Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo Klebsiella, como qué genes se utilizan para regular las cápsulas y los virulentos asociados. Las principales ventajas de esta técnica son que proporciona un medio para separar físicamente cepas encapsuladas y no encapsuladas, y también se puede utilizar para comparaciones rápidas entre cepas de producción de cápsulas. Aunque este método fue desarrollado para estudiar la regulación de la cápsula en Klebsiella, también se puede aplicar a diferentes especies bacterianas.
Generalmente los individuos que son nuevos en este método tendrán problemas porque verter los degradados y agregar las celdas a los degradados puede ser bastante difícil. La demostración visual de este método es crítica, ya que mostramos las técnicas que son difíciles de dominar, proporcionando sugerencias y consejos para ayudar al usuario. Para empezar, seleccione una sola colonia de una placa de almacenamiento con un lazo estéril, e inocular 10 mililitros de un caldo apropiado.
Incubar la cultura durante la noche. A continuación, transfiera el cultivo a un tubo de 15 mililitros y centrífuga. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de PBS.
Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante resultante. A continuación, vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de PBS. Para crear las diluciones de gradiente de densidad, combine el medio de degradado de densidad con PBS.
A continuación, aliquot 600 microlitros de cada dilución de gradiente en tubos individuales de dos mililitros. Tome 100 microlitros de células con una pipeta de 200 microlitros, y coloque la punta de la pipeta en el lado del tubo justo debajo del menisco de uno de los muchos gradientes. Aspirar las células bacterianas en el gradiente muy lentamente, teniendo cuidado de no mezclar la interfaz.
Centrifugar los tubos preparados durante 10 minutos a 8.000 g. Después de esto, transfiera los tubos a un bastidor para visualizar la dilución de gradiente mínima necesaria para retener las celdas justo encima de la capa de degradado. En primer lugar, transfiera un mililitro de la dilución de gradiente de densidad más diluida en un tubo de fondo redondo de cinco mililitros.
Usando una jeringa con una aguja de 1,5 pulgadas, tome un mililitro del siguiente gradiente de densidad más concentrado. Coloque la aguja en la parte inferior del tubo e inyecte el contenido de la jeringa muy lentamente. Debe haber una interfaz clara en cada paso del gradiente de densidad.
Si las capas se mezclan, no logrará una separación limpia de sus bacterias. Retire la aguja del gradiente suavemente para no perturbar la interfaz entre las diluciones de gradiente. A continuación, coloque el tubo en un estante.
Agregue cuidadosamente 600 microlitros de las células preparadas a la parte superior del gradiente en el tubo. A continuación, coloque el tubo en un adaptador de tubo y pese el tubo con el adaptador para garantizar el equilibrio. Después de esto, coloque el adaptador de tubo en un rotor de ángulo fijo dentro de una centrífuga de sobremesa y centrifugar el tubo durante 30 minutos a 3.000 g.
Finalmente, después de la centrifugación, retire el tubo con cuidado, colóquelo en un estante y fotografíe los resultados. En este protocolo, se utilizó centrifugación de gradiente de densidad para separar las cepas bacterianas en función de la cantidad de cápsulas que producen. Aunque los resultados exactos dependen de las especies bacterianas, la mayoría de las cepas migrarán a una sola ubicación dentro del gradiente.
La aplicación de este método a una biblioteca mutante bacteriana debe producir una banda mayor por encima del gradiente, una banda menos densa a través de la capa superior del degradado, y una fracción acapsular menor en la parte inferior. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las interfaces de degradado no deben mezclarse y que el degradado no debe contener burbujas de aire. Siguiendo el procedimiento, se deben realizar métodos de validación como el ensayo de ácido urónico o la microscopía para examinar las cantidades de cápsulas.
Esto es especialmente importante cuando se utiliza esta técnica para nuevas cepas. No olvide que trabajar con patógenos de Hazard Group 2 puede ser peligroso. Las precauciones tales como equipos de protección correctiva, adherirse a las evaluaciones de riesgos y la eliminación correcta de los cultivos siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.
