El lyssavirus es un patógeno zoo-no-tic. Para evaluar la presencia de Lyssavirus en la población taiwanesa de murciélagos, iniciamos un programa de vigilancia. Y identificó con éxito cuatro Lyssavirus de 2016 a 2018.
Este protocolo es una introducción paso a paso a la vigilancia de vi-al Lyssavirus en Taiwán. Esperamos que sea útil para las investigaciones que están interesadas en la vigilancia de vi-al Lyssavirus. Es importante conectar el símbolo de tac-keg correcto.
Un murciélago muerto o moribundo es más adecuado que un murciélago vivo para la vigilancia del lyssavirus. Dependiendo de las regulaciones de biose seguro del país donde se encuentra el laboratorio;realizar los siguientes procedimientos en un laboratorio de nivel de biose seguro adecuado. Y asegúrese de que los investigadores están actualmente calificados y llevan el equipo de protección personal adecuado.
Tras la recolección de murciélagos o cadáveres débiles o enfermos, pida a un ecologista de murciélagos que identifique la especie de murciélago por las características morfológicas del espécimen. Envíe una hoja de información al laboratorio, incluyendo el sitio de recolección, especies, signos clínicos y otros datos relevantes con cada muestra de murciélago. Antes de comenzar la necroscopia, examine todos los orificios externos y fotografíe las características externas de los murciélagos, especialmente la cabeza, las orejas y las alas para la diferenciación de las especies.
Para recoger una muestra de hisopo oral, coloque el murciélago en la recumbencia ventral en una mesa de disección estéril y fije la cabeza con pinzas. Usa un bisturí para cortar la piel a lo largo de la línea media de la zona de la pantorrilla;y tira de la piel hacia los lados laterales, para hacer una incisión en el cráneo a lo largo de la línea media de la zona de la pantorrilla. Abre el cráneo con pinzas para exponer el tejido cerebral y usa las pinzas para separar suavemente el tejido cerebral del tejido nervioso conectado.
Corta la sección transversal del cerebro, incluyendo el tronco cerebral y el cerebelo, y toca ligeramente la superficie cortada del tejido cerebral con diapositivas de vidrio para hacer impresiones de frotis. Presione la diapositiva sobre el tejido de la lente para eliminar el exceso de tejido y fijar las diapositivas de impresión de frotis en menos 20 grados celsius acetona durante 30 minutos. Luego prepara un pequeño pedazo de tejido cerebral fresco, en formalina, para el examen histopatológico.
Y coloque el resto del tejido en emi-em 10 para la extracción de ácido nucleico. A continuación, incitar la piel desde el colector hasta el ano a lo largo de la línea media del cuerpo, y utilizar las pinzas para levantar y separar la piel y subrayar los tejidos musculares;para permitir la recolección de las glándulas salivales, situado cerca del hueso mandibular. Levantando ligeramente el esternón con las pinzas, usa el bisturí para cortar el esternón y la pared abdominal a lo largo de la línea media y corta las clavículas.
Utilice agujas para fijar las jaulas torácicas izquierda y derecha a la mesa de disección, para abrir la cavidad torácica. Y registrar las legiones gruesas y el grado de cambio post mortem. Luego use las pinzas y el bisturí para extraer los tejidos viscerales según corresponda para el análisis descendente planeado.
Para realizar una prueba de anticuerpos fluorescentes directos al final de la fijación, seque las diapositivas de impresión de frotis y seleccione al menos dos anticuerpos antirrábicos conjugados con fluorescencia para el análisis. Filtre un anticuerpo en cada diapositiva a través de un colador de 0,45 micrómetros. E incubar los toboganes durante 30 minutos a 37 grados centígrados en una cámara húmeda.
Al final de la incubación, drenar el exceso de conjugado y lavar los portaobjetos con PBS. A continuación, utilice un pequeño volumen de 10% de glicerol para montar antideslizantes en las diapositivas e imagine las diapositivas mediante microscopía de fluorescencia. Cuando la prueba de anticuerpos fluorescentes o el análisis RT-PCR indiquen positividad, homogeneizar la muestra cerebral en la suspensión del 10% en emi-en 10 y sedimentar los tejidos fleu-rry por centrifugación.
Inocular 200 microlitros de la super-nat-en con tres veces 10 a las 6a células de neuroblastoma de ratón y un mililitro de emi-en 10 durante una hora a 37 grados centígrados y 1%dióxido de carbono. Y transfiera la suspensión de células homogéneas del cerebro a un matraz cuadrado de 25 centímetros, que contiene seis mililitros de emi-en 10 fresco. A un mililitro de suspensión de células homogéneas del cerebro en un portaobjetos de vidrio recubierto de teflón de cuatro pozos, con un diámetro de seis milímetros y coloque la diapositiva a 37 grados centígrados y 1% de dióxido de carbono durante tres a cuatro días.
Después de la fijación con 100%acetona, manche las diapositivas con los mismos dos anticuerpos antirrábicos conjugados con fluorescencia que se utilizan para la prueba de anticuerpos de fluorescencia. Y visualice las diapositivas por microscopía fluorescente para determinar el número de inclusiones intracida-plas-mic. Después de probar y sub-cultivar el cultivo celular inoculado de acuerdo con los protocolos estándar, devolver el cultivo en frío a la incubadora de cultivo celular durante otros tres a cuatro días con recuento repetido del número de células infectadas como se acaba de demostrar hasta que se alcanza una infectividad del 100%.
De enero de 2014 a mayo de 2017, se recogieron 332 cadáveres de murciélagos de 13 especies para su vigilancia. En este análisis representativo de dos casos positivos de murciélagos, la impresión cerebral dio negativo utilizando la prueba de anticuerpos fluorescentes con uno de los anticuerpos antirrábicos conjugados comerciales, fit-sy, mientras que el RT-PCR empleando cada uno de los dos conjuntos de imprimación diferentes, produjo resultados positivos. La sujeción de la secuencia de cona expansión obtenida a la consulta explosiva en la base de datos del banco Gen reveló que la secuencia era similar a los Lyssavirus con identidades inferiores al 79% que soportaban las identidades de los Lyssavirus detectados.
Posteriormente, dos lyssavirus se aislaron con éxito de los dos cerebros, según lo confirmado por la prueba de anticuerpos de fluorescencia y la secuenciación. El paso clave para determinar la positividad del lyssavirus son la prueba de anticuerpos de fluorescencia y el análisis RT-CPR. Se recomienda el uso de dos o más anticuerpos antirrábicos en los conjuntos de imprimación.
Además de Lyssavirus, otros patógenos de murciélagos zoo-no-ical pueden ser monitoreados usando métodos de diagnóstico cerrados. Los datos se pueden utilizar para informar al público sobre cómo evitar el contacto con los murciélagos. Cuanto más podamos estudiar el Lyssavirus del murciélago, más podremos entender su evolución e impacto en la salud pública.
