El RT-PCR anidado ha sido desarrollado para detectar todos los Lyssavirus, incluyendo las 16 especies de Lyssavirus aprobadas por el ICTV y dos nuevas. La validación de este método se ha demostrado mediante el uso de más de 9000 muestras cerebrales animales en 10 años de diagnóstico clínico de la rabia y vigilancia en China. El RT-PCR anidado no sólo puede producir un resultado creíble en muestras de tejido cerebral fresco, sino también en muestras degradadas.
La inundación de este método se puede utilizar para ensayar muestras de fluidos biológicos como el líquido cefalorraquídeo, la saliva y la orina, por lo que este método se puede aplicar en diagnósticos de ultimátum. Con el fin de minimizar la contaminación por arrastre de PCR, es importante preparar controles negativos y positivos Es muy importante tomar medidas. Por ejemplo, para cada preparación de la extracción de ARN, la configuración de PCR y la electroforesis de gel deben funcionar en áreas físicamente separadas.
También se recomienda utilizar cintas espirales en la extracción de ARN y transcripción inversa con el fin de prevenir la contaminación por rabia en la cadena de péptidos. Un manejo adecuado, como preparar a sus agentes sobre hielo, cambiar los guantes regularmente y usar materiales libres de ribonucleasa, evitará la introducción de ribonucleasa y eliminará la degradación del ARN. Para comenzar este procedimiento, extraiga el ARN del tejido sospechoso de rabia, biopsias de piel, saliva, líquido cefalorraquídeo o cultivo celular infectado por RABV como se describe en el protocolo de texto.
Cuando esté listo para proceder, retire los reactivos necesarios del congelador y manténgalos en hielo. Asegúrese de descongelar y vórtice cada reactivo antes de usarlo. Para la transcripción inversa del ARN viral a ADNnr prepare 12 micro litros de mezcla de reacción para cada muestra sobre hielo y un tubo centrífugo de 1,5 mililitros como se describe en la Tabla 1 del protocolo de texto en una sala limpia.
Para tener en cuenta las variaciones de pipeteo, prepare un volumen de mezcla maestra al menos un tamaño de reacción mayor de lo requerido y, a continuación, divida la mezcla de reacción en tubos PCR de 0,2 mililitros. En una estación de trabajo PCR en una sala de plantillas, agregue ocho microlitros de la muestra o uno de los controles a la mezcla de reacción. El control positivo es ARN extraído del cultivo celular infectado con la cepa de rabv fijo CVS11, mientras que el control negativo contiene agua destilada doble libre de arnés.
Mezclar el contenido de cada tubo primero vórtice y luego centrifugando brevemente. Después de esto, cargue los tubos de reacción en un termociclador. Configure y ejecute el programa de síntesis de ADNc como se describe en el protocolo de texto.
En primer lugar, recupere los reactivos necesarios y manténgalos sobre hielo en una sala limpia hasta que estén listos para usar. Cuando esté listo, descongele y vórtice los reactivos. A continuación, prepare 48 microlitros de la primera mezcla de PCR redonda para cada muestra en un tubo centrífuga de 1,5 mililitros como se describe en la Tabla 2 del protocolo de texto y divida la mezcla de reacción en tubos PCR de 0,2 mililitros.
En una estación de trabajo PCR en una sala de plantillas, agregue una muestra de dos microlitros del ADNc en la primera mezcla de PCR redonda. Incluya dos microlitros de CVS11 cDNA como control positivo, y dos microlitros de agua destilada doble como control negativo. A continuación, transfiera los tubos sellados a un termociclador PCR y circule utilizando los parámetros enumerados en la Tabla 3 del protocolo de texto.
Para empezar, prepare 48 microlitros de la mezcla de PCR de segunda ronda para cada muestra en un tubo centrífuga de 1,5 mililitros como se describe en la Tabla 4 del protocolo de texto y divida la mezcla de reacción en tubos PCR de 0,2 mililitros. Agregue dos microlitros del producto PCR de primera ronda a la mezcla de PCR de segunda ronda. Incluya agua destilada doble como control negativo para esta ronda de PCR.
A continuación, realice el termociccling PCR utilizando los parámetros enumerados en la Tabla 3 del protocolo de texto. Primero, añadir 1,5 gramos de agarosa a 100 mililitros de Tris-acetato EDTA y calentarlo en un horno microondas para disolverlo a fondo. A continuación, añadir bromuro de etidio a una concentración final de 0,01%Vierta el gel en el molde y déjelo solidificarlo a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos.
Prepare las muestras de carga mezclando cinco microlitros de cada producto PCR con un microlitro de búfer de carga 6x. Cargue por separado las muestras y el marcador de ADN adecuado en los pozos y ejecute el gel durante aproximadamente 30 a 45 minutos a 120 voltios hasta que la línea de tinte esté aproximadamente entre un 75 y un 80% por el gel. Una vez finalizada la ejecución, apague la alimentación y desconecte los electrodos de la fuente de alimentación.
A continuación, retire cuidadosamente el gel de la caja de gel. Utilice un dispositivo de documentación de gel UV para visualizar y fotografiar los fragmentos de ADN. Caracterice el PCR de transcripción inversa anidado como se describe en el protocolo de texto.
Los resultados de un RT-PCR anidado representativo para detectar 18 especies de Lyssavirus se muestran aquí. Los controles positivos de PCR muestran la banda esperada en 845 pares base en la amplificación de la primera ronda y en 371 pares base para la segunda. No se ve ninguna banda para los controles negativos.
Los 18 Lyssavirus se ven para producir las mismas dos bandas que el control positivo, lo que indica que el RT-PCR anidado detectó los 18 Lyssavirus. Mientras que 16 de los plásmidos tienen amplificación eficiente en dos rondas de PCR, dos de ellos, el virus de Aravan y el virus de Ikoma, se amplifican sólo en la primera o segunda ronda, respectivamente. La sensibilidad del método varía en la detección de diferentes plásmidos de lyssavirus, de valores que van de 2.24 a 2, 240 moléculas por microlitro.
Estas diferencias se pueden atribuir a las discordancias entre los primeros y las plantillas debido a la diversidad de secuencias virales. Una comparación de 9.624 tejidos cerebrales de muestras clínicas que son probados por PCR anidado frente a los probados con FAT muestra que rt-PCR anidado como una sensibilidad del 100% y una especificidad del 99,97%La conformidad entre los dos métodos es 99,07%Diez otros laboratorios de la rabia fueron invitados a realizar la prueba para validar aún más el RT-PCR anidado. Los diez laboratorios obtuvieron resultados anidados rt-PCR que son 100% de acuerdo con el FAT, sin falsos negativos o falsos positivos, lo que indica que el RT-PCR anidado tiene una alta especificidad y reproducibilidad.
RT-PCR ahora es recomendado por la OIE para el uso de tecnologías de rabia. Y nuestro RT-PCR anidado ha sido probado como el estándar nacional de tecnologías de rabia en China en 2018.
