This research was supported by grants from the LuMind Foundation, Research Down Syndrome, and the Alzheimer&#8217;s Association (AS). CP was partially supported by a faculty development grant from the College of Nursing and Health Professions at Arkansas State University.

NOTA: Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas éticas aprobadas por el Comité de Investigación Animal de la Sistema de Salud de Asuntos de Veteranos de Palo Alto. 1. Golgi-Cox tinción <ol><li> La extracción de cerebro y tinción <ol><li> En la primera jornada, profundamente anestesiar a los ratones con 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina antes de la eutanasia a través desangrado. </li><li> Retire con cuidado la bóveda craneal y diseccionar el cerebro. <ol><li> Primero quitar la piel en la parte superior del cráneo, la colocación de una tijera curvada en la parte superior del cerebelo y suavemente cortar a través de la bóveda craneal paralelo al surco central con la punta de la tijera señalado hacia el exterior, moviéndose en la dirección hacia el bulbo olfatorio. Repita este proceso en ambos lados. </li><li> Use un pincet quirúrgico para levantar la bóveda craneal, mientras que si lo gira hacia los bulbos olfatorios y romper con él. A continuación, dar la vuelta el cráneo al revés y utilizar un pico para cortar a través de la ópticanervios y aflojan el cerebro. Por último, utilice la selección para separar el cerebro desde la médula espinal a nivel del foramen magnum. </li></ol></li><li> Inmediatamente sumerja el cerebro en 15 ml de solución comercialmente disponible de Golgi-Cox, sin diluir. Guarde el cerebro en solución de Golgi en una botella de vidrio de 20 ml tapado a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> En el segundo día, se vierte lentamente la solución y reemplazarla con 15 ml de solución de Golgi-Cox fresco. Vuelva a tapar el frasco que contiene el cerebro y dejar en reposo durante otros 9 días en la oscuridad. </li></ol></li><li> Seccionamiento y empotramiento <ol><li> El día 11, colocar los cerebros en solución de sacarosa al 30%, preparado en ddH2O para la deshidratación. Cambie la solución recién preparada con 30% de sacarosa después de 12 horas. Incubar los cerebros en una solución de sacarosa al 30% durante 3 días a 4 ° C. </li><li> El día 14, llenar el depósito de la vibratome con una solución de sacarosa al 30% hasta que la hoja está cubierta. Ajuste la velocidad de 1 mm / s con una amplitud de 0,95 mm. </li><li> Seque el cerebro con un Kimwipe para eliminar el exceso de humedad y eliminar el cerebelo utilizando una hoja de afeitar para cortar coronal. </li><li> Monte firmemente todo el cerebro a la plataforma vibratome usando pegamento y deje que se seque durante 2-4 min. Inserte la plataforma con el cerebro adherido en el depósito y ajustar la hoja a la parte superior del cerebro. </li><li> Utilizando el vibratome, cortar el cerebro en 150 micras de espesor secciones a temperatura ambiente, recordando que cambiar la hoja después de cada tercera cerebro. </li><li> Recoge las secciones del depósito con un cepillo pequeño de punta y sumergirlos en una placa de Petri que contiene 0,3% de gelatina hecha en ddH 2 O. Mientras que las secciones permanecen en la placa de Petri, añadir 0,5 ml de 0,3% de gelatina en cada diapositiva y utilice un cepillo para difundir y recubrir las Superfrost + diapositivas. </li><li> Recoger suavemente hasta las secciones sumergidas de la placa de Petri y colocarlos sobre los portaobjetos gelatinizados. Oriente las secciones del cerebro portocarlos sólo en sus lados y no en la parte superior. </li><li> Después de unos diez minutos, recubrir las secciones con 30% de sacarosa antes de que el tejido se seque por completo. Luego secar al aire las muestras preparadas en un lugar oscuro en una parrilla corrediza durante 3 días. </li><li> Diluir disponible comercialmente solución Desarrollar 10x a 1x usando ddH2O Sumergir los portaobjetos en solución de revelado para 7-10 min. Enjuague las diapositivas 3 veces en ddH 2 O. </li></ol></li><li> Deshidratación <ol><li> Preparar 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% y soluciones de etanol usando destilada ddH 2 O. </li><li> Remoje las diapositivas de soluciones cada vez más altas de etanol durante 10 minutos cada uno. </li><li> Remojar los portaobjetos en solución de etanol al 100% 3 veces durante 10 min cada vez. </li><li> Remoje las diapositivas en el 100% de xileno 3 veces consecutivas durante 5 minutos cada uno, manteniendo las secciones en la solución final hasta que estén encubrimiento