Damos las gracias a Bryan Venema y Eric Martinson para construir el aparato electroformation. Este trabajo fue financiado por becas de los Institutos Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (R01GM100718 a SEG) y el Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud (R01EY017564 a SEG).

1. La deposición de lípidos a partir de disolventes orgánicos: Protocolo Clásica <ol><li> Eliminar los lípidos de almacenamiento a -20 ° C o -80 ° C; se calentó a TA Precaución:. Lípidos son extremadamente higroscópicos, y muchos son sensibles al oxígeno. Cubra lípidos en argón seco o nitrógeno gaseoso y en todos los pasos minimizar la exposición al aire. </li><li> Si es necesario, suspender los lípidos en cloroformo o ciclohexano en mg / ml 1-10, tenga en cuenta que las concentraciones indicadas del fabricante suelen nominal sólo PRECAUCIÓN: Use guantes y otros equipos de protección personal cuando se utilizan disolventes orgánicos.. Retire el PPE rápidamente si solvente se derramó sobre ellos, como la mayoría de los materiales están siendo permeable a estos disolventes y sólo proporcionan una protección temporal. </li><li> Limpie ambos lados de dos x 25 mm ITO portaobjetos de vidrio recubiertas con 37,5 etanol </li><li> Mezclar los lípidos para conseguir las proporciones molares deseadas. Por cada 1 cm 2 de área de ITO se desliza a recubrir con el labioid, mix ~ 15-20 g de lípidos. Por ejemplo, si ambos diapositivas 25 x 37,5 mm iban a ser totalmente revestido, que se utilizaría normalmente 30 l de 10 mg / ml de mezcla de lípidos Nota:. Añadir 0,1% en moles Rojo Texas-DPPE para formación de imágenes fluorescentes, y ver a continuación para precauciones acerca colorantes fluorescentes. </li><li> Verifique que el lado recubierto ITO de las placas de vidrio se enfrenta por la medición de la resistencia de la superficie con un polímetro o multímetro. </li><li> Aspirar los lípidos en un resistente a los disolventes jeringa Precaución:. No hay colas o plástico, excepto PTFE, debe ponerse en contacto con el disolvente orgánico. </li><li> Con la aguja de la jeringa sin llegar a tocar la superficie de ITO, aplicar lentamente el lípido mover la aguja hacia atrás y adelante a través de la corredera. Cubra la superficie de la forma más uniforme, en busca de un &quot;arco iris brillo&quot; en la superficie del vidrio. </li><li> Coloque las diapositivas rápidamente bajo &lt;1 Torr (1 mm Hg) de vacío durante 0,5-1 horas para eliminar cualquier traza de disolvente. Suelte vacío con gas inerte. </li><li> Aplique una junta de silicona, con uncapa fina de grasa de vacío de silicona en ambos lados. Deje al menos 5 mm de diapositivas descubierta expuesta en un extremo de la corredera. </li><li> Siga en la sección 4. </li></ol> 2. Preparación de liposomas pequeños para la deshidratación controlada <ol><li> Preparar la mezcla de lípidos que en los pasos 1.1 a 1.4. </li><li> Secar los lípidos usando una corriente de gas argón o nitrógeno en un tubo de cultivo de 10-15 mm de diámetro. Para pequeñas cantidades de lípidos, ≤ 0,5 mg, la película resultante puede ser hidratado directamente después de colocarla bajo vacío durante 0,5-1 horas para eliminar el disolvente residual; continúe en el paso 2.5. Grandes cantidades de lípidos tienden a atrapar disolventes orgánicos en un gel espeso, incluso bajo vacío, y están mejor preparados por liofilización; consulte los pasos 2.3-4. </li><li> Suspender la película lipídica seca en ciclohexano, cubierta con argón y sellado con un tapón, colocar el tubo en un bloque frío y se congelan a -80 ° C durante 1 hora mínimo. </li><li> Coloque el bloque frío y la muestra de lípidos en un sistema de vacíocapaz de alcanzar los 100 mTorr. Aplicar un vacío, sino que va a &quot;pararse&quot; en alrededor de 1 Torr tan sublimes solventes libres. Una vez disolvente se elimina por completo (aproximadamente 1 hora) de vacío caerá por debajo de este nivel. Liberar el vacío con gas inerte y sellar el tubo o hidrato inmediatamente. </li><li> Mientras que los lípidos están bajo vacío, tampón de hidratación degas usando vacío y rociado 15-17. </li><li> Hidratar los lípidos usando