Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH R01 DK060581, R01 DK083583 (tanto para RGM).

A. Materiales necesarios: Véase la Tabla 1 (reactivos) antes de la preparación <ol><li> HBSS (P / S): 100 ml de HBSS 10X + 900 ml de H 2 0 + 1% de penicilina / estreptomicina (almacenado en el refrigerador o se mantuvieron en hielo). </li><li> 20% stock de BSA se hace en agua y se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C. </li><li> HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml de 20% de BSA (concentraciones finales de 0,3% de BSA es) </li><li> Islet medio: RPMI + 10% de FBS + glutamina 1% + 1% penicilina / estreptomicina </li><li> Histopaque 1100: 240 ml Histopaque 1119 + 200 ml 1077 Histopaque </li><li> Sutura 4-0 (McKesson): cortado en 2 ¾ pulgadas piezas y almacenado en una caja de Petri 10 cm </li><li> Instrumentos: Doble las pinzas de herramientas de la ciencia Artes a 90 °, y limar los dientes de sierra de los tres pares de pinzas. El objetivo es opaco a los dientes, no para eliminarlos. </li><li> Cánula para la administración de la mezcla de colagenasa / proteasa: 27G ½ pulg aguja, 30 ½ pulgadasaguja, PE50 tubo cortado en piezas de 12 pulgadas. Presentar dos agujas a un final suave y redondeada que no tiene bordes afilados. Insertar la aguja 27G en un extremo de una pieza de 12 pulgadas de tubo de PE50. Retire la aguja 30G de la caja por la rotura de la carcasa con un par de alicates, girando la carcasa de ¼ de vuelta cada vez. Retire la aguja con las pinzas de la carcasa y la inserta en el otro extremo de la tubería PE50 bajo un microscopio de disección. Asegúrese de no doblar la tubería como se inserta la aguja en el tubo PE50. La aguja 27G es el extremo que va a conectar la jeringa de la colagenasa. </li><li> La colagenasa (CI zyme MA) y Neutral Protease (CI zyme BP). Reconstituir la TDE según instrucciones del fabricante. Consulte el Certificado lote específico de análisis para calcular la concentración de la actividad enzimática. Transferencia de un total de 350.000 colágeno degradantes actividad (CDA) unidades de la colagenasa reconstituido y 100.000 unidades de proteasa neutral de la reconstitbuido Proteasa BP en un tubo cónico y se completa hasta 15 ml en total en HBSS (P / S) </li></ol> B. Paso a Paso Protocolo 1. La inflación del páncreas con la mezcla colagenasa / Proteasa <ol><li> Eutanasiar ratón por dislocación cervical, saturar el torso ratón con 70% de EtOH, la cavidad abdominal abierta completamente del ano a diafragma con las tijeras de disección y pinzas. </li><li> Coloque el mouse sobre la plataforma de un microscopio de disección. </li><li> Tire el ciego y el colon ascendente hacia fuera y puso fuera de la cavidad del cuerpo hacia la izquierda. Véase la Figura 1 para un resumen de los pasos siguientes. </li><li> Coloque los lóbulos del hígado contra el diafragma, sino que debe permanecer allí si la cavidad corporal es lo suficientemente abierto. Encontrar la arteria hepática, vena portal y el haz del conducto biliar que conduce al hígado agarrando el duodeno con pinzas curvas. Con otro par de pinzas curvas, llegar debajo de la arteria, vena, y bu conductondle y saque un 2 ¾ pulgadas pedazo de sutura 4-0 en la arteria, vena conducto biliar, y lo atan una vez y tire con fuerza tan cerca del hígado como sea posible. </li><li> Utilizando dos pares de pinzas curvas, cuidadosamente agarrar el duodeno y encontrar el conducto biliar unido al duodeno en la papila. Utilice una tenaza de la pinza para perforar el páncreas y el derecho del tejido conectivo debajo de la estrecha vía biliar a la papila. Mete la pinza rápidamente a través del órgano para hacer un agujero y luego puso las dos pinzas de fórceps medio y coge otro trozo de 2 ¾ pulgadas de sutura 4-0 y atarlo a través de una vez y tire de ella a un pequeño círculo, pero NO tire fuertemente. </li><li> Cambiar a los 90 ° fórceps y las tijeras Vannas superfinas. Con las pinzas de 90 °, con cuidado apretar y tirar del intestino delgado hasta el conducto biliar es tensa. Hacer un corte horizontal a través de la papila con las tijeras por apuñalamiento las tijeras abiertas en el intestino y después cortando con un solo movimiento. Trate de hacer solo one cortar a través de la papila sin desplazar el conducto de la bilis desde la papila. </li><li> Mientras mantiene el intestino con los fórceps 90 °, inserte la cánula en el conducto biliar hasta la mitad de la longitud de la vía biliar, a continuación, tire suavemente de la sutura apretada alrededor de la cánula. </li><li> Llene una jeringa de 3 ml con 2,0 ml de la mezcla de colagenasa / proteasa y se inyecta dentro de la cánula a un ritmo lento y constante. </li><li> Después de inflación del páncreas, retire la cánula de la vía biliar y el uso de las pinzas curvas y tijeras curvas de primavera para extirpar el páncreas hinchado comenzando en el colon descendente y cortando el tejido conectivo como usted tira los intestinos hacia arriba. Continuar para extirpar el páncreas de los intestinos hasta llegar a la vía biliar, a continuación, retire el páncreas del bazo, el estómago y de las vísceras de la cavidad abdominal. Termine de retirar al cortar lejos las suturas. Añadir el páncreas