Sería muy útil para la reproducción de rasgos que son técnicamente difíciles o costosos de determinar, como la resistencia a enfermedades, el contenido mineral. Es una técnica bastante simple, rentable y de alto rendimiento. Para comenzar, coloque cuatro discos de hoja en cada pozo de una placa PCR de 96 pozos.
Agregue 50 mililitros de buffer Una solución en cada pozo. Congele la placa en un congelador de menos 80 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, descongele la placa a temperatura ambiente.
Incubar a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Agregue 50 microlitros de tampón B a cada pozo, y mezcle bien por vórtice. Centrifugar la placa durante un minuto a 1.500 veces g.
Recoger el sobrenadante como ADN para PCR. En primer lugar, utilice el sobrenadante de ADN de una plantilla de PCR para optimizar la temperatura de recocido. Agregue reactivos y un microlitro de sobrenadante de ADN en cada pozo de PCR.
Coloque los tubos PCR en un bloque térmico con capacidad de gradiente y ajuste el programa de calentamiento de acuerdo con el manuscrito para determinar la temperatura de recocido óptima para cada fragmento de destino. Realizar electroforesis para el producto PCR en geles de 1% de agarosa para examinar los amplicons. Determine la temperatura de recocido óptima que permite la amplificación específica del fragmento de destino.
Para realizar análisis de HRM, combine reactivos, incluyendo un microlitro de 10 veces tinte de fluorescencia y un microlitro del sobrenadante de ADN en cada pozo de placas compatibles con HRM. En cada placa, incluya una muestra parentesca de tipo salvaje y un control negativo sin ADN. Añadir una gota de aceite mineral a cada pozo para evitar la evaporación.
A continuación, selle la placa con película adhesiva y centrífuga a 1.000 g durante un minuto. Ejecute el PCR utilizando la temperatura de recocido optimizada. Ahora, retire la película adhesiva de la placa e inserte la placa en una máquina HRM.
En el software, seleccione Nueva ejecución en el menú de archivos o pulse el botón Ejecutar en la parte superior de la pantalla. Especifique las temperaturas inicial y final de la fusión de 55 a 95 grados centígrados. Seleccione muestras para el análisis de fusión de alta resolución y excluya muestras similares al control negativo.
Normalice las curvas de fusión para tener la misma fluorescencia inicial y final. Confirme visualmente que los cursores de temperatura máxima mínima y inferior inferior están en una región de las curvas. Mantenga el delta F, diferencia de fluorescencia, nivel en el valor predeterminado de 05.
En la lista Selección de normas, seleccione la variante común frente a la y elija la sensibilidad normal. Seleccione H12 para utilizar el tipo comodín como control. Las muestras con un valor delta F mayor que 05 se consideran que contienen plantas mutantes.
Luego, usando un método CTAB, extrae ADN de cada una de las cuatro plantas de la piscina mutante con la curva de fusión significativamente diferente del tipo salvaje. Después de la cuantificación utilizando un espectrofotómetro, ajuste el ADN con el NanoDrop 2000 a una concentración final de aproximadamente 25 nanogramos por microlitro. Agregue 0,4 microlitros de imprimadores pcR a la muestra de ADN en los tubos de PCR, colóquelos en un ciclor térmico y ajuste el programa para amplificar el fragmento objetivo.
A continuación, envíe los productos de PCR a una empresa para su secuenciación. Después de la secuenciación de Sanger, compare la lesión molecular comparando las secuencias entre la planta M2 y el tipo silvestre. En este estudio, la exploración de HRM y el análisis de plántulas M2 para mutaciones en genes OsLCT1 o SPDT mostraron que la mayoría de las muestras tenían curvas de fusión no significativamente diferentes del tipo salvaje con delta F inferior a 05.
Los mutantes mostraron curvas HRM significativamente diferentes con F delta mayor que 05 a temperaturas de 90 a 92 grados Celsius y 81.5 a 83.5 grados Celsius, respectivamente. El tipo de mutación y la posición en los genes de 4, 560 M2 plántulas fueron confirmadas por los cromatogramas de secuenciación. Se identificó un sitio heterocigoto con una mutación de G a A en 4. 304 pares base de OsLCT1.
Una sola inserción de nucleótido A apareció en los 4. 240 pares base de OsLCT1, y se observó una eliminación de trinucleótidos TTC en la posición de 5, 948 a 5, 950 pares base de SPDT. Optimización del PCR antes del análisis de HRM. El tinte en el gel es un poco dañino.
Recuerde ponerse guantes al ejecutar el gel.