tampón desgasificado a una concentración final de 1-10 mg / ml. Permitir que los lípidos para hidratar lentamente. Después de 30 min-1 hora, remolino para romper los grumos que quedan. Espere un 0,5-1 horas más para permitir la hidratación completa. Utilice un osmoticant, tal como sorbitol o sacarosa hasta 200 mM, para prevenir la deshidratación completa en los pasos siguientes. </li><li> Prepare liposomas 100-200 nm de diámetro por extrusión. Ver protocolo de extrusión del fabricante para obtener más información. Tenga en cuenta que el buffer debe tener menos de ~ 25 mM fuerza iónica, o protocolos de voltaje electroformation especiales serán necesarias en la Sección 4. </li></ol> 3.La deposición de lípidos por deshidratación controlada de liposomas pequeños <ol><li> Precaución: Nuestro protocolo requiere lípidos para ser colocados en equilibrio vapor con soluciones salinas saturadas para muchas horas. Recomendamos realizar el protocolo en una atmósfera de gas inerte, con una caja de guantes o recinto similar. </li><li> Precaución: Si la preparación de muestras que contienen proteínas, evitar la deshidratación completa. Hidratar la atmósfera en un lugar cerrado con un vaso de agua tibia, o un humidificador basado en ultrasonidos. Utilice un higrómetro para asegurarse de que existe al menos 30% de humedad relativa. Usa sorbitol o sacarosa en el pequeño tampón de liposoma como una precaución adicional para prevenir la deshidratación total. </li><li> Preparar una solución de sal saturada de humedad relativa apropiada. Humedad del objetivo depende de la osmolaridad de la preparación de vesículas. Para las preparaciones con osmolaridad fisiológica, utilice el 30-45% de humedad relativa, mientras que las preparaciones de vesículas de baja osmolaridad pueden ser adecuadamente deshidratados enequilibrio con 75-90% de humedad relativa (Véase también la Tabla 1). </li><li> Ponga la solución saturada de sal y el exceso de sal en un recipiente herméticamente sellable con un estante interior. Contenedores de alimentos comerciales para yogurt y granola funcionan muy bien. Vuelva a colocar el estante después del llenado, y asegúrese de que el fluido es de 5-10 mm por debajo de la plataforma. </li><li> Limpie portaobjetos recubiertos de ITO como en la Sección 1. Utilice el multímetro para determinar cuál es el lado conductor, y etiquetar el lado no conductor con el nombre de la muestra. </li><li> Engrase ligeramente ambos lados de la (grado USP VI) junta de silicona (s) con uno o múltiples agujeros. </li><li> Coloque el lado conductor desliza en el banco, y aplicar la junta de silicona (s) a cada diapositiva a la que se aplicará lípidos, asegurándose de que hay por lo menos 5 mm de diapositiva expuesta en un extremo a conectar al aparato electroformation. Alise la junta para asegurar un buen sellado. </li><li> Se diluye la preparación de vesículas en un tampón isotónico bajo contenido de sal a ~ 1-2 mg / ml. Nos parece que el aumento de concentrciones producen resultados pobres. </li><li> Aplique grasa a la diapositiva en gotas l 1-10. Las gotas más pequeñas generalmente producen mejores resultados. </li><li> Posicionar el cursor en la plataforma interior por encima de la solución saturada de sal y sellar el recipiente herméticamente. Dejar a temperatura ambiente durante 3 horas a O / N. El recipiente se puede colocar a 4 ° C, pero tenga en cuenta que para algunas sales, la humedad relativa depende fuertemente de la temperatura, y que el frío aumentará el tiempo de equilibración. </li><li> La película resultante puede tener un arco iris ligero brillo a él, pero en cualquier caso debe aparecer casi desecado. Soluciones de partida muy osmóticos pueden ser imposibles de secar completamente a una película de lípidos, lo que no afectará negativamente a los resultados. </li></ol> 4. Electroformation de liposomas gigantes <ol><li> Películas de lípidos, especialmente los formados a partir de liposomas deshidratados, se desencajan fácilmente. Cuidadosamente hidrato de cada pocillo mediante la colocación de un G aguja de la jeringa 27 en el borde de la junta y aplicar lentamente tampón. Buffers