a un tubo de 50 ml que contiene 5 ml de HBSS(P / S). Este tubo debe ser en hielo. </li><li> Repetir el procedimiento anterior para cada animal de hasta cuatro animales. Para obtener resultados óptimos, se disocian sólo cuatro pancreata de una sola vez. Por lo general, mientras que los cuatro primeros están en el baño a 37 ° C, inflamos otro pancreata cuatro. </li></ol> 2. Páncreas La disociación <ol><li> Colocar los tubos de 50 ml que contienen la pancreata en un baño a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Agite suavemente el tubo y compruebe que la disociación del tejido, asegúrese de tejido se deshace fácilmente, entonces remolino de los tubos 12 veces mientras que usted está sosteniendo el tubo con la tapa. </li><li> Añadir no más de 30 ml de HBSS (BSA) (esta puede ser una cantidad menor, dependiendo de cuánto se requiere para equilibrar los tubos para el paso de centrifugación), y se centrifuga a 290 xg durante un minuto. </li><li> Aspirar el sobrenadante cuidadosamente y dejar una pequeña cantidad de sobrenadante (2-3 ml) en la parte inferior a fin de no perturbar el sedimento celular. </li><li> Uso de una jeringa de 30 ml attached a 14G aguja, añadir no más de 10 ml de HBSS (BSA) y se aspira la suspensión arriba y hacia abajo 2 veces. </li><li> Filtrar la mezcla de células a través de un colador de té de plástico en un tubo de 50 ml y enjuague con otro HBSS 10 ml (BSA). </li><li> Centrifugar a 330 xg durante 2 min. </li><li> Decantar el sobrenadante e invertir los tubos para drenar en una toalla de papel absorbente durante 1 min. </li><li> Resuspender cada tubo 10 ml en frío 1100 histopaque. </li><li> Superponer el histopaque con 10 ml de HBSS (BSA) y se centrifuga a 900 xg durante 18 min. </li><li> Retire el completo de 20 ml de sobrenadante utilizando un gran taladro 25 ml pipeta y pasar el sobrenadante a través de un filtro invertido 70 micras. </li><li> Enjuague los islotes en una placa de Petri de 10 cm por 10 medios de comunicación de pipeteo islotes ml a través del filtro mientras la mantiene boca arriba sobre el plato. </li><li> Cultura los islotes en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultivo de tejido hasta que esté listo para la experimentación. Por lo general, los islotes son recogidos a mano y contó antes de experimentation. </li></ol> 3. Los resultados representativos Los rendimientos de los islotes, la morfología y la calidad son los parámetros generales utilizados para juzgar el éxito de aislamiento de islotes. En nuestras manos, los rendimientos de los islotes a partir de la media de C57BL / 6 mouse están en el intervalo de 150-250 islotes que utilizan este protocolo (véase la Tabla 2), y son comparables con los obtenidos mediante optimizada Sigma tipo XI colagenasa. Sin embargo, los rendimientos pueden variar dependiendo de la cepa de ratón utilizada y la edad del ratón. La mayoría de los animales que utilizamos son en el rango de edad de 8-16 semanas Este protocolo ha sido probado en múltiples cepas de ratón, incluyendo C57BL / 6 (180 a 250 islotes / ratón), CD1 (200-300 islotes / ratón), 129 / B6 (200-300 islotes / ratón), BLKS-db/db (120-200 islotes / ratón), NOD (10 semanas de edad, 100-150 islotes / ratón), y NOD-SCID (100-150 islotes / ratón ). Morfología de los islotes típico se muestra en la Figura 2, en la que los islotes tienen una forma redonda a oblonga con un tamaño relativamente uniforme (aunque el tamaño UNIFormity puede variar de una cepa a otra). La Figura 3 muestra el análisis típico de la glucosa estimulada por la secreción de insulina de ratones C57BL / 6 islotes aislados de ratón purificados utilizando TDEs vs Sigma colagenasa tipo XI. Típicamente, una alta calidad de los resultados de la preparación de islotes en una estimulación de la insulina a la glucosa 25 mM que es 6-20 veces mayor que la observada en glucosa 2,5 mM. Otras aplicaciones también puede ser utilizado para probar la calidad de los islotes aislados, y éstos incluyen el uso de técnicas de perifusión, Ca 2 + de imágenes (con Fura2), y la transcripción inversa-PCR, entre otros 11. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Un resumen de la canulación del conducto biliar. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Aspecto típico de islotes C57BL / 6 a las 24 horas aislamiento siguiente. Las imágenes fueron adquiridas en una deverted microscopio con un aumento de 40X. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Glucosa estimulada por la secreción de insulina de ratones C57BL / 6 islotes. En aislamiento hr 24 siguiente, 100 islotes se incubaron en una placa de 12-así durante 1 hora a 37 ° C en solución de Krebs-Ringer tamponada con HEPES solución que contiene 2,5 mM de glucosa. Los islotes se transfirieron entonces a Krebs-Ringer HEPES a 2,5 mM de glucosa por una hora adicional, después de lo cual se recogió el sobrenadante para la medición de la insulina utilizando una de dos sitios inmunoespecífica ligado a enzimas (ELISA) (Crystal Chem). Los islotes mismos posteriormente se transfirieron a solución de Krebs-Ringer tamponada con HEPES que contiene 25 mM de glucosa, y la liberación de insulina en el medio se midió por ELISA después de 1 h de incubación.

