Los tripanosomos africanos son responsables de la tripanosomiasis africana humana, o la enfermedad del sueño y la tripanosomiasis africana animal. Los tripanosomas que causan la enfermedad del sueño son los parásitos protistas transmitidos por mosca tsetsé presentes en muchos focos geográficos en el Africa subsahariana. La detección del parásito es esencial para el diagnóstico, el tratamiento y el seguimiento.
Una serología puede dar resultados falsos positivos y, por desgracia, falsos negativos. Para ayudar a la detección en la sangre, los tripanosomas tienen que ser concentrados. Se han utilizado varias técnicas de concentración de parásitos.
El método más sensible es la separación de parásitos de la sangre por una columna de intercambiador de aniones, celulosa DEAE seguida de centrifugación y observación microscópica. En consecuencia, el método de celulosa DEAE es el mejor y sigue siendo hasta la fecha, el método de referencia para visualizar y aislar parásitos de la sangre para el diagnóstico de tripanosomiasis africana humana, especialmente en condiciones de campo. Este método, el diagnóstico más adecuado para la tripanosomiasis africana también proporciona parásitos purificados para investigaciones biológicas inmunológicas, biológicas, bioquímicas, farmacéuticas y moleculares.
Todas las investigaciones conformes a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y el acuerdo se han obtenido de las autoridades francesas y todos los protocolos utilizados han sido aprobados por nuestro comité de ética local. Pesar cada sustancia de acuerdo con el protocolo escrito. Añadir agua destilada y ajustar con precisión al pH 8 con fosfato de dihidrógeno potásico para realizar las siguientes soluciones amortiguadas, tampón concentrado de fosfato solución salina 2X.
Agregue agua destilada y glucosa para glucosa salina tamponada de fosfato. Para 100 mililitros de tampón de elución, agregue 100 unidades por mililitro de penicilina, 100 microgramos por mililitro de estreptomicina y cinco microgramos mililitro de fenol rojo a fosfato tamponado glucosa salina. 100 gramos de celulosa DEAE primero se lava con tres litros de agua destilada y luego se deja asentar.
Las partículas finas se descartan. Los lavados se repiten hasta que el sobrenadante esté despejado. Se añade solución salina tamponada de fosfato concentrado 2X y se agita la celulosa DEAE.
El pH se ajusta a ocho con un fosfato de potasio molar. La celulosa se lava dos veces con agua destilada y dos veces con glucosa salina tamponada con fosfato. La glucosa salina tamponada de celulosa y fosfato DEAE se mezcla en volúmenes iguales.
Aleación descuartada y almacenada a temperatura ambiente o cuatro grados centígrados o a menos 20 grados centígrados para un almacenamiento prolongado. La sangre infectada por el tripanosoma se almacena en nitrógeno líquido. Un cuarto de aleación de un mililitro se descongela a temperatura ambiente.
Los parásitos se recogen cuidadosamente del criotubo con una aguja y una jeringa de un mililitro. La viabilidad de los parásitos descongelados se evalúa mediante la motilidad visualizada por la observación de la microscopía ligera antes de la infección. Los parásitos se inyectan en las cavidades peritoneales de dos ratones, 500 microlitros por ratón.
Cada día después de la infección, la parasitemia se evalúa mediante la recolección de una gota de sangre de la cola con una aguja y se comprueba mediante microscopía. Cuando la parasitemia está en un nivel adecuado, se recoge sangre infectada. Una jeringa de 10 mililitros se apoya en una abrazadera o soporte y se añade un pedazo de papel de filtro precortado.
La celulosa DEAE preparada se vierte en la jeringa hasta el nivel de ocho o nueve mililitros. La columna se lava con el búfer de elución. Dos mililitros de sangre infectada se colocan cuidadosamente en la parte superior de la columna y los tripanosomas se recogen en la columna eluido en un tubo de centrifugación de 50 mililitros.