puedeincluyen agua, ≤ 200 mM de sacarosa, ≤ 1 M sorbitol y ≤ 5 mM HEPES. Solución de sal de más de 10 mm puede requerir protocolos de voltaje electroformation alternos. Sobrellenado de cada junta y de ~ 10%. </li><li> Nota: una vez que los lípidos se hidratan, proceder rápidamente a través de los pasos restantes, ya que las películas de lípidos comienzan a exfoliar inmediatamente. Rendimiento y tamaño se maximizan si electroformation comienza puntualmente. </li><li> En un movimiento suave, aplique una segunda diapositiva, cara conductora ITO en, en la parte superior de la junta. Asegúrese de tener al menos 5 mm de voladizo fuera del área de empaque y frente a la primera proyección. Presione suavemente para asegurar un buen sellado. </li><li> Limpie los dos voladizos utilizan etanol y verificar que los lados que se enfrenta la junta son conductores con su multímetro. </li><li> La cámara se puede asegurar aún más con parafilm o ligeras pinzas de resorte de tensión si se desea. </li><li> Conectar la cámara de electroformation a una fuente de tensión, asegurando de aluminio o de cobre bares, &quot;EMI Gasket espuma &quot;, o cinta conductora-adhesivo a las superficies conductoras de las dos correderas. Utilizamos espuma junta EMI. Planes para una plantilla y la abrazadera se muestran en la Figura 5. </li><li> Compruebe que no hay cortocircuito eléctrico entre los contactos, y que los contactos se conectan adecuadamente a las superficies de ITO, usando el multímetro. </li><li> Se calienta la cámara de 10 ° C por encima de la temperatura de fusión más alta de cualquiera de los lípidos presentes, por ejemplo, para DPPC, calentar a 52 ° C, como mínimo, 10 ° C por encima de la temperatura de fusión de cadena de 42 ° C. </li><li> Para amortiguadores bajos en sal, aplique una onda sinusoidal 10 Hz, ~ 0.7 V rms para cada hueco milímetros entre las dos superficies revestidas de ITO, de 60 a 90 min. Para buffers de sal, otros protocolos de tensión se deben utilizar (ver referencias). </li></ol> 5. Imágenes y solución de problemas <ol><li> Imagen del liposoma utilizando un microscopio invertido equipado con un cubo filtro para rodamina o colorantes rojos de Texas. El liposoma debe ser esférica,predominantemente unilamelar por ojo, y libre de defectos tales como &quot;cuerdas&quot; que cuelgan del liposoma. </li><li> Si los liposomas son demasiado pequeños, utilizar menos lípidos. </li><li> Si hay muchos defectos o unos liposomas, esto puede ser debido a los lípidos de gel-fase. Considere la posibilidad de elevar la temperatura electroformation. </li><li> Si pocos o ningún liposomas gigantes formaron en absoluto de pequeños liposomas deshidratados, reducir la fuerza osmótica de la memoria intermedia de liposoma, o aumentar la fuerza osmótica de la memoria intermedia de electroformation. Una corriente de entrada de tampón en la solución tampón intersticial concentrada puede provocar la deslaminación de la película de lípido depositada. </li><li> Si el rendimiento de la vesícula, la calidad o el tamaño son pobres, y que incluyen sales o tampones de pH en los electroformation o liposoma buffers, tenga en cuenta los protocolos de voltaje electroformation alternativas. Por ejemplo, Pott, et al. 11, recomendar un protocolo de tres etapas utilizando una onda sinusoidal de 500 Hz, el aumento de la tensión de 50-1,300 Vpp / m durante 30 minutos, manteniendo durante 90 min, lan la disminución de la frecuencia de 50 Hz en 30-60 min. Platino o titanio electrodos pueden ser necesarios en este caso, pero esto no alterarán sustancialmente el protocolo. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Electroformation de liposomas gigantes se ha convertido en una técnica flexible, compatible con diversos lípidos, preparaciones y tampones. El control cuidadoso del proceso de deposición de lípidos es más crítico para el éxito. Hemos presentado herramientas simples para hacer deposición controlada de los lípidos de las pequeñas preparaciones de liposomas un proceso sencillo. La humedad relativa es crítica a la deshidratación adecuada de los liposomas iniciales, y el valor óptimo variará con la concentraci?...