<ol>
	<li>Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Liang, Q. -. L., Dai, L. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+of+islet+isolation+without+neutral+protease+supplementation.">Experience of islet isolation without neutral protease supplementation.</a> Islets. 2, 278-282 (2010).</li><li>Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+purified+tissue+dissociation+enzyme+mixtures+for+human+hepatocyte+isolation.">Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li><li>McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+collagen+degradation+assay+to+assess+purified+collagenase+used+in+islet+isolation.">Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation.</a> Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).</li><li>Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+pancreatic+ductal+collagenase+injection+for+isolation+of+pancreatic+islets.">Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets.</a> Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).</li><li>Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+in+islet+yield+from+a+cold-preserved+pancreas+by+pancreatic+ductal+collagenase+distention+at+the+time+of+harvesting.">Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting.</a> Transplantation. 51, 566-570 (1991).</li><li>McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopaque+provides+optimal+mouse+islet+purification+kinetics:+comparison+study+with+Ficoll,+iodixanol+and+dextran.">Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran.</a> Islets. 3, 144-149 (2011).</li><li>Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+enzyme+neutral+protease+assessment.">Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment.</a> Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).</li><li>Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR-{gamma}+Activation+Restores+Islet+Function+in+Diabetic+Mice+Through+Reduction+of+ER+Stress+and+Maintenance+of+Euchromatin+Structure.">PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).</li></ol>

NDS, SAT, y RGM no tienen nada que revelar. AGB autor es empleado por VitaCyte. Autor RCM tiene un interés de propiedad en VitaCyte.