El búfer de elución se agrega regularmente de acuerdo con el tránsito de los tripanosomas. El tránsito de los tripanosomas a través de la columna se comprueba tomando una gota de columna eluido a intervalos regulares y observando los tripanosomas usando microscopía de luz. Cuando los tripanosomas ya no se observan en el eluido, el tubo cónico se centrifuga a 1.800 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
El sobrenadante se desecha y los tripanosomas en el palet se cuentan con un hemociclomekil. Los tripanosomas recogidos se diluyen posteriormente en el medio requerido para la investigación planificada. Este método, el diagnóstico más adecuado para la tripanosomiasis africana proporciona parásitos purificados para investigaciones biológicas inmunológicas, biológicas, bioquímicas, farmacéuticas y moleculares.
Estos estudios se han desarrollado porque los parásitos purificados con celulosa DEAE se pueden obtener fácilmente en grandes cantidades de huéspedes infectados de forma natural o experimental y, en particular, roedores. La viabilidad del tripanosoma en presencia de agentes farmacéuticos se evalúa mediante observación microscópica. La viabilidad del parásito se asocia con la motilidad y, por lo tanto, se puede comprobar a simple vista bajo un microscopio de luz a 40 veces o un aumento mayor.
La viabilidad del parásito se evalúa midiendo el porcentaje de formas móviles. Las diluciones de los compuestos de prueba se añaden en cada pocódi de una placa de cultivo de tejido de 96 pozos, mientras que los pozos de control son simulados tratados. Cada concentración se evalúa por triplicado.
El número de parásitos viables para cada dilución se compara con el número de parásitos en los pozos de control. Los efectos de Pentamidine, un fármaco de referencia, utilizado en la terapia africana humana de tripanosomiasis se muestra en esta figura. Los co-cultivos de macrófagos de tripanoso permiten la investigación de la interacción del parásito huésped a nivel celular.
En los cultivos de parásitos macrófagos, los tripanosomas celulares adicionales inducen la producción de arginasa macrófago que hidroliza la arginina a la ornitina. La ornitina es el precursor de las poliaminas y el tripanothiona, esenciales para la supervivencia y el crecimiento de los parásitos. Además, el agotamiento de la arginina disminuye la producción de óxido nítrico tripanocida.
Posteriormente, adición de un inhibidor de la arginasa, S-L-cisteína a los co-cultivos reduce dramáticamente el crecimiento del parásito inducido macrófago. La inducción de la arginasa está mediada por factores excretados o secretados por el tripanosoma. Este factor inductor de arginasa se ha identificado como una quinesina de ortina.
La kinesina se une a los receptores de unión a la manosa de lectina de tipo C. La arginasa es inducida y produce ornitina que favorece el crecimiento del parásito. La arginasa no es inducida por la kinesina en macrófagos cultivados con 12,5 manosa milimétrica o en macrófagos de ratones donde se han eliminado los receptores de la manosa macrófago.
Otros ejemplos de biología celular y experimentación bioquímica utilizando tripanosomas purificados de celulosa DAEA se muestran en estudios en los que se han identificado nuevas proteínas citoesqueléticas como BILBO1. BILBO1 es necesario para la biogénesis de estructuras citoesqueléticas importantes y la supervivencia de los parásitos. Por lo tanto, BILBO1 representa un objetivo importante para la intervención en los tripanosomas patógenos.
En esta figura se muestra una imagen que muestra el etiquetado de inmunoflourescencia de una forma de cultivo del torrente sanguíneo, la célula trypanosoma brucei sondeada con un anticuerpo anti-BILBO1. Además, se han descrito el metabolismo de la glucosa y la troonina utilizando tripanosomas purificados de celulosa DEAE y las enzimas implicadas en estos procesos han sido validadas experimentalmente. Una representación esquemática del metabolismo de la glucosa y la troonina en los tripanosomas formados por el torrente sanguíneo se muestra en esta figura.
La purificación de los tripanosomas africanos de la sangre por anión intercambia columnas de celulosa DEAE con mejoras recientes sigue siendo el estándar de oro para la detección de tripanosomas, no sólo en huéspedes naturales con parasitemias bajas en áreas endémicas, sino también para el requisito de parásitos en grandes cantidades para investigaciones experimentales. Las investigaciones han permitido la identificación de moléculas de tripanosoma que desempeñan un papel esencial en la supervivencia y el crecimiento de los parásitos. Los objetivos identificados podrían representar la base de una vacuna futura con antígenos potenciales tanto para humanos como para animales en un único enfoque de salud.