resbaló. </li><li> Coloque una cantidad generosa de DPX (ftalato de di-n-butilo en xileno) medio de montaje (abfuera 1-1,5 ml) en cada diapositiva utilizando una pipeta de plástico. Coloque cuidadosamente cubreobjetos para evitar burbujas. </li><li> Cubierta seca Aire deslizó cerebro secciones horizontalmente durante 3 días. </li></ol></li></ol> 2. Doublecortin tinción <ol><li> Profundamente anestesiar (consulte el paso 1.1.1) a los animales. </li><li> Realizar la perfusión cardíaca con recién preparada 4% de paraformaldehído hecho en tampón fosfato 12. </li><li> Extraer el cerebro (véase 1.1.2) y se guardan en 45 ml de paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante la noche en un agitador de balanceo. </li><li> La transferencia de los cerebros de una solución de sacarosa al 30% y esperar a que la deshidratación completa durante 48 horas a 4 ° C. Retire el cerebro a partir de sacarosa y colocarlos directamente en bloques de cobre colocados en hielo seco. </li><li> Llenar el bloque con la temperatura de corte óptima (OCT) compuesto y marcar la orientación del cerebro usando el bulbo olfatorio como un hito. </li><li> El uso de un criostato, cortar secciones 70 micras de espesor a -20 ºC y colocarlosen solución crioprotector (25% de glicol de etileno, 25% de glicerol, en tampón de fosfato de sodio 0,05 M, pH 7,4) y mantener a -20 ° C hasta su uso. </li><li> Hacer una solución de 50% de metanol crioprotector y 50%. A esta solución añadir peróxido de hidrógeno al 0,5% (vol / vol). Incubar las secciones flotantes de 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Secciones calientes en 37 ºC en TBS (solución salina tamponada con Tris) para 30-40 min colocándolos en un horno histológico. </li><li> Incubar las secciones con 0,3% de Triton y 3% de suero de caballo normal durante 45 min a temperatura ambiente antes de la inmunotinción. Incubar las secciones a 4 ºC durante la noche en 3 ml de solución del anticuerpo DCX diluido 1: 500 en TBS con 0,3% de Triton y 1% de suero de caballo normal. </li><li> Lavar Al día siguiente las secciones 3 veces consecutivas en TBS (10 min cada uno). </li><li> Incubar las secciones con un caballo biotinilado anti-cabra (1: 200 en TBS) durante dos horas a temperatura ambiente. Lávese las secciones 3 veces consecutivas en TBS (10 min cada uno). </li><li> Incubar tdobladillo con ABC Lite (1: 1000) durante 1,5 horas a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 5 l de 30% de H 2 O 2 a un comprimido de 10 mg de DAB (3,3 &quot;diaminobenzidine) solución disuelta en 15 ml de 1 M Tris-HCl (pH 7,6). Incubar las secciones inmediatamente en esta solución durante 5 min. </li><li> Terminar la reacción por lavado con TBS enfriado con hielo tres veces seguido de un lavado en TBS a temperatura ambiente. </li><li> Deshidratar secciones usando una serie de soluciones de etanol (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 min cada uno), aclarar en xileno, y luego cubrir deslizamiento usando DPX como en el paso 1.3. </li></ol> 3. Visualización <ol><li> Tras el secado completo de las secciones, eliminar el exceso de DPX en la parte superior de las diapositivas con una cuchilla afilada, y colocarlos en la etapa de exploración del microscopio. El sistema se compone de un microscopio equipado con la etapa de exploración, palanca de mando, y un color de la cámara 12-bit. </li><li> Inicie el programa. Abra un nuevo archivo de datos. </li><li> Lugarun punto de referencia en la pantalla haciendo clic con el puntero del ratón en cualquier lugar. Esto activará todos los iconos del panel de herramientas de la ventana del programa. </li><li> Haga clic en el icono &quot;Joystick gratis&quot; en la barra de herramientas y luego usar el joystick para localizar el giro dentado del hipocampo en la primera sección. </li><li> En la pestaña &quot;Herramientas&quot; de la ventana del programa, seleccione &quot;Sección Administrador serie&quot;. Haga clic en el icono &quot;Nueva sección&quot; en la esquina inferior izquierda de la ventana. Esto abrirá la ventana &quot;Configuración de la Sección de serie&quot;. </li><li> Seleccione la ventana de la sección de configuración de serie y luego ingrese el número total de secciones que contienen las regiones del hipocampo. Seleccione el intervalo de evaluación. Introduzca el espesor de la sección de corte (70 micras para DCX y 150 m para las secciones teñidas-Golgi). </li><li> Iniciar rastreo de la región giro dentado haciendo clic en el icono &quot;Freehand Diseño de contorno&quot; en la barra de herramientas. Contorno de la capa de células granulares dentadas. &lt;/ Li&gt; <li> Seleccione &quot;100X&quot; en el menú &quot;Ampliación&quot;. Añadir una gota de aceite de inmersión sobre la sección y cambiar el objetivo de 100X. Localice los cuerpos de células granulares dentadas y dendritas marco de este objetivo. </li><li> Centrarse en una neurona seleccionado y haga clic en el icono &quot;Neurona Rastreo&quot; en la barra de herramientas. Trazar la circunferencia del cuerpo de células granulares dentadas. Cuando termine el rastreo, haga clic derecho para seleccionar &quot;Finalizar Cell Cuerpo&quot;. </li><li> Iniciar rastreo de las dendritas manualmente en X, Y y Z y seguir cada rama con el mando joystick y z-motor. En un nodo de bifurcación o trifurcación, seleccione la opción correspondiente en el menú desplegable en el botón derecho. Traza cada una de las ramas que surgen de estos nodos. Al final de cada rama, haga clic derecho y seleccione &quot;Terminar&quot; en el menú desplegable. </li><li> Utilizando los iconos de la tecla de flecha en la ventana del software seleccionar aleatoriamente otra de células granulares dentadas y siga el mismo procedimiento que described en el paso 3.9 a 3.10. Guarde todo el trazado. </li><li> Inicie el software de rastreo neuronal. </li><li> Abra el primer archivo de datos NRX desde el primer ratón del grupo experimental. Anexar el archivo NRX del segundo ratón del grupo experimental. Continúe hasta que se adjuntan todos los archivos NRX de este grupo. </li><li> En la ficha Análisis, seleccione &quot;Fan In-diagrama&quot;. Esto abre el ventilador en-análisis ventana. Marca de verificación &quot;dendritas&quot; y haga clic en Mostrar, que representa a las longitudes y los patrones de ramificación dendrítica para este grupo de ratones (Figura 1). </li></ol> 4. EDFI NOTA: Este método permite al usuario grabar rápidamente un gran número de imágenes a través del eje z de cada campo y generar una imagen 2D que contiene todos los píxeles centrados a lo largo del eje z. El resultado será una imagen compuesta que contiene todos los píxeles enfocados de las imágenes recogidas. <ol><li> Conecte el microscopio a una cámara digitalera. Coloque las secciones primera en la etapa de exploración conectado con el microscopio y luego cambiar a un objetivo de 10X. Mueva el escenario para el área de interés. </li><li> Iniciar un programa de captura de vídeo. </li><li> Pulse el botón de grabación. Tan pronto como se pulsa el botón de grabación, utilice el mando macro de enfoque para pasar de la parte superior a la parte inferior de la sección para un total de 4 seg. Guarde el archivo de vídeo resultante. </li><li> Utilice ImageJ software gratuito para convertir los archivos de vídeo AVI en un formato sin compresión abriendo el archivo y guardarlo en formato de archivo sin comprimir. </li><li> Iniciar un programa de análisis de imagen y abrir el archivo AVI. Ir al menú &quot;Acción&quot; y haga clic en &quot;profundidad de campo&quot;. Seleccione el archivo de vídeo correspondiente. En opciones de &quot;salida&quot;, seleccione &quot;Generar Composite Best-Focus de imagen&quot;. </li><li> En opciones de &quot;Análisis Focus&quot;, seleccione &quot;Normalizado Iluminación&quot; y opciones &quot;Max Contraste Local&quot;. A continuación, seleccione &quot;Crecomió &quot;. La imagen resultante representa todos los píxeles centrados a lo largo del eje z (Figura 2). </li><li> Guarda la imagen resultante. </li></ol> 5. Generar Extremadamente Imágenes de alta resolución NOTA: Este método permite al usuario generar automáticamente bajo aumento y imágenes de muy alta resolución de imágenes de alta magnificación de alta resolución de forma automatizada. <ol><li> Colocar las secciones primera en la etapa de exploración conectado al microscopio. El microscopio está conectado a una cámara digital. Mueva el escenario para el área de interés. </li><li> Iniciar un programa de adquisición de imágenes. </li><li> Utilice un objetivo de 10X y adquirir y guardar imágenes de alta resolución (4076 x 3116) de la región de interés, asegurándose de tener por lo menos 10% de superposición. </li><li> Image Composite Editor Ejecutar a la puntada imágenes. </li><li> Ir al menú Archivo y haga clic en &quot;Nuevo Panorama&quot;. Seleccione la carpeta en la que las imágenes son stORed. Seleccione las imágenes que pertenecen a la misma región y pulse &quot;ok&quot;. </li><li> Pulse el botón &quot;Exportar a disco&quot; y guardar la imagen. Esta imagen representa una imagen de muy alta resolución de la zona de interés que podrían ser utilizados para el análisis y / o demostración (Figura 3). </li></ol>