En este protocolo, hemos descrito nuestro procedimiento para la canulación, la perfusión de colagenasa, y la disociación del páncreas murino, con el objetivo de aislar los islotes de Langerhans. Técnicamente, nuestro método, una vez dominado, debe permitir el aislamiento páncreas dentro de 4 min de la eutanasia al animal, y por 1 hr debe resultar en el aislamiento de islotes de un solo animal. La rapidez de la técnica nos permite aislar islotes de hasta 12 ratones en un estiramiento típica, lo que resulta en el aislamiento de hasta 3.000 islotes. A diferencia de otros protocolos que utilizan preparaciones crudas de colagenasa, nuestro protocolo incluye el uso de proteasas purificadas, IC del enzima colagenasa MA y CI proteasa enzima BP. Las variaciones en la consistencia de los preparados TDE que están disponibles comercialmente requiere que cada lote se prueba individualmente y optimizado antes de uso general. Esta variabilidad lote a lote que nos llevó a considerar el uso de puriTDE cados de VitaCyte. Estos TDEs altamente purificados se caracterizan por varios métodos incluyendo el uso de ensayos sensibles de fluorescencia sustrato marcado. El ensayo de fluorescencia CDA es más sensible a las diferentes formas moleculares de la colagenasa que tienen diferentes cinéticas en colágeno nativo degradantes. Históricas ensayos de sustrato péptido proporcionar una evaluación incompleta de la colagenasa. Caracterización de colagenasa por múltiples métodos garantiza una mayor actividad de la enzima entre lotes. Basado en nuestro propio ensayo utilizando una variedad de preparaciones de colagenasa comercialmente disponibles, se encontró que las combinaciones de enzimas purificadas dio reproducibles de lote a lote resultados. Las principales ventajas de usar TDEs altamente purificado y caracterizado rigurosamente en esta solicitud se una vez que la composición de enzima óptima se define, la consistencia del rendimiento de lote a lote está asegurada. Esta consistencia elimina el proceso de trabajo intensivo de capacitación se requiere normalmente muchopara productos de colagenasa crudo o enriquecido. TDEs purificado también permitir modificaciones adicionales de la composición para mejorar el rendimiento y la calidad de los islotes se recuperaron de diferentes cepas de ratón. Reporting composiciones óptimas de enzimas para el aislamiento de islotes a partir de cepas diferentes de ratones pueden ser más eficazmente comunicada. Esto, a su vez, conduce a un uso más productivo de los recursos y una mayor flexibilidad en el diseño experimental. Hay muchos pasos críticos que pueden afectar el resultado de los aislamientos islote utilizando nuestro protocolo. La primera es la necesidad de lograr una inflación efectiva del páncreas durante la perfusión de la preparación enzimática. Es importante comenzar la inflación con fuerza suave de la jeringa, y aumentar la fuerza como se infla el páncreas. Es útil para mover los intestinos y levantar el páncreas durante el inflado de modo que la colagenasa perfunde el órgano entero. Otro paso importante es la fuerza con la que se mueve el afte tubosr incubación a 37 ° C (paso 2,2). Se ha encontrado que la agitación páncreas duro contra la tapa del tubo provoca la fragmentación de los islotes, pero sin ningún tipo de disociación mecánica en este paso, el rendimiento de los islotes puede caer drásticamente. También es imperativo que durante la etapa de disociación con la jeringa (paso 2,5), una fuerza de nivel medio se aplica durante el movimiento hacia arriba y hacia abajo con el émbolo, lo que asegura la disociación adecuada de tejido antes de la etapa de filtración (2,6), donde muy poco tejido debe ser retenido en el filtro colador de té. Finalmente, el último paso a seguir con atención es la aspiración de todo 20 ml de HISTOPAQUE los islotes fraccionadas. Aunque islotes son típicamente en la interfase del histopaque y HBSS, se ha encontrado que se pierde islotes cuando tratamos de eliminar sólo la interfaz, sino que ahora quitar toda la 20 ml usando una pipeta de calibre grande 25 ml. Hemos añadido la filtración a través del filtro de 70 micras invertido (paso 2,11) para eliminar la necesidad de centrifuge los islotes varias veces para lavar el histopaque.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td></td><td> Catálogo # </td></tr><tr><td> HBSS 10 veces </td><td> Life Technologies </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> cualquier </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura 4-0 100 m rollo </td><td> McKesson </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> 14 g contundente extremo de la aguja </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Vannas Sciss Superfine </td><td> Fisher Scientific </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Tijera curva de primavera </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas curvas (2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps curvo (para 90 °) </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2 pulgada aguja </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> 30G 1/2 pulgada aguja </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> PE tubería </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> La colagenasa MA </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP proteasa </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml jeringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml jeringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 micras filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 cm 2 Placa de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Colador de té de plástico </td><td> Cualquier fuente de cocina </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Reactivos y Equipos </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510"><tbody><tr><td> Sigma tipo XI (L010M8618) </td><td> MA (100615) BP (110.329) </td><td> MA (081104) BP (100.823) </td><td> MA (091211) BP (101.109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 2. Islotes rendimientos promedio (± DE) utilizando diferentes lotes TDE * * Los datos representan los rendimientos medios de islotes procedentes de al menos 10 ratones. Los números de lote entre paréntesis </td></tr></tbody></table>

