La investigación sobre la biología de las gotas lipídicas se ha visto obstaculizada por la dificultad de purificación. Además, el estudio del flujo de lípidos celulares requiere la purificación simultánea de múltiples orgánulos, y actualmente no había protocolos simples disponibles. La principal ventaja de esta técnica es hacer más accesible la purificación de gotas lipídicas.
Modificamos un kit disponible comercialmente para aislar simultáneamente gotas de lípidos, retículo endoplasmático y lisosomas de una sola muestra. La acumulación de gotas de lípidos hepáticos predispone a los pacientes obesos y alcohólicos a la enfermedad hepática progresiva. Esto ha cambiado la visión de las gotas de lípidos de los compartimentos de almacenamiento inertes a los orgánulos dinámicos de importancia biológica.
Para empezar, utilice fórceps estériles y tijeras de disección para cortar la piel y las capas musculares del abdomen del ratón eutanizado en el eje posterior-anterior, exponiendo el hígado. Corte los ligamentos que conectan el hígado con el intestino. Usando fórceps, aleja el intestino del hígado, hacia la parte posterior.
Corte el ligamento que conecta el hígado con el diafragma. Luego, corte entre el hígado y la caja torácica dorsal, moviéndose de anterior a posterior, hasta que el hígado se libera. Transfiera el hígado a un plato de Petri frío de cinco centímetros con 10 mililitros de PBS frío 1x, y lave el hígado dos veces en una plataforma mecedora en 10 mililitros de frío 1x PBS durante cinco minutos a cuatro grados celsius.
Después del lavado final, verter el 1x PBS, y utilizar una hoja quirúrgica estéril de tamaño 10 para cortar el hígado en trozos de tres a cinco milímetros dentro del plato. Luego, lave el hígado cortado en cubos dos veces con 10 mililitros de PBS frío 1x durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el 1x PBS, y transferir las piezas hepáticas cortadas en cubos a un homogeneizador de Dounce frío de 45 mililitros, asegurando que todas las piezas estén en la parte inferior.
Agregue siete mililitros de tampón frío de 1x IE. Homogeneizar sobre hielo moviendo la plaga hacia arriba y hacia abajo 20 veces, asegurándose de que la plaga va al fondo del homogeneizador durante cada golpe. Transfiera el homogenenato a un tubo centrífugo frío de 15 mililitros.
Enjuagar el homogeneizador con un mililitro de tampón frío 1x IE, y añadirlo al resto del homogeneato. Para eliminar los núcleos, centrifugar el homogeneizar en una centrífuga de alta capacidad a 1.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Asegúrese de que cualquier lípido recogido en la parte superior del tubo de 15 mililitros se resuspended para evitar la pérdida de LD.
Asegurándose de que el pellet nuclear en la parte inferior del tubo no esté perturbado, transfiera el sobrenadante postnuestrador postnuclear que contiene lípidos a un tubo de centrífuga fresco y frío de 50 mililitros. Transfiera una alícuota de 100 microlitsión del sobrenadante postnuclear a un tubo de microcentrífuga frío de 1,7 mililitros sobre hielo para un análisis de pureza posterior. Para eliminar las mitocondrias, centrifugar la muestra de sobrenadante postnuclear en una centrífuga refrigerada de alta velocidad a 12.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Asegúrese de que cualquier lípido recogido en la parte superior del tubo se resuspenda para evitar la pérdida de LD, y luego transfiera el sobrenadante post-mitocondrial a un tubo ultracentrífugo de 13 mililitros. Transfiera una alícuota de 100 microlitsión del sobrenadante postmitocondrial a un tubo de microcentrífuga frío de 1,7 mililitros sobre hielo para su posterior análisis de pureza. Llene el tubo de ultracentrífuga con sobrenadante post-mitocondrial hasta el borde con tampón frío 1x IE, para evitar que se derrumbe durante la ultracentrifugación.
Equilibre las muestras y luego centrifugar en una ultracentrífuga a 100.000 veces g durante 60 minutos a cuatro grados centígrados. Para eliminar la capa LD, incline el tubo en un ángulo de 45 grados y aspire con una pipeta de vidrio. Después de transferir el pellet a un tubo de microcentrífuga frío de 1,7 mililitros, recoja 100 microlitros del sobrenadante post-ER bajo la capa lipídica para el análisis de pureza.
Para peletizar cualquier escombro celular, centrifugar en una microcentrífuga a máxima velocidad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego, calienta el tubo suavemente con las manos para ayudar a resuspender la capa LD, y transfiere el sobrenadante, incluyendo la capa lipídica, a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Repita estos pasos de lavado, calentando el tubo de dos a tres veces, hasta que el pellet ya no sea visible.
Luego, para lavar el sobrenadante LD sin pellets, agregue 1x PBS a un volumen final de 1,5 mililitros, y centrífuga en una microcentrífuga a máxima velocidad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Utilice una pipeta de vidrio para eliminar un mililitro de 1x PBS, que está debajo de la capa de lípidos, sin alterar la capa lipídica. Repita el lavado de LD de cuatro a cinco veces, hasta que el 1x PBS sea visualmente transparente sin turbidez.
A continuación, utilice una pipeta de vidrio para eliminar la 1x PBS por debajo de la capa lipídica, y utilice la fracción LD pura resultante para el análisis posterior. Cuando se tomaron imágenes representativas de LD fluorescentes y de campo brillante de 20x de los métodos de aislamiento LD del kit de ER y de la sacarosa LD, revelaron niveles similares de partículas, lo que sugiere purezas similares utilizando dos protocolos diferentes. Después de la purificación, los niveles de triglicéridos LD y proteínas se midieron utilizando ensayos colorimétricos, y los datos se normalizaron al peso hepático, mostrando que cuando se normalizó el material de partida, los rendimientos de triglicéridos y proteínas de LD fueron similares utilizando el kit de ER y el método de sacarosa.
Los diámetros de LD se cuantificaron utilizando software de análisis de imágenes, lo que muestra que el aislamiento LD del kit de ER y el aislamiento ld de sacarosa producían LDs de tamaños similares. Para evaluar la pureza de la LD, las muestras fueron analizadas por inmunoblotting, mostrando que los LD derivados del aislamiento LD del kit de ER y el protocolo de gradiente de sacarosa tenían la misma pureza. PLIN2, un marcador LD, se detectó en todas las muestras excepto en el aislamiento de LD del kit de ER PER y el PNS de la sacarosa.
El análisis de pureza de una fracción de ER utilizando inmunoblots muestra que estaban libres del marcador LD PLIN2 pero tenían niveles significativos de la proteína ER SEC61A. También se evaluó la pureza de una fracción lisosomal después de una mayor purificación de los lisosomas utilizando el kit de enriquecimiento de lisosomas. Discovery es actualmente la aplicación más útil de nuestro protocolo.
Realizamos lipidómicas en orgánulos purificados, y mostró que las lipotoxinas se incrementan específicamente en gotas lipídicas en la enfermedad hepática alcohólica.