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Las tasas de publicación para este artículo son patrocinados por MBF Bioscience.

Aquí, dos métodos se describieron para cuantificar el grado de arborización dendrítica en las neuronas maduras y recién nacidos utilizando métodos de tinción convencionales en conjunción con RTI y EDFI. La adquisición de imágenes de alta resolución de las neuronas proporciona un método extremadamente útil para probar los efectos perjudiciales de los trastornos neurodegenerativos y, a su vez, proporciona un medio para evaluar las estrategias terapéuticas que se dirigen a las neuronas del hipocampo. <p c...

Alteraciones dinámicas en el número y la estructura de las sinapsis son características de desarrollo, el envejecimiento, y numerosos trastornos neurodegenerativos 1-3. La capacidad de las neuronas para recibir e integrar la información sináptica depende de la morfología dendrítica y alteraciones dinámicas en las conexiones sinápticas. De hecho, existe una correlación positiva entre la espina dendrítica y el número de sinapsis, que tanto el impacto de la función cognitiva 4. Por lo tanto, no es sorprendente que decrementos en número de la espina dendrítica se han asociado con la disfunción cognitiva en un número de trastornos neurológicos 5-7, lo que provocó un gran interés en la cuantificación de la espina dendrítica. Sin embargo, la cuantificación de la densidad de la espina sigue siendo un tiempo y tarea tediosa, que no genera información útil con respecto a la topografía y la distribución de las sinapsis en todo el árbol dendrítico. Afortunadamente, los métodos de tinción (por ejemplo, Golgi-Cox y doublecortin (DCX)), en relacióncon sofisticadas técnicas de imagen se puede utilizar para superar las barreras actuales y producir imágenes de alta resolución de la arborización dendrítica de una manera fiable y rápida. Si bien el método de tinción de Golgi-Cox se puede implementar para evaluar el estado de la arborización dendrítica en todas las neuronas 8, DCX puede desplegarse para etiquetar las neuronas recién nacidas en particular en el giro dentado y la zona subventricular 9, una consideración importante dado que la neurogénesis ocurre tanto estas regiones a lo largo de la vida útil 10,11. Después de la tinción, dos métodos de imagen fueron desplegados para evaluar las características dendríticas: i) una imagen en tiempo real (RTI) y ii) de profundidad ampliada de la imagen de campo (EDFI). La técnica de RTI proporciona un medio para rastrear y cuantificar la longitud y orden de arborización largo de los segmentos y ramas dendríticas individuales. Por lo tanto, le permite a uno para estimar el área total y el volumen ocupado por cada árbol dendrítico. Más specifically, en el método RTI el usuario identifica continuamente los segmentos y reenfoca iterativamente como la neurona software de rastreo recoge las x, y, z y las coordenadas de la estructura dendrítica y reconstruye la trayectoria de la estructura dendrítica en 3D. Comparativamente, el método EDFI proporciona un medio más bien simples y rápidos para evaluar la densidad dendríticas en muestras de tejido en lugar de espesor mediante la generación de una imagen compuesta, proporcionando información sobre todo el eje z. Para ello, el usuario registra los archivos de vídeo de alta definición de todo el espesor de la sección y, a continuación utiliza el software para buscar los fotogramas de vídeo para identificar los puntos en el que un píxel es completamente enfocado. Posteriormente, los píxeles enfocados se fusionan e integran en una alta resolución, imagen 2D compuesta. Esta imagen compuesta contiene todos los píxeles que eran de enfoque, independientemente de su posición en el eje z. Análisis cualitativo y cuantitativo de estas imágenes en 2D se puede utilizar posteriormente para determinar la densidadde ramificación dendrítica en cada campo. Por último, se presenta un método panorámica para generar imágenes de muy alta resolución para el análisis y evaluación de las dendritas en toda una región de interés. Esta técnica se puede implementar para superar la falta de acceso a muy alta resolución y cámaras digitales caras. Usando este método, uno capta imágenes en serie en diferentes lugares a lo largo de los ejes x e y ejes y luego automáticamente puntadas juntos usando un programa gratuito (por ejemplo, Imagen Composite Editor). En particular, este método se puede utilizar para la evaluación cualitativa y cuantitativa de arborización dendrítica en una zona bastante amplia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="960">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:272px;">Name</td>