Liposomas gigantes (a menudo llamado vesículas unilamelares gigantes, o Guvs) principalmente se han utilizado para estudiar la física y la química física de bicapas de lípidos, incluyendo los estudios de deformación bicapa, la coexistencia fase lateral (&quot;balsas&quot;), la fusión de membranas, etc 1-4. Tienen una estructura groseramente similar a la célula: cáscara esférica de la membrana que rodea un interior acuoso que puede ser fácilmente hecho diferente que el tampón acuoso circundante. Ellos son, por definición, ≈ 1-100 micras de diámetro, por lo que se pueden obtener imágenes usando una variedad de enfoques de microscopía de luz. Pueden ser hechos tensa el uso de gradientes osmóticos o tensión aplicada mecánicamente, de modo que mientras que generalmente suave, sus propiedades pueden ser manipuladas para un fácil manejo. En particular, el control de la &quot;rigidez&quot; del liposoma hace que sea fácil para formar parches &quot;liposomas adjuntos&quot; o extirpado para electrofisiología. En el pasado, la reconstitución canal de iones se llevó a cabo en gran medida en los lípidos plana bilayers. Ahora, la capacidad para formar parches de liposomas gigantes y utilizar la considerable carcaj de herramientas desarrolladas para electrofisiología convencional (microscopía de fluorescencia, micropipeta de aspiración, la perfusión rápida y control de la temperatura, etc) hace que los liposomas gigantes cada vez más atractivo para los estudios de reconstitución de 5,6. Liposomas gigantes han hecho muchas estrategias. De hecho, los liposomas gigantes se forman espontáneamente por un proceso de hinchamiento cuando una película de lípido seca se rehidrata 4,7,8. El deseo de preparar más rápidamente más grande, liposomas más uniformes llevó a los investigadores a otros enfoques, entre los que electroformation 1,9. Electroformation también se basa en la hidratación de una película lipídica seca, pero acelera el proceso a través de la aplicación de un campo eléctrico oscilante a través de la película de lípido. El campo se aplica a través de dos electrodos, ya sea en alambres de platino o de indio-estaño-óxido (ITO) portaobjetos de vidrio recubiertos, separados por el agua otampón y en la que los lípidos se depositan. Al acelerar la hinchazón de los liposomas, se logra un mayor rendimiento de los liposomas más grandes. Por lo tanto, electroformation ha convertido en el método por defecto para producir liposomas gigantes 4. El mecanismo de electroformation no se entiende completamente, y la mayoría de los protocolos se han desarrollado empíricamente (por ejemplo, 10,11). Sin embargo, podemos aprender un poco acerca de lo que puede esperar teniendo en cuenta la teoría y algunos resultados empíricos. La opinión generalizada es que electroformation se produce por la conducción del flujo electro-osmótico de amortiguación entre las bicapas lipídicas individuales apiladas en la película de lípidos depositados 10,11. Acoplamiento electrostático a las fluctuaciones térmicas de la bicapa lipídica es probable que también involucró 12. Estas hipótesis cualitativamente predicen los límites superiores de la frecuencia del campo eléctrico y la fuerza que se puede utilizar 10,12. En particular, se prevé que las soluciones de alta conductividad ( <eM&gt; es decir, soluciones salinas fisiológicas) reducen las fuerzas electrohidrodinámicos que pueden iniciar la electroformation liposoma 12. Las tasas de flujo electroosmótico generalmente disminuyen con el aumento de la concentración de sal y se alcanzó su punto máximo con frecuencia a una frecuencia de oscilación del campo eléctrico (por ejemplo, si bien en una geometría diferente, Green et al. 13). Por lo tanto, las intensidades de campo más altas y frecuencias más altas son razonables para soluciones de alta conductividad, dentro de los límites 10. Sin embargo, proteínas de la membrana es probable que sean incompatibles con el método habitual de depósito de lípidos en electrodos para el procedimiento electroswelling, a saber, en disolventes orgánicos que luego se evapora para dejar una película delgada de lípido. Hay dos rutas principales en torno a esta dificultad: para incorporar proteínas después de la formación de liposomas gigantes, o adaptar la forma en se depositan los lípidos. Nuestro enfoque se basa en otros 5,11 para depositar los lípidos y reconstitucióntuido proteína de membrana, junto a una suspensión de pequeñas o grandes &quot;proteoliposomas&quot;. Se describe el largo y más difícil proceso de producción de proteoliposomas de proteínas y lípidos purificados en otro lugar (Collins y Gordon, en revisión). A continuación se describe el protocolo en ausencia de cualquier proteína, pero es lo mismo cuando se incorpora proteínas; incluimos los resultados muestran que proteoliposomas contienen el canal iónico TRPV1 se pueden transformar en GUVs y utilizados para patch-clamp electrofisiología. En cualquier enfoque electroformation, la inspección visual de la muestra de lípidos durante el proceso de deposición de lípidos es crítica para el éxito. Nuestro enfoque puede ser relevante más allá de la aplicación especializada para la reconstitución canal de iones. En el tiempo desde que nos desarrollamos este protocolo y, ahora, también se ha demostrado que la forma en que los lípidos se depositan en los electrodos de electroformation afecta a la heterogeneidad de composición de los GUVs resultantes. Baykal-Caglar et. al 14 mostraron que GUVs cuidadosamente formados a partir de liposomas deshidratados tenían un 2,5 veces menor variación en la temperatura de transición miscibilidad de GUVs formados a partir de mezclas de diferentes fosfolípidos y colesterol. Su trabajo indica que los lípidos, y especialmente el colesterol, puede precipitar de la mezcla de lípidos cuando se depositan a partir de disolventes orgánicos, lo que resulta en una variación espacial en la composición de la película de lípido depositada. Esto es especialmente importante para los estudios de comportamiento de fase de lípidos de membrana, pero también puede ser crítico para experimentos cuantitativos en función del canal iónico. Protocolo Baykal-Caglar et al. &#39;S es similar pero no idéntica a la nuestra, y se anima a los lectores a estudiar también. Este protocolo (véase el resumen, la Figura 1) es uno de los muchos que se podría utilizar. En principio electroformation éxito depende de la mezcla de lípidos, la hidratación, la temperatura, otros solutos (especialmente iones), y dePor supuesto, el voltaje y la frecuencia utilizada en la formación. Como electroformation se entiende mejor, esperamos refinar nuestro protocolo más. Por último, a menudo hay una pronunciada curva de aprendizaje en galvanoplastia liposomas gigantes. Sugerimos dominar el protocolo convencional (secciones 1 y 4, y de ser necesario, la Sección 5) antes de aprender a depositar los lípidos a partir de suspensiones de liposomas (Secciones 2-5).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>U1232A or similar</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>117 or 177</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>33210A or similar</td>
			<td>Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 &Omega; load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td>
			<td>CB-90IN-S107 or similar</td>
			<td>Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a></td>
			<td>CNi3233 or similar</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td>
			<td>445815</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td>
			<td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td>
			<td>Use USP Grade VI silicone for its high purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMI gasket</td>
			<td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td>
			<td>4202-PA-51H-01800 or similar</td>
			<td>Distributed by Mouser <a href="http://www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TxR-DHPE</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td>
			<td>850457P or 850457C</td>
			<td>Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034P/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology

La reconstitución de los canales iónicos en las membranas de lípidos definidos químicamente para registro electrofisiológico ha sido una técnica poderosa para identificar y explorar la función de estas importantes proteínas. Sin embargo, las preparaciones clásicas, tales como bicapas planas, limitan las manipulaciones y experimentos que se pueden realizar en el canal reconstituido y su entorno de la membrana. La estructura más como una celda de liposomas gigantes permite experimentos de patch-clamp tradicionales sin sacrificar el control del medio ambiente de lípidos. Electroformation es un medio eficiente para producir liposomas gigantes&gt; 10 micras de diámetro que se basa en la aplicación de una tensión alterna a una, película de lípido ordenada delgada depositada sobre una superficie de electrodo. Sin embargo, ya que el protocolo clásico llama para los lípidos para ser depositados a partir de disolventes orgánicos, no es compatible con proteínas de la membrana menos robustos como canales de iones y debe ser modificado. Recientemente, protocols se han desarrollado para electroform liposomas gigantes de pequeños liposomas parcialmente deshidratadas, que hemos adaptado a los liposomas que contienen proteínas en nuestro laboratorio. Presentamos aquí el fondo, equipo, técnicas, y las trampas de electroformation de liposomas gigantes de pequeñas dispersiones de liposomas. Comenzamos con el protocolo clásico, que debe ser dominado primero antes de intentar los protocolos más desafiantes que siguen. Se demuestra el proceso de deshidratación parcial controlada de pequeños liposomas usando equilibrio vapor con soluciones saturadas de sal. Por último, demostrar el propio proceso de electroformation. Vamos a describir un equipo simple, de bajo costo que se puede hacer en casa para producir liposomas de alta calidad, y describir la inspección visual de la preparación en cada etapa para garantizar los mejores resultados.