mouse islet of langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease

La interrogación de expresión génica de células beta y la función in vitro se ha desplazado en ángulo recto en los años del estudio de líneas celulares de roedores tumorigénicas al estudio de islotes aislados de roedores. Islotes primarias ofrecen la ventaja de que más fielmente refleja la biología de las vías de señalización intracelular y respuestas secretoras. Considerando que el método de aislamiento de islotes usando tejido de disociación de enzimas (TDE) preparaciones ha sido bien establecido en muchos laboratorios de 1-4, las variaciones en la consistencia de rendimiento y calidad de los islotes de cualquier cepa de roedor dado que limiten el alcance y la viabilidad de los islotes estudios primarios. Estas variaciones ocurren a menudo como resultado de los TDEs crudo parcialmente purificadas utilizadas en el procedimiento de aislamiento de islotes; TDES exhiben frecuentemente de lote a lote variaciones en la actividad y a menudo requieren ajustes en la dosis de enzima utilizada. Un pequeño número de informes han utilizado purificó TDEs para aislamientos de células de roedores 5, 6 </sup&gt;, pero la práctica no está muy extendida a pesar del uso de rutina y las ventajas de purificar TDEs para aislamientos islotes humanos. En colaboración con VitaCyte, LLC (Indianápolis, IN), se desarrolló un islote modificada ratón protocolo de aislamiento basado en el descrito por Gotoh 7, 8, en el que los TDEs se someten a perfusión directamente en el conducto pancreático de ratones, seguido por fraccionamiento tejido crudo a través un gradiente Histopaque 9, y el aislamiento de islotes purificados. Una diferencia significativa en nuestro protocolo es el uso de colagenasa purificada (CI zyme MA) y neutral combinación proteasa (CI zyme BP). La colagenasa se ​​caracteriza por el uso de un 6 colágeno fluorescencia actividad degradante (CDA) de ensayo que utiliza la etiqueta fluorescente fibrillas solubles en piel de ternera como sustrato 6. Este sustrato es más predictiva de la cinética de degradación del colágeno en la matriz del tejido ya que depende de colágeno nativo como el sustrato. La proteasa fue characterized con un ensayo fluorescente sensible cinética 10. Utilizando estos ensayos mejorados junto con el análisis bioquímico más tradicional habilitar el TDE a fabricar más consistente, lo que conduce a un rendimiento mejorado la consistencia entre los lotes. El protocolo descrito en el aquí se ha optimizado para un rendimiento máximo de islotes y morfología de los islotes óptima utilizando ratones C57BL / 6. Durante el desarrollo de este protocolo, varias combinaciones de colagenasa y proteasas neutras se evaluaron a diferentes concentraciones, y la proporción final de colagenasa: proteasa neutra de 35:10 representa el desempeño de enzima comparable a Sigma Tipo XI. Debido a la variabilidad significativa en los rendimientos promedio de los islotes de diferentes cepas de ratas y ratones se ha informado, modificaciones adicionales de la composición TDE debe hacerse para mejorar el rendimiento y la calidad de los islotes se recuperaron de diferentes especies y cepas.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease at JoVE.com

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Una descripción detallada de ratón aislamiento de islotes se describe utilizando la técnica de canulación en pancreático ductal in situ y la perfusión de una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra.

Aislamiento de ratón Islet Langerhans utilizando una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

mouse-islet-langerhans-isolation-using-combination-purified

Research

JoVE Journal

Biology

43.2K vistas.  Indiana University School of Medicine. Una descripción detallada de ratón aislamiento de islotes se describe utilizando la técnica de canulación en pancreático ductal in situ y la perfusión de una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra.

Video: Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Murine Pancreatic Islet Isolation

Páncreas murino aislamiento Islet

Investigación

Biología

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

Aislamiento humanos islote pancreático: Parte I: La digestión y la acumulación de tejido pancreático

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

De páncreas humano de aislamiento Islet: Parte II: Purificación y Cultura de los islotes

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Aislamiento de Miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

La determinación de la proteína de membrana de topología usando fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Aislamiento y cultivo de queratinocitos de ratón primario de piel de ratón neonatal y adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...