			<td style="width:263px;">Company</td>
			<td style="width:267px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Modified Golgi-cox staining solution&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Weill Cornell Medical College</td>
			<td style="width:267px;">NA</td>
			<td style="width:159px;">store at 4&#176;C till use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">1x Developing Solution (Stock 10x)</td>
			<td style="width:263px;">Weill Cornell Medical College</td>
			<td style="width:267px;">NA</td>
			<td style="width:159px;">store at 4&#176;C till use</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:272px;">30% Sucrose,</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 57-50-1</td>
			<td style="width:159px;">make fresh &#160;in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">0.3% Gelatin</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 9000-70-8</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:272px;">Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS 603-003-00-5</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Xylene</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 1330-20-7</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DPX Medium</td>
			<td style="width:263px;">EMS&#160;</td>
			<td style="width:267px;">#13510</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Superfrost (+) white</td>
			<td style="width:263px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:267px;">71869-10</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)</td>
			<td style="width:263px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:267px;">#4811-703</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DCX Antibody</td>
			<td style="width:263px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:267px;">sc-8066</td>
			<td style="width:159px;">4 C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DAB</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS Number 91-95-2 &#160;</td>
			<td style="width:159px;">-20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">OCT</td>
			<td style="width:263px;">Tissue-tek</td>
			<td style="width:267px;">4583</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Tris</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS Number 77-86-1 &#160;</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">ABC Lite</td>
			<td style="width:263px;">Vector</td>
			<td style="width:267px;">PK4000</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:272px;">Name</td>
			<td style="width:263px;">Company</td>
			<td style="width:267px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">DS-Ri1</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">12 bit Camera&#160;</td>
			<td style="width:263px;">QImaging&#160;</td>
			<td>01 MBF2000RF-CLR-12</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Neurolucida System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td style="width:267px;">V.10</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Image Composite Editor</td>
			<td style="width:263px;">Microsoft</td>
			<td>1.4.4.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">NIS Elements</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">F 3.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Image Pro Plus</td>
			<td style="width:263px;">Mediacy</td>
			<td>Versin 7.00</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of dendritic arborization in the dentate gyrus of the hippocampal region in mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