En nuestros ejemplos, preparamos liposomas a partir de una mezcla de aproximadamente 55% en moles de POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfocolina), 15% en moles POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfoserina , 30 moles% de colesterol, y 0,1% en moles marcados con Rojo Texas 1,2-dipalmitoil-sn-fosfoetanolamina (TxR-DPPE). Esta composición fue elegido como representante de aproximadamente el ganglio de la raíz dorsal lípidos 18. Observamos que 15% en moles cargada lípidos ...

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Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

La reconstitución de proteínas de membrana funcionales en los liposomas gigantes de composición definida es un enfoque poderoso cuando se combina con la electrofisiología de patch-clamp. Sin embargo, la producción convencional de liposomas gigante puede ser incompatible con la estabilidad de la proteína. Se describen protocolos para producir liposomas gigantes de lípidos puros o pequeños liposomas que contienen canales iónicos.

Preparación de liposomas gigantes de la Imagen y Patch-Clamp Electrofisiología

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

giant-liposome-preparation-for-imaging-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K vistas.  University of Washington. La reconstitución de proteínas de membrana funcionales en los liposomas gigantes de composición definida es un enfoque poderoso cuando se combina con la electrofisiología de patch-clamp. Sin embargo, la producción convencional de liposomas gigante puede ser incompatible con la estabilidad de la proteína. Se describen protocolos para producir liposomas gigantes de lípidos puros o pequeños liposomas que contienen canales iónicos.

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Métodos para grabaciones de parche Capacidad de la pinza del cáliz

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Investigación

Biología

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pulido a presión para la Mejora de pipetas de patch-clamp grabación

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Preparación de la bicapa artificial para experimentos de electrofisiología

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

La médula espinal de Electrofisiología

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Introducción a Solid membrana compatibles Basada Electrofisiología

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...