2,11,12. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a estos déficits siguen siendo mal entendidos. Deficiencias en la señalización de Wnt se han asociado con AD13,14,15,16,17. Wnts son glucoproteínas secretadas y juegan un papel esencial en la formación de sinapsis y la modulación de la transmisión sináptica18,19,20,21. Recientemente, se identificaron Wnts como reguladores claves de mantenimiento sináptica en el sistema nervioso maduro10,22. Para estudiar con precisión el impacto de Wnt de señalización en las sinapsis en el hipocampo de ratones modificados genéticamente, aprovechó de una preparación de corte de cerebro y microscopía confocal para evaluar los cambios en el número de sinapsis. Se identificaron rebanadas sanos en el que la estructura estaba bien conservada (figura 2A). Por otra parte, la selección de puncta sináptica se definió cuidadosamente, con la exclusión de grandes objetos manchados que probablemente representan agregadas proteínas (figura 2B). Este criterio se aplicó a todas las imágenes, con los mismos parámetros de análisis estricto.
Se utilizó un sistema del modelo transgénico que induce la expresión de la antagonista de Wnt secretada Dkk1 en adulto controlan de ratones (iDkk1) debajo de tetraciclina (véase la Tabla de materiales)10,22. Hemos demostrado que el bloqueo de la señalización de Wnt en el hipocampo adulto provoca pérdida de sinapsis excitatorias específicamente en la región CA1 de radiatum estrato (figura 3). Figura 3A muestra representativas imágenes confocales de marcadores previos y postsinápticos excitatorios (vGlut1 y PSD-95, respectivamente) de rebanadas de hipocampales de ratones iDkk1 expresando Dkk1 por dos semanas, así como sus respectivos controles. Analizamos estas imágenes utilizando el software de Volocity y demostró una reducción significativa en el número de sinapsis excitatorias, cuantificada por la co-localización de puncta vGlut1 y PSD-95-marcado en la región CA1 del hipocampo de ratones de iDkk1 siguiendo la inducción de Dkk1 durante dos semanas (figura 3B, * p &#60; 0.05; Prueba de Kruskal-Wallis; 6 ratones por genotipo). En el CA1 estrato radiatum, el número de sinapsis excitatorias puncta por 1.000 μm3 se redujo de 500 en ratones control a 300 en ratones iDkk1. Por el contrario, expresión de Dkk1 inducida no afectó el número de las sinapsis inhibitorias (identificado por la colocalización entre los marcadores pre y postsinápticos vGAT y gephyrin, respectivamente), como se muestra en la Figura 4A-B (p &#62; 0.05; Prueba de Kruskal-Wallis; 3 ratones por genotipo).
Lo importante, se realizó un análisis de poder estadístico para estimar la cantidad de rebanadas y animales necesarios para generar estos resultados robustos. Con R, se calculó que se necesitaban aproximadamente 35 rebanadas por condición (animales de rebanadas x 6 3 imagenes x 3 = 36) para detectar un tamaño del efecto grande (f = 0.4) con 80% de confianza (energía = 0,8) en un ANOVA unidireccional con la replicación y el bloqueo, como se describe en el paso 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
Figura 3: pérdida de sinapsis excitatorias en rebanadas de hipocampales de ratones iDkk1. (A) representante de imágenes confocales de la CA1 estrato radiatum Mostrar excitatoria sinapsis, identificada por la co-localización de vGlut1 y PSD-95 (flechas blancas). La parte inferior representa un aumento mayor del rectángulo resaltado. Barras de escala = 2 μm. (B) el porcentaje de sinapsis excitatorias entre control y iDkk1 se cuantificó utilizando el software mencionado en la Tabla de materiales (* p &#60; 0.05; Prueba de Kruskal-Wallis; 6 ratones por genotipo). Los datos son ± mentionada aquí SEM. Esta figura se ha modificado de la referencia10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
Figura 4: las sinapsis inhibitorias son sin cambios en rebanadas de hipocampales de ratones iDkk1. (A) representante de imágenes confocales de la CA1 estrato radiatum de las sinapsis inhibitorias por la colocalización entre vGAT y gephyrin (flechas blancas). La parte inferior representa un aumento mayor del rectángulo resaltado. Barras de escala = 2 μm. (B) porcentaje de las sinapsis inhibitorias entre ratones control y iDkk1, como cuantificado utilizando software Volocity (p &#62; 0.05; Prueba de Kruskal-Wallis; 3 ratones por genotipo). Los datos son ± mentionada aquí SEM. Esta figura se ha modificado de la referencia10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alta sacarosa ACSF componentes</td>
			<td>Concentración</td>
			<td>Notas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido quinurénico</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido pirúvico</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Añadir después la oxigenación de la solución</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>Añadir después la oxigenación de la solución</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucosa</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarosa</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cámara sumergida ACSF componentes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Añadir después la oxigenación de la solución</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 mM</td>
			<td>Añadir después la oxigenación de la solución</td>
		