La extensión de la arborización derivada de células granulares dentadas existentes y recién nacidos se analizó en ratones de tipo salvaje utilizando Golgi-Cox o tinción DCX (Figura 1). Se encontraron segmentos dendríticos de células DCX-positivas que ser 13 a 36 micras de largo. La distribución normal de la longitud dendrítica se probó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p &lt;0,01, Liliefors p &lt;0,001; las figuras 4 y 5). <p class="jo...

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Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Evaluación de la arborización dendrítica en el giro dentado de la región del hipocampo en ratones

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

assessment-dendritic-arborization-dentate-gyrus-hippocampal-region

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.2K vistas.  VA Palo Alto Health Care System. We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

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Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualización de los propioceptores<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas y pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Investigación

Neurociencias

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

El uso de condicionamiento de clásico de Eyeblink rastro para evaluar disfunción hipocampal en un modelo de rata de trastornos del espectro alcohólico Fetal

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Evaluación de la complejidad dendrítica del hipocampo en ratones envejecidos utilizando el método de Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica Neuronal en Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for various neurological and psychiatric disorders. HFS in the deep region of the brain, also named deep-brain stimulation (DBS), is becoming increasingly important in clinical trials. Recent progress in the field of high-frequency DBS (HF-DBS) surgery has begun to spread the possibility of utilizing this invasive technique to other situations, such as treatment for major depression disorder (MDD), obsessive-compulsive disorder (OCD), and so on. 
Despite these expanding indications, the underlying mechanisms of the beneficial effects of HF-DBS remain enigmatic. To address this question, one approach is to use implanted electrodes that sparsely activate distributed subpopulations of neurons by HFS. It has been reported that HFS in the anterior nucleus of the thalamus could be used for the treatment of refractory epilepsy in the clinic. The underlying mechanisms might be related to the increased neurogenesis and altered neuronal activity. Therefore, we are interested in exploring the physiological alterations by the detection of neuronal activity as well as neurogenesis in the mouse dentate gyrus (DG) before and after HFS treatment. 
In this manuscript, we describe methodologies for HFS to target the activation of the DG in mice, directly or indirectly and in an acute or chronic manner. In addition, we describe a detailed protocol for the preparation of brain slices for c-fos and Notch1 immunofluorescent staining to monitor the neuronal activity and signaling activation and for bromodeoxyuridine (BrdU) labeling to determine the neurogenesis after the HF-DBS induction. The activation of the neuronal activity and neurogenesis after the HF-DBS treatment provides direct neurobiological evidence and potential therapeutic benefits. Particularly, this methodology can be modified and applied to target other interested brain regions such as the basal ganglia and subthalamic regions for specific brain disorders in the clinic.

This protocol shows how to set up a reliable HFS method in mice. Neurons throughout the hippocampal dentate gyrus are electrically stimulated by HFS directly and indirectly in vivo. Neuronal activity and molecular signaling are examined by c-fos and Notch1 immunofluorescent staining, respectively; neurogenesis is quantified by bromodeoxyuridine labeling assay.

Un método invasivo para la activación de la convolución del cerebro dentada de ratón por el estímulo de alta frecuencia

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

El poder del Interstimulus intervalo para la evaluación de proceso Temporal en roedores

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

Preparación de rodajas agudas del hipocampo dorsal para la grabación de células enteras y la reconstrucción neuronal en el dentate gyrus de ratones adultos