Este protocolo requiere el uso de un gradiente de densidad única, lo que lo hace significativamente menos intensivo en mano de obra y más rentable en comparación con los métodos de aislamiento de islotes convencionales más complejos. La principal ventaja de este protocolo es que la enzima se entrega directamente al páncreas, lo que resulta en una mayor digestión tisular y un mayor rendimiento de los islotes. Comience pegando las extremidades del ratón en la posición supina y rociando el cuerpo con 70%etanol.
Usando fórceps de tapa y tijeras quirúrgicas curvas, haz una incisión horizontal de la piel de la piel de aproximadamente tres centímetros y abre la piel para exponer la pared abdominal. Haga una incisión vertical de tres a cuatro centímetros en el peritoneo abdominal para exponer completamente el páncreas y colocar el ratón debajo de un microscopio diseccionado. Empuje el lóbulo hepático superiormente para exponer el conducto biliar que aparece como un tubo de color rosa pálido y mueva suavemente los intestinos de la región lumbar derecha e ilíaca a la derecha de la cavidad abdominal para exponer el conducto biliar y la arteria hepática.
Utilice micro serrefinas Schwartz para sujetar cuidadosamente el conducto biliar común lo más cerca posible del hígado e identificar la ampolla de Vater que se encuentra en la papila duodenal y formada por la unión del conducto pancreático y el conducto biliar común. Usando micro fórceps Adson para tirar del conducto biliar común enseñado, inserte una aguja de media pulgada de calibre 30 unida a una jeringa de tres mililitros que contenga tres mililitros de solución de colágeno P recién preparada en la ampolla de Vater empujando la aguja en el conducto paralelo al recipiente durante aproximadamente un cuarto de la longitud del recipiente. Una vez que la aguja esté en su lugar, estabilice la aguja con micro fórceps Adson e inyecte lentamente y constantemente tres mililitros de solución de colagenasa P en el conducto.
La inyección se considera exitosa si las regiones de la cabeza, el cuello, el cuerpo y la cola del páncreas están completamente infladas. La entrada adecuada en la ampolla y la cánulación del conducto biliar común son fundamentales para una cosecha de digestión exitosa. Perforar las paredes ductales reduce la eficacia del aislamiento.
Usando fórceps curvos y micro Adson, extraiga cuidadosamente el páncreas inflado comenzando en el bazo y continuando hacia el estómago y a lo largo del duodeno. A continuación, coloque el páncreas en un tubo de digestión de 50 mililitros que contenga tres mililitros de solución de colagenasa P helada. Para cosechar los islotes, primero use tijeras quirúrgicas finas para cortar el páncreas durante tres a cinco segundos antes de colocar el tubo en un baño de agua de 37 grados Celsius a 100 a 120 rotaciones por minuto durante 12 a 13 minutos.
Al final de la incubación, agita suavemente el tubo durante unos 30 segundos para interrumpir el tejido hasta que la solución sea homogénea como lo confirman las partículas de tejido pancreático similares a la arena fina. Tan pronto como se digiere el tejido, coloque el tubo sobre hielo y agregue 40 mililitros de solución de parada helada para terminar la reacción enzimática. Después de interrumpir suavemente el pellet, gire hacia abajo el tejido digerido en una centrífuga de cubo oscilante seguida de dos centrifugaciones con 20 mililitros de solución de parada fresca por lavado.
Después del último lavado, resuspender el pellet en 40 mililitros de HBSS helado para tres lavados adicionales, resuspendiendo el pellet en cinco mililitros de solución de gradiente de densidad de temperatura ambiente después del último lavado. Vórtice el tubo brevemente a baja velocidad hasta que la solución se homogeneice antes de añadir otros cinco mililitros de gradiente de densidad de temperatura ambiente al tubo. Ahora utilice una pipeta de 10 mililitros para agregar suavemente y lentamente 10 mililitros de HBSS de temperatura ambiente al tubo de una manera gota para permitir la formación de un gradiente y utilizar una centrífuga de cubo oscilante para aislar las poblaciones celulares por separación de gradiente de densidad.
Al final de la centrifugación, utilice una pipeta de 10 mililitros pre-húmeda con HBSS frío para recoger de cinco a 10 mililitros de la capa de islote entre el gradiente de densidad y el HBSS. Transfiera los islotes a un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de HBSS frío fresco y recoja las células por centrifugación en una centrífuga de cubo oscilante. Aspirar cuidadosamente todos menos los últimos tres mililitros del sobrenadante sin alterar el pellet y lavar los islotes al menos tres veces más con 20 mililitros de HBSS fresco por lavado.
Después del último lavado, reemplace el sobrenadante con cuatro mililitros de 37 grados Celsius RMPI 1640 medio y gire suavemente el tubo para desalojar el pellet. Inmediatamente verter los islotes en un plato Petri de 100 milímetros y lavar el tubo con cinco mililitros de nuevo RPMI 1640 medio para recoger los islotes restantes que se acumulen el lavado con los otros islotes. A continuación, utilice un microscopio de disección y una punta de pipeta de 20 microlitros para recoger islotes esféricos sanos u oblongos dorados con una superficie lisa de la placa Petri para transferirlos a un nuevo plato Petri que contenga 10 mililitros de RPMI 1640 medio completo.
Cuando se hayan recogido todos los islotes, coloque los islotes en una incubadora estéril a 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono en el aire humidificado durante la noche. Los buenos islotes sanos parecen tener una forma redonda lisa, mientras que los islotes dañados mal exhiben bordes ásperos. El tejido exocrino no digerido es de aspecto translúcido y demuestra una forma irregular.
Una cannulación y distribución adecuadas de la enzima colagenasa P puede ser confirmada por una inflación de la porción esplénica del páncreas. La incubación nocturna en medios bajos de glucosa puede preparar los islotes para un ensayo de secreción de insulina estimulado por glucosa al día siguiente, lo que permite conocer la capacidad secretora de insulina de los islotes.