		<tr>
			<td>D-glucosa</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	

Tabla 1: Composición de ACSF.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tampón de bloqueo/permeabilizing</td>
			<td>Concentración</td>
			<td>Notas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suero de burro</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>0.50%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH a 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1.37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>18 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA/4% sacarosa</td>
			<td></td>
			<td>pH a 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>Diluir de 10 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>1.33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarosa</td>
			<td>117 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: Buffers utilizados para la tinción inmunofluorescente.

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Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Un protocolo para identificar con precisión y analizar sinapsis en rebanadas hippocampal mediante inmunofluorescencia se describe en este artículo.

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.0K vistas.  University College London. Un protocolo para identificar con precisión y analizar sinapsis en rebanadas hippocampal mediante inmunofluorescencia se describe en este artículo.

Video: Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Preparación de la aguda rodajas de hipocampo de ratas y ratones transgénicos para el estudio de las alteraciones sinápticas durante el envejecimiento y la patología amiloide

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Investigación

Neurociencias

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic connectivity mechanisms work properly and homeostasis is maintained. The hippocampus is a unique brain structure that manages higher cognitive functions, and is the subject of several studies regarding neurologic diseases. The investigation of physiological and pathological mechanisms in rodent models can benefit from acute hippocampal slice (AHS) preparations. AHS has the advantage of providing reliable information on cell function since the cytoarchitecture and synaptic circuits are preserved. Although AHS preparations are commonly used in neurochemistry laboratories, it is possible to find some methodological differences in the literature. Considering that distinctive slice preparation protocols might change the hippocampal regions analyzed, this current protocol proposes a standard technique for obtaining transverse AHS from resected hippocampus. This simple-to-perform protocol may be used in mice and rats&#39; experimental models and allow several ex vivo approaches investigating neurochemical dynamics (in dorsal, intermediate and ventral hippocampus) in different backgrounds (e.g., transgenic manipulations) or after in vivo manipulations (e.g., pharmacological treatments or suitable rodent models to study clinical disorders). After dissecting the hippocampus from the rodent brain, transverse slices along the septo-temporal axis (300 &#181;m thick) were obtained. These AHS contain distinct parts of the hippocampus and were subjected to an individual neurochemical investigation (as an example: neurotransmitter transporters using their respective substrates). As the hippocampus presents a high density of excitatory synapses, and glutamate is the most important neurotransmitter in the brain, the glutamatergic system is an interesting target for in vivo observed phenomena. Thus, the current protocol provides detailed steps to explore glutamate uptake in ex vivo AHS using L-[3H]-Glutamate. Using this protocol to investigate hippocampal function may help to better understand the influence of glutamate metabolism on mechanisms of neuroprotection or neurotoxicity.

<meta charset="utf8"></head><body>Medición de la absorción de glutamato utilizando L-[3H]-glutamato radiomarcado en cortes transversales agudos obtenidos de hipocampo resecado con roedores

This article describes a reliable and simple way to obtain ex vivo acute hippocampal transverse slices from mice and rats using a tissue chopper. Slices obtained from resected hippocampi can be submitted for functional glutamate uptake analysis to investigate glutamatergic system homeostasis.

Medición de la absorción de glutamato utilizando L-[3H]-glutamato radiomarcado en cortes transversales agudos obtenidos de hipocampo resecado con roedores

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic ...

Bioquímica

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Evaluación de la arborización dendrítica en el giro dentado de la región del hipocampo en ratones

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

Minimizar la hipoxia en las rebanadas de hipocampo de ratones adultos y envejecidos

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

<meta charset="utf8"></head><body>Preparación de cortes agudos de cerebro del polo dorsal del hipocampo de roedores adultos

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Preparación de cortes agudos de cerebro del polo dorsal del hipocampo de roedores adultos

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo

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Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Rebanadas hipocampales horizontales del cerebro del ratón

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Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

Resumen

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Preparación de cortes agudos de cerebro del polo dorsal del hipocampo de roedores adultos